实验三 组织分离法 2

实验二植物病原菌的组织分离实验二植物病原菌的组织分离、培养和纯化一、实验目的通过本次实验学习植物病原菌分离培养及纯化的原理和常用的方法。

二、材料和用具玉米大斑病叶、灰斑病叶、苹果果实轮纹病及霉心病、甘薯黑斑病等材料，5%次氯酸钠溶液（有效氯为5%，见光分解，尤其紫外光，现用现配），75%酒精，剪刀，镊子，无菌水，灭菌培养皿，保鲜膜封口膜，记号笔、解剖刀，75%酒精小喷壶、酒精灯，打火机、、无菌滤纸、酒精棉、培养皿三、分离材料的选择为减少腐生菌的污染，分离所用的病害材料应尽可能新鲜，并且最好在病、健交接处选材取样。

病、健交接处，除材料新鲜，污染的可能性小外，病原菌的生活力强、比较活跃，容易分离成功。

四、植物病原菌的分离方法病原菌分离的方法因材料不同而异，植病实验室最常见的方法有组织分离法和稀释分离法两种。

（一）.组织分离法：这种方法适用于大部分病菌的分离，此法又分为小块组织分离和大块组织分离两种方法。

1、病斑类病原菌的分离（玉米大斑病病、灰斑病及苹果果实轮纹病的分离、甘薯黑斑病）（1）将无菌培养皿、镊子、无菌水、无菌滤纸、75%酒精小喷壶等放入无菌操作台，开紫外灯15分钟。

期间融化培养基备用。

（2）在操作台外，用酒精消毒双手，晾干。

在操作台内再次消毒双手，晾干，将融化并冷却到50℃左右的PDA以无菌操作倒入培养皿8—10ml，在桌面上轻轻摇动，敞开盖，制成平，凝固后待用。

（3）在操作台外，取分离材料，在病、健交界处剪取2—3毫米长的病组织。

（4）在无菌条件下，用5%的次氯酸钠溶液消毒3-5min，（时间长短依病组织不同而异，处理种子约5—10分钟）。

（5）用经过三次火焰灭菌的镊子将消毒的病叶移至无菌水中，漂洗3次，在滤纸上吸干水分，移至PDA平板培养基上，每皿可放均匀放3~4片，使材料与培养基紧密接触。

倒置于25—28℃恒温箱内培养。

（6）3~4天后，待菌落长出后挑取前缘菌丝，回接于PDA培养基上，在25℃温箱中培养，待菌落颜色变深后，在无菌条件下镜检是否是玉米大斑病菌、灰斑病菌、黑斑病菌、轮纹病菌，若仅有这几种病原菌的分生孢子，则说明已获得了纯培养，否则，则需要继续转至斜面培养基上进行纯化，直至获得纯培养。

食用菌菌种分离的方法和操作步骤以及注意事项食用菌菌种分离的方法和操作步骤菌种分离即是进行食用菌菌丝纯化的过程，它是制种工作的重要环节，通俗地讲就是把食用菌菌丝从自然中单独分离出来进行纯培养，从而获得纯食用菌菌丝的过程。

菌种分离是一项重要而又细致的工作，每个环节都必须严格按照无菌操作规程进行。

食用菌的分离方法很多，常用的有组织分离法、孢子分离法和基内菌丝分离法三种。

1.组织分离法组织分离法是将食用菌的部分组织移接到斜面培养基上获得纯培养的方法。

其特点：一是属于无性繁殖，能够保持原有菌种的优良特性，是生产中获得纯菌种的常用方法，且简单易行，取材广泛，菌丝萌发快。

二是组织分离操作简便，又不易带入杂菌，容易获得纯菌种。

但对银耳、黑木耳等胶质菌因其子实体种菌丝极少，如用组织分离培养，则往往不易成功。

1.1子实体分离种菇要选择朵大盖厚、柄短、八九分成熟的优良品种。

切去菇体基部，在超净工作台用75%的酒精棉球进行擦拭菌盖与菌柄两次，进行表面消毒。

接种时，只要将种菇撕开，用消毒后的小刀在菌柄与菌盖的交界处切取一小块组织，再用接种针将组织块放入PDA培养基的试管斜面中间。

置于24℃温度下培养3-5天就可以看到组织块上产生白色绒毛状菌丝，转管扩大即得到菌种。

如香菇、平菇等可以使用此方法。

1.2菌核组织分离茯苓、猪苓、雷丸等食用菌的子实体不易采集。

而常见的是它储藏营养的菌核。

用菌核分离，同样可以获得菌种。

方法是将菌核表面洗净，用酒精消毒，切开菌核，取中间组织一小块，约黄豆大小，接种在PDA培养基斜面上，在24℃下培养，产生菌丝后进行分离纯化。

应注意的是，菌核是储藏器官，大部分是多糖类杂质，只有少量的菌丝，因此挑选的组织块要大一些，如果组织块过小，则不易分离出菌种。

1.3菌索分离法菌索分离常用于蜜环菌分离。

方法是选新鲜的活菌索，用75%酒精棉球将菌索表面消毒后，去掉菌鞘，把白色菌髓部分用无菌剪刀切成小段，接入PDA斜面培养基上，在24℃下培养，有白色菌丝长出且无污染，即表明分离成功。

食用菌实验报告【篇一：食用菌组织分离法实验报告】食用菌母种的制作——组织分离法实验报告实验目的：学习和掌握食用菌的组织分离法；一、实验原理：食用菌的母种一般是采用孢子分离法或组织分离法得到的纯培养物。

利用食用菌子实体内部组织进行分离，是获得母种最简便的方法。

二、实验器材：1. 食用菌：香菇、平菇。

2. 培养基：pda培养基斜面。

3. 仪器或其他用具： 75%酒精棉球、接种针记号笔等。

三、实验方法：1. 选择种菇：选择肥壮菇体作种菇；2. 种菇消毒：取1张菇片，用 70%的酒精轻擦表面进行消毒；3.菇肉接种：将菇片纵向撕开，在每个裂面靠近菇柄与菌盖的交界处取一米粒大小的菇肉组织接于pda试管斜面上； 4. 培养：将试管斜面置于15～30℃下培养；五、注意事项1. 在整个操作过程中都要注意无菌操作，一切用具都要消毒。

2.要等刀片冷却后再切取组织块。

六、实验结果与记录第一次实验：10月16日上午进行接种，两试管都以肥壮的双孢菇为种菇，10月13日观察培养基结果分析：本次实验全班只有一人成功，大部分都被杂菌污染，最有可能的原因就是制作的pda培养杂菌没有菌落产生基本身受到污染，但是又有培养基根本没有菌落产生，那么一方面可以看做是空白对照，得到培养基本身没有问题而是我们操作都有问题，没有做到避免污染，规范的无菌操作，另一方面也有可能是在接种过程，接种针，试验刀酒精灯上灼烧后未冷却直接接触种菇，使待接种的菌块高温致死。

第二次实验：10月30日上午进行接种，记号笔标记的两支试管为双孢菇，标签纸标记的两只试管为香菇进行实验，10月9日观察实验基本成功，试管下端有少部分红棕色杂菌无杂菌，也无目的菌落实验成功，无杂菌，斜面上均为雪白的菌丝结果分析：培养基本身无污染，接种香菇菌块的过程中可能由于接种针和实验刀未完全冷却导致目的菌块高温致死，培养基上无菌落产生。

接种双孢菇菌块过程中基本做到了无菌操作，实验较为成功。

实验感想：本实验原理目的简单，操作过程方法在微生物学中也有接触，但是容易杂菌污染，第一次实验结果几乎全军覆没，几乎所有培养基都受到了污染，第二次实验在总结前一次的基础上，大部分做到了无菌操作，看到了培养基中雪白的菌落。

银耳菌种分离方法获得银耳菌种的方法主要有担孢子弹射分离法、组织分离法和耳木分离法：1、孢子弹射法这是利用新鲜的、成熟的子实体自动弹射出担孢子来获得纯菌种的方法。

取朵大、色白、无病虫害的新鲜银耳作为种耳。

用无菌水漂洗银耳数次，再用无菌纱布或吸水纸，把银耳表面的水分吸干。

因为耳片表面若有薄水层，便会影响银耳担孢子的弹射，并容易污染上杂菌。

再把种耳切一小块，以放入三角瓶或放入试管中不会碰到瓶壁或管壁为度，随后用不锈钢小钩钩住小耳片，迅速悬挂在三角瓶或试管内，同时注意勿使种耳碰到培养基表面，以防污染杂菌，塞上棉塞，然后放在20-25℃条件下，经24小时，从耳片上弹射出来的担孢子，落在光滑的培养基表面上形成一个雾状的孢子印。

此时，在无菌箱或无菌室中，将悬于瓶内的耳片取出，再塞上棉塞，移到20-25℃的室中培养，经2-3天，培养基表面就会出现许多乳白色、糊状的小菌落。

此系银耳的酵母状分生孢子。

当培养基上出现酵母状分生孢子的菌落时，为了防止和减少污染，应尽快地进行提纯，即挑取少许没有杂菌的银耳酵母状分生孢子，移入新的试管中进行培养。

不管银耳担孢子或酵母状分生孢子都不容易萌发成菌丝，所以直接用于生产时有困难，目前已较少采用。

不过，为了获得银耳有性繁殖的后代，必须采用担孢子分离法，并使之萌发成单核菌丝，然后进行配对实验。

2、组织分离法和香菇、平菇不同，银耳组织分离法比较难操作，实用意义也不大。

因为耳片一旦胶质化之后，就不容易再长出菌丝，况且段木种植的或野生的银耳，暴露在外界的生长时间很长，耳片上必定会附着各种杂菌，组织分离时既不容易把附着的杂菌洗掉，又不容易用药品进行表面的灭菌处理，且容易导致银耳和条菌同归于尽。

只有位于树皮和木质部之间的肥厚的耳基比较容易进行组织分离，可以获得银耳的纯菌丝。

不过用耳基分离来的银耳纯菌丝常是鹅黄色的或橙黄色的，不是纯白的，菌丝生长的速度也比较慢，效果也不太理想。

3、耳木分离法利用长了银耳子实体的段木（简称耳木）来进行分离，是目前获得有实用价值的银耳菌种最主要的方法。

第1篇一、实验目的1. 理解组织分离技术的原理和操作步骤。

2. 掌握从动物组织中分离特定细胞类型的方法。

3. 熟悉实验室操作规程，提高实验技能。

二、实验原理组织分离技术是指将组织中的特定细胞类型分离出来，以进行进一步的研究或应用。

该技术基于细胞和组织在形态、功能、生长特性等方面的差异，通过物理或化学方法将细胞从组织中分离出来。

三、实验材料1. 实验动物：小白鼠（体重约200g）2. 实验器材：手术刀、剪刀、镊子、培养皿、移液器、离心机、组织培养箱、显微镜等3. 实验试剂：组织培养基、EDTA、胰蛋白酶、PBS缓冲液等四、实验步骤1. 动物麻醉与取材- 将小白鼠置于实验台上，用麻醉剂进行麻醉。

- 麻醉成功后，用手术刀在小白鼠腹部切开皮肤，暴露腹部器官。

- 取出所需器官，如肝脏或脾脏。

2. 组织处理- 将取出的器官放入含有EDTA的溶液中，以去除组织表面的血液。

- 用剪刀将器官剪成小块，便于后续操作。

3. 细胞分离- 将剪成小块的组织放入含有胰蛋白酶的溶液中，37℃水浴消化30分钟。

- 消化结束后，用移液器吸取消化液，离心去除组织碎片。

- 将离心后的细胞沉淀用PBS缓冲液洗涤两次，以去除未消化的组织碎片和杂质。

4. 细胞培养- 将洗涤后的细胞沉淀重悬于组织培养基中，接种于培养皿中。

- 将培养皿放入组织培养箱中，37℃、5%CO2条件下培养。

5. 观察与记录- 每天观察细胞生长情况，记录细胞形态、生长速度等指标。

- 使用显微镜观察细胞形态，记录细胞形态变化。

五、实验结果1. 在培养过程中，细胞逐渐从组织碎片中分离出来，形成单层细胞。

2. 细胞形态呈现典型的细胞形态，如梭形、圆形等。

3. 细胞生长速度较快，呈指数增长。

六、实验讨论1. 组织分离技术是研究细胞生物学和分子生物学的重要手段，有助于揭示细胞和组织在形态、功能、生长特性等方面的差异。

2. 在实验过程中，操作者应严格遵守实验规程，确保实验结果的准确性。

组织分离法步骤
嘿，咱今儿就来讲讲这组织分离法步骤。

你想想啊，组织分离就像是一场精细的手术，得小心翼翼地进行呢！首先，得准备好合适的材料，这就好比厨师做菜得先有新鲜的食材一样。

然后呢，要选择一个恰到好处的部位，这可不能马虎，就像找宝
藏得找对地方呀！
接下来，开始操作啦！用消过毒的工具轻轻划开，就像是轻轻地揭
开一个神秘的面纱。

这时候可得稳住手，别抖啊，一抖可就容易出岔
子喽。

然后呢，把需要分离的组织慢慢挑出来，这可得有耐心，不能
着急，就跟绣花似的，一针一线都得精细着来。

哎呀，你说这组织分离是不是挺有意思的？这可不是随随便便就能
干好的事儿。

这过程中，每一步都得谨慎，不然一不小心就前功尽弃啦！你看，要是选的部位不对，那不就白折腾啦？或者工具没消毒好，感染了咋办？这可都是大问题呀！
再说说这分离的手法，得轻柔，不能太粗鲁啦，不然组织都被你弄
破啦！就像对待一个刚出生的小宝宝，得轻手轻脚的。

而且啊，得时
刻保持专注，不能分心，不然一不留神就出错咯！
等把组织成功分离出来后，还得好好处理一下，让它能更好地生长、发育。

这就像是给小树苗施肥浇水，让它茁壮成长一样。

总之呢，组织分离法步骤可不能小瞧，每一步都关系到最后的结果。

咱得认真对待，用心去做，才能让这个过程顺顺利利的呀！这可不是
闹着玩的事儿，这是一项需要技术和耐心的工作呢！你说是不是？咱
可不能随随便便就开始，得做好充分的准备，就像战士上战场，得把
武器装备都准备好才行呢！所以啊，大家一定要记住这些步骤，好好
去实践，相信你一定能做好组织分离的！。

实验四食用菌组织分离技术一、实验目的通过实验，熟悉食用菌组织分离原理，掌握通过组织分离技术获得食用菌纯菌种的方法。

二、实验原理组织分离法是指切取食用菌子实体或菌核、菌索的任何一部分组织接种到培养基上培养成纯菌丝体的方法。

组织分离是一种无性繁殖技术。

食用菌子实体或菌核等由双核菌丝体组成，在无菌条件下切取消毒后的组织小块，接种到制备好的斜面培养基上进行适温培养就可以获得纯菌丝体菌种。

三、方法步骤（一）种菇选择选择外观典型、中等大小、菌肉肥厚、无病虫害、七八分成熟（未开伞）的菇作种菇。

（二）种菇消毒切取菇体基部，放入已消毒灭菌好的超净工作台上。

用75%的酒精棉球对菇体进行表面消毒后再用无菌水冲洗2～3次，然后用无菌纱布或滤纸吸干菇体表面水分。

（三）组织块接种用灭菌后的解剖刀或手将消毒后的菇从中间切开或掰开为两半，用无菌镊子夹取菇柄与菇盖交接处绿豆大小的菌肉组织一块，接在斜面培养基的中央。

（四）菌种培养将接种后的斜面培养基放在25℃下培养，经过7～15天，菌丝即可长满斜面。

培养期间要经常检查，及时捡出感染试管。

以下事情找陈老师商量一下：1.本实验用双孢蘑菇或香菇做分离材料，因为目前平菇菇质较差，不适于进行组织分离，让他购买未开伞的双孢蘑菇或香菇。

菇要提前晾两天，以减少水分影响。

2.需要使用两个实验室的超精工作台同时进行实验。

3.给陈老师讲一下每个同学至少接种两只试管，预防感染。

4.75％酒精棉球、无菌水、解刨刀、镊子等工具要准备好。

5.最好做个预备实验，讲解时可以给学生做示范。

6.讲解时把超精工作台的紫外线灯打开，以节约时间。

组织分离法制备食用菌母种（8学时）一、实验的目的和要求1、学会母种培养基的配制方法。

2、掌握组织分离的方法和技术。

3、掌握母种转管继代培养技术。

4、掌握无菌操作技术。

二、实验内容或原理（1）母种培养基配制。

工艺流程：培养基配方培养基的配制灭菌摆斜面（2）菌种分离与培养（本实验以组织分离为例）。

工艺流程：种菇的选择与消毒组织块的切取菌丝培养三、实验材料仪器：超净工作台、高压灭菌锅、电炉、天平、试管、试管架、解剖刀、漏斗、漏斗架、橡皮管、玻璃管、止水、牛角勺、棉花、纱布、酒精灯。

试剂：75%酒精、马铃薯、葡萄糖、琼脂、磷酸二氢钾、硫酸镁、维生素B1等。

四、实验步骤（1）母种培养基配制A、培养基配方：以PDA培养基为例，马铃薯（去皮）200g、葡萄糖20g、琼脂20g、水1000ml。

B、培养基配制：首先将马铃薯去皮、洗净、挖去芽眼、切成薄片，称取200 g，放入铝锅中用1000ml清水加热煮沸，维持20min左右，煮至软而不烂为止。

用双层湿沙布过滤，然后取滤液并补足蒸发损失的水分。

再加入琼脂继续加热，待琼脂溶化后，添加葡萄糖及其它成分，搅拌均匀后准备装管。

C、分装试管：培养基配制后应趁热分装。

装管时勿使管内外壁沾上溶液，以免浸湿棉塞，污染杂菌。

装管后塞上棉塞。

棉塞的大小、松紧度应适宜，以用手提棉塞、试管不脱落为准。

然后每10支度试管扎成一捆，棉塞上方用牛皮纸包好，避免灭菌时被水蒸汽浸湿。

D、灭菌：灭菌前将水加至锅内水位标记高度。

将试管放入锅内，盖上锅盖，对角旋紧锅上螺旋，并闭排气阀，开始加热,当锅内蒸汽大量排出时再继续排汽3-5 min,关闭放气阀.当压力表指针指到0.15 Kg/cm2时(灭菌所需压强)开始计时,继续维持该压强30min。

灭菌结束持压力表指针自然回到”0”位时打开放汽阀,排出锅内剩余蒸汽后,打开锅盖.注意切忌在压力表未到”0”位时就放汽,以免试管内的培养基向上冲浸湿棉塞,造成以后菌种的污染.E、摆斜面：当培养基的温度降到60℃时，将试管斜面放在木棒上，使呈斜面，斜面的长度以占试管长度的1/2为宜。

简述组织分离法的操作过程
组织分离法是一种常用的分离化合物的方法,通常用于从混合物中分离出特定的组分。

以下是组织分离法的操作过程及其简要说明:
1. 预处理:将混合物进行预处理,以使其更易于分离。

这可能包括加热、蒸发、过滤、结晶等操作。

2. 提取:从预处理后的混合物中提取出想要分离的组分。

这可能通过溶解、萃取、蒸馏等方式实现。

3. 选择:选择适当的溶剂或提取剂,以使提取的组分易于溶解或沉淀。

4. 过滤:使用适当的滤器或过滤器,从提取的混合物中分离出所需的组分。

5. 结晶:使用适当的溶剂或提取剂,将分离出的组分结晶出来。

6. 纯化:对结晶进行纯化,以得到高纯度的组分。

这可能包括蒸发、结晶、离心等操作。

组织分离法是一种非常有用的分离方法,可以用于从多种材料中提取出特定的组分。

该方法的优点是可以在较低成本和时间的情况下获得高纯度的化合物。

此外,组织分离法还可以应用于许多其他领域,如生物学、化学、材料科学等。

因此,在实际应用中,组织分离法是一种非常有前途的方法。