实验：组织分离法制备食用菌母种

食用菌菌种分离的方法和操作步骤以及注意事项食用菌菌种分离的方法和操作步骤菌种分离即是进行食用菌菌丝纯化的过程，它是制种工作的重要环节，通俗地讲就是把食用菌菌丝从自然中单独分离出来进行纯培养，从而获得纯食用菌菌丝的过程。

菌种分离是一项重要而又细致的工作，每个环节都必须严格按照无菌操作规程进行。

食用菌的分离方法很多，常用的有组织分离法、孢子分离法和基内菌丝分离法三种。

1.组织分离法组织分离法是将食用菌的部分组织移接到斜面培养基上获得纯培养的方法。

其特点：一是属于无性繁殖，能够保持原有菌种的优良特性，是生产中获得纯菌种的常用方法，且简单易行，取材广泛，菌丝萌发快。

二是组织分离操作简便，又不易带入杂菌，容易获得纯菌种。

但对银耳、黑木耳等胶质菌因其子实体种菌丝极少，如用组织分离培养，则往往不易成功。

1.1子实体分离种菇要选择朵大盖厚、柄短、八九分成熟的优良品种。

切去菇体基部，在超净工作台用75%的酒精棉球进行擦拭菌盖与菌柄两次，进行表面消毒。

接种时，只要将种菇撕开，用消毒后的小刀在菌柄与菌盖的交界处切取一小块组织，再用接种针将组织块放入PDA培养基的试管斜面中间。

置于24℃温度下培养3-5天就可以看到组织块上产生白色绒毛状菌丝，转管扩大即得到菌种。

如香菇、平菇等可以使用此方法。

1.2菌核组织分离茯苓、猪苓、雷丸等食用菌的子实体不易采集。

而常见的是它储藏营养的菌核。

用菌核分离，同样可以获得菌种。

方法是将菌核表面洗净，用酒精消毒，切开菌核，取中间组织一小块，约黄豆大小，接种在PDA培养基斜面上，在24℃下培养，产生菌丝后进行分离纯化。

应注意的是，菌核是储藏器官，大部分是多糖类杂质，只有少量的菌丝，因此挑选的组织块要大一些，如果组织块过小，则不易分离出菌种。

1.3菌索分离法菌索分离常用于蜜环菌分离。

方法是选新鲜的活菌索，用75%酒精棉球将菌索表面消毒后，去掉菌鞘，把白色菌髓部分用无菌剪刀切成小段，接入PDA斜面培养基上，在24℃下培养，有白色菌丝长出且无污染，即表明分离成功。

食用菌栽培实验报告一、实验目的1.学习和掌握食用菌的组织分离法制作食用菌母种；2.掌握食用菌培养基的配置原理；3.通过平菇、秀珍菇、金针菇、鸡腿菇、香菇、榆黄菇的栽培实验，掌握食用菌代料栽培的一般方法和栽培管理技术。

二、实验原理（一）食用菌母种的制作食用菌的母种一般是采用孢子分离法或组织分离法得到的纯培养物。

利用食用菌子实体内部组织进行分离，是获得母种最简便的方法。

（二）平菇、秀珍菇、金针菇、鸡腿菇、香菇、榆黄菇的栽培实验1.食用菌的营养物质食用菌在生活时需要多种多样的营养物质，除水和氧气外，还要碳、氮、钾、磷、硫、镁、铁等大量元素和一些微量元素。

各种食用菌对营养物质的要求各不相同，有的要求不严格，有的要求严格。

[1]碳源：能利用自单糖到纤维素等各种复杂的碳水化合物，如：纤维素、葡萄糖、果糖、蔗糖、麦芽糖、半乳糖、糊精、淀粉、半纤维素、木质素、有机酸、某些醇类等。

[2]氮素：是食用菌合成蛋白质和核酸必不可少的主要原料。

主要有蛋白质、氨基酸、尿素、氨、铵盐和硝酸盐等。

蛋白质必须经蛋白酶分解成氨基酸后才能被吸收；其他小分子氮素化合物菌丝体可直接吸收。

[3]碳氮比:一般认为食用菌在营养生长阶段碳氮比（C/N）以20 : 1为好，而在生殖生长阶段碳氮比以30 : 1～40 : 1为好。

[4]无机盐类，如：磷酸二氢钾、硫酸钙、硫酸镁、氯化钠、硫酸锌、氯化锰等。

这些无机盐中的金属元素磷、钾、镁为最重要，适宜浓度是每升培养基加100—500毫克，而铁、钴、锰、锌、钼等微量元素，每升培养基只需1／4毫克。

这些金属元素在普通水（河水、自来水）中都有，一般培养料不再添加。

[5]各种维生素和生长素，量很微，但必不可少。

[6]栽培原料:广泛采用棉籽壳。

棉籽壳含粗蛋白73％，粗脂肪3.45％，粗纤维36.99％，无氮浸出物73.99%。

其物理性能良好，能使水分和空气的矛盾得到解决，以满足菌丝生长的要求，棉籽壳的表面密布的一层棉纤维，在合适的水分、空气和温度的条件下首先分解，加之壳内残存的棉籽碎屑，也易分解利用；经过试验，1斤干棉籽壳能产1斤左右的鲜平菇，最高达4斤左右。

食用菌的制种（母种的分离和培养）()---食用菌菌种质量的优劣，直接影响到栽培的成败和产量的高低，只有优良的菌种，才能获得优质高产的食用菌。

因此食用菌的制种，是生产中一项极其重要的工艺。

食用菌的菌种按培养阶段和来源的不同，可分母种、原种和栽培种三种。

从食用菌的孢子分离培养或从组织分离培养、基内菌丝分离培养所得到的第一代菌丝体，称为母种。

从母种扩大培养的菌丝体，称为原种。

从原种扩大培养直接用于生产上播种的菌丝体；称为栽培种。

一、母种的分离和培养（一）母种培养基的配制1.母种培养基的种类母种是菌种生产的关键，要求纯度高，不能混生杂菌，同时母种的菌丝体较为纤细，分解培养料的能力较弱。

因此，母种菌丝体需要培养在营养丰富，易被吸收，表面光滑易于鉴别有无杂菌感染的琼脂培养基上。

适合母种菌丝生长的琼脂培养基种类很多，常用的有下列几种：（1）马铃薯——葡萄糖——琼脂培养基马铃薯（去皮） 200克琼脂 20克葡萄糖（或蔗糖） 20克水 1000毫升（2）麦芽汁——葡萄糖——琼脂培养基干麦芽 250克琼脂 15～20克葡萄糖（或蔗糖） 10克水 1000毫升（3）胡萝卜——葡萄糖——琼脂培养基胡萝卜 100克琼脂 20克葡萄糖（或蔗糖） 20克水 1000毫升（4）蘑菇汁——葡萄糖一一琼脂培养基（适用于蘑菇）鲜蘑菇 250克琼脂20克葡萄糖（或蔗糖） 20克水 1000毫升（5）蛋白胨——葡萄糖——琼脂培养基蛋白胨 2克葡萄糖 20克磷酸氢二钾 2克维生素B1（硫胺素） 0.5毫克磷酸二氢钾 0.5克琼脂 18克硫酸镁 0.5克水l000毫升2.母种培养基的制法兹以最常用的马铃薯——葡萄糖——琼脂培养基的制法为例介绍如下：先将马铃薯去皮，洗涤，切成小块，加水1000毫升，煮沸15～20 分钟，取双层纱布过滤，取其滤液，加入琼脂和葡萄糖（或蔗糖），用文火加热使其溶化，最后补足水分，使其容量仍为1000毫升。

趁热分装于试管中，装量约为试管长度的1/5左右，装管时要注意不使培养基沾污试管壁和试管口。

菌种母种的分离培养在自然界里，食用菌都不是单独存在的，而是和许多细菌、放射菌、霉菌等生活在一起的。

所谓菌种分离，就是把这些和食用菌一起生活的杂菌分离出来，通过培养，获得纯的优良菌种。

菌种分母种、原种、栽培种。

母种的分离培养食用菌母种的分离，可分为孢子分离法、组织分离法以及基内菌丝分离等。

1.孢子分离法孢子分离法，是用食用菌的有性孢子或无性孢子萌发成菌丝，培养成菌种的方法。

这种菌种生活力较强，但孢子个体之间有差异，且自然分化现象较严重，变异大，需经出菇试验才能在生产上应用。

（l）单孢分离法：是每次或每支试管只取一个担孢子，让它萌发成菌丝体来获得纯菌种的方法。

蘑菇和草菇用单孢分离得到的菌丝，有结实能力，可采用此法分离生产纯菌种。

单孢分离生产上较少采用，而且技术复杂，一般采用多孢分离法。

（2）多孢分离法：就是把许多孢子接种在同一培养基上，让它们萌发、自由交配来获得食用菌纯菌种的一种方法。

具体操作方法，有以下几种：①种菇孢子弹射法：选择个体健壮、朵形圆正，无病虫害、出菇均匀、高产稳产，适应性强的八九分成熟的种菇，切去大部分，菌柄用无菌水冲洗数遍后再用已灭菌的纱布或脱脂棉、滤纸吸干表面水分。

在接种箱或无菌室内，把种菇的菌褶朝下用铁丝倒挂在玻璃漏斗下面，漏斗倒盖在培养皿上面；上端小孔用棉花塞住。

培养皿放在一个铺有纱布的搪瓷盘上，静置12～20小时，菌褶上的孢子就会散落在培养皿内。

形成一层粉末状孢子印（平菇极淡紫色，蘑菇、草菇为褐色，香菇、金针菇孢子印白色）。

用接种针沾取少量孢子在试管中的琼脂外面或培养皿上划线接种。

待孢子萌发，生成菌落时，选孢子萌发早、长势好的菌落进行试管培养。

还可用孢子采集器收集孢子。

方法是选好种菇后，按上述程序，轻轻掀开玻璃钟罩，将种菇柄朝下插在孢子采收器的钢丝架上，放在培养皿正中央。

随即盖好玻璃罩，用纱布将钟掌周围塞好。

并在纱布上倒少许升汞或无菌水。

移入20℃左右恒温箱培养。

②褶上涂抹法：按无菌操作分离时；应选择成熟的种菇，用接种针直接插入褶片之间，轻轻抹取褶片表面子实体尚未弹射的孢子，再在培养基上划线接种。

实验一、平菇多孢分离育种技术（一）（二）一、实验目的1.了解多孢分离制作母种与组织分离制母种的区别及意义2.掌握平菇多孢分离技术二、实验原理食用菌子实体生长健壮，八成熟时，可散发大量有性孢子，这些孢子在一定条件下，可相互配合，形成双核菌丝体，从而制取母种。

多孢子分离技术是有性繁殖过程。

通过这种方式可以选育出优良菌种，有时还可使退化的菌种复壮。

三、实验步骤（一）制备培养基马铃薯200g，葡萄糖20g，磷酸二氢钾3g，硫酸镁1.5g，VB1微量，琼脂18g，水1000mL，pH 值自然。

按常规方法制试管斜面或三角瓶底面0.5㎝厚的琼脂板。

（二）选择种菇选取生长健壮，八成熟，无病虫害的平菇一朵待用。

（三）收集有性担孢子在无菌条件下，拨出斜面试管口或瓶口的棉塞，在菌褶（猴头菇用菌刺）前端的五分之二处剪取约1.5～2㎝2的菌褶，用镊子挑取一片菌褶，贴附在已灭菌的斜面培养基正上方，迅速塞好棉塞。

于24－26℃条件下恒温培养6-24小时后取出。

（四）孢子萌发培养及菌丝体纯化在酒精灯火焰附近去掉棉塞，用消毒小钩钩出管内的小片菇种，将棉塞连同试管口在火焰上灼烧后，迅速塞上棉塞，于24～26℃恒温培养1周，待孢子萌发，井长成成片菌丝后，切取生长迅速、无杂菌污染的菌丝团转管纯化，待菌丝长满管后便可扩大繁殖备用。

四、作业1.多孢分离育种操作应注意什么？（种菇选择及整个过程无菌操作）2.多孢分离制作母种与组织分离制母种各自有什么优缺点？（多孢子分离制作母种优点：是有性繁殖过程，通过这种方式可以选育出优良菌种。

其缺点操作繁琐，成功率低。

组织分离制母种优点：是无性繁殖过程，操作简单，成功率高。

缺点：多次组织分离制得的菌种易退化。

）。

食用菌母种制作-实验一讲解实验一食用菌母种制作一、目的要求：1、了解母种培养基制作过程，理解灭菌原理；2、掌握母种培养基的制备方法；3、了解无菌操作基本原理，掌握母种的无菌接种培养方法。

4、了解和掌握食用菌组织分离法的方法步骤；5、熟练分离出栽培用菌种。

二、主要仪器设备及药品材料：灭菌锅、超净工作台、酒精灯、电炉、铝锅、漏斗、纱布、菜刀、砧板、烧杯、捆扎绳、硅胶试管塞、试管（18x180mm）、手术刀、镊子、75%酒精、马铃薯、葡萄糖、琼脂、平菇子实体。

三、实验步骤与方法:①培养基的制作1 PDA培养基配方马铃薯200克,葡萄糖20克,琼脂20克,水1000毫升.2. 母种培养基的配制(1)熬制。

马铃薯洗净，挖芽去皮。

称取200克，切成玉米大小颗粒或薄片。

量筒量取1000毫升水，铝锅中煮沸后记时30分钟。

四层纱布过滤于量杯中。

滤液倒入锅中文火加热，加入葡萄糖和琼脂，不断搅拌，直到琼脂溶化。

补足水量至1000毫升。

(2)分装试管。

将熬制的培养基用小漏斗趁热分装。

培养基高度为试管长度的1/5左右，注意避免培养基沾于试管口外。

分装完成后，盖紧硅胶塞。

（3）捆把。

7支试管为一捆，用牛皮纸包裹试管口，用捆扎绳扎紧。

贴上标签，准备灭菌。

（4）灭菌。

注意加足水量和排气，灭菌完成后降压不能太快。

（5）摆斜面，培养基长度约为试管长度的1/2。

斜面试管上覆盖洁净的厚毛巾或几层纱布，防止试管内产生过多的冷凝水。

①菌种分离与培养（1）种菇选择。

选取无杂菌感染，无病虫害，出菇均匀，适应性强的子实体，要求个体健壮，朵大肉厚，外形规整，出菇早，约七八成熟的新鲜子实体。

子实体采收后切去大部分菌柄，放入干净器皿内备用。

（2）母种分离（组织分离法）。

在分离前用75%的酒精棉球擦菇体进行表面消毒，在超净工作台内将子实体撕开，用消毒刀片在菌盖与菌柄交接处的组织上取一小块（绿豆大小）移至试管斜面培养基的适当位置，迅速塞上硅胶塞。

将分离的试管放在室内避光培养7-8天，检查菌丝生长情况。

食用菌原种的筛选与扩繁的实验报告一、实验目的深入理解食用菌母种的含义、重要性和生产上的作用。

学会常用母种培养基的配制方法，掌握母种转管继代培养技术，了解食用菌母种制作的工艺流程和制作母种的基本技能。

二、实验原理食用菌母种是指从大自然首次分离得到的纯菌丝体，多通过孢子分离法、组织分离法和菇木分离法获得纯菌丝体。

因其在试管里培养而成，并且是菌种生产的第一步骤，因此又被称为试管种或一级种。

纯菌丝体在试管斜面上再次扩大繁殖后，则形成再生母种。

它既可以繁殖原种，又适于菌种保藏。

母种的扩大培养是从一支母种转接、培养、扩繁成若千支母种的过程，整个过程期间，须在无菌环境条件下，进行母种菌的转接、培养与扩繁。

三、实验所需1、菌种：平菇、杏鲍菇、金针菇、灰树花等。

2、材料试剂：马铃薯、葡萄糖、琼脂、酵母膏、75%酒精等。

3、仪器用具：天平、电炉、熬制锅、刀砧、小刀、玻棒、纱布、漏斗架、漏斗（套接橡胶管和)、止水夹、试管(18×180mm左右)、棉花、橡皮筋、牛皮纸(报纸)、棉线、铁筐、高压灭菌锅、超净工作台、酒精棉瓶、长柄镊子、接种具（钩、锄等）、酒精灯、火柴、垫架、标签、笔等。

四、实验内容(一)母种培养基配制(1)培养基配方常用培养基PDA：马铃薯(去皮去芽眼)200g、葡萄糖20g、琼脂20g、水1000ml、酵母膏2.5g。

(2)培养基配制将马铃薯去皮洗净、挖去芽眼，称取200g，用刀砧切碎，放入熬制锅(内壁有容积刻度)中，加入清水，电炉加热煮沸后调小火力，维持约20min，煮至软而不烂为止。

用双层湿沙布过滤，得过滤薯液，再向过滤液中加入琼脂20g继续加热，待琼脂溶化后，添加葡萄糖20g及酵母膏2.5g，补足水分至1000ml，搅拌均匀煮沸溶化后准备装管。

(3)分装试管培养基配制后应趁热分装。

装入培养基占试管的1/4-2/5处，装管时控制好止水夹头，对培养基流向、流速、流量进行控制，勿使管内外壁沾上培养液，以免浸湿棉塞，易受杂菌污染。