利用ERIC_PCR和PCR_DGGE技术分析喂服枯草芽孢杆菌肉鸡肠道菌群的多样
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PCR-DGGE技术分析蛋鸡MHC基因对肠道细菌种群结构的影响
PCR-DGGE技术分析蛋鸡MHC基因对肠道细菌种群结构的影响倪学勤;Joshua Gong;Hai Yu;Shayan Sharif;曾东【期刊名称】《中国农业科学》【年(卷),期】2009(042)007【摘要】[目的]研究蛋鸡MHC(Ma jor Histocompatibility CompIex,主要组织相容性复合物)基因对不同周龄和不同部位肠道细菌种群结构的影响.[方法]使用基于16S rDNA的PCR-DGGE技术,结合特异性和共性条带割胶回收DNA进行克隆和测序,对2,4,6和8周龄商品蛋鸡和15I5系蛋鸡嗉囊、十二指肠、空肠、回肠和盲肠内含物细菌群落的结构和多样性进行比较,鉴定8周龄蛋鸡部分特异性和共性群落成员.[结果]商品蛋鸡和15I5系蛋鸡盲肠细菌的多样性最高,其次是回肠和空肠,嗉囊和十二指肠的细菌多样性比较低,且随着蛋鸡周龄增加,各肠段细菌多样性呈上升趋势,MHC基因对细菌多样性无显著影响.DGGE图谱聚类分析表明,蛋鸡MHC基因对4,6周龄肠道细菌的影响最大,对2周龄影响最小;而且MHC基因对消化道前段细菌的影响小于对后段影响.序列分析发现,8周龄商品蛋鸡和15I5系蛋鸡均有大量的三得利乳杆菌(Lactobacillus suntoryeus),是蛋鸡消化道前段的优势细菌;商品蛋鸡空肠、回肠和盲肠中的特异性条带主要是Ochrobactrum spp,索氏梭菌(Clostridium sordellii),超巨巨单胞菌(Megamonas hypermegale)和大量不可培养的细菌;15I5系蛋鸡的特异性条带主要是不可培养的细菌.[结论]蛋鸡MHC基因可影响不同周龄、不同肠段细菌群落的结构.【总页数】8页(P2564-2571)【作者】倪学勤;Joshua Gong;Hai Yu;Shayan Sharif;曾东【作者单位】四川农业大学动物医学院,四川雅安,625014,中国;Food Research Program,Agriculture and Agri-Food Canada,Guelph,Ontario,加拿大rn;Food Research Program,Agriculture and Agri-Food Canada,Guelph,Ontario,加拿大rn;Department of Animal and Poultry Science,University ofGuelph,Guelph,Ontario,加拿大;四川农业大学动物医学院,四川雅安,625014,中国【正文语种】中文【中图分类】S8【相关文献】1.方斑东风螺地膜覆沙池和潮线下养殖系统细菌种群结构的PCR-DGGE分析 [J], 李淑芳;邱德全;张继东;杨世平;邱明生2.海绵共附生细菌种群组成的PCR-DGGE基因指纹分析 [J], 李志勇;何丽明;蒋群3.16S rRNA基因的PCR-DGGE技术分析茶尺蠖幼虫肠道细菌种群结构及多样性[J], 靳亮;王金昌;王洪秀;张贱根;杨罡;靳海燕4.采用 PCR-DGGE 技术分析白蚁肠道内细菌种类 [J], 江涛;葛明伟;李周勉;易锦辉;俞辉;和小明5.采用PCR-DGGE技术分析蛋鸡肠道细菌种群结构及多样性 [J], 倪学勤;Joshua Gong;Hai Yu;曾东;Shayan Sharif;周小秋因版权原因，仅展示原文概要，查看原文内容请购买。
利用ERIC_PCR和PCR_DGGE技术分析喂服枯草芽孢杆菌肉鸡肠道菌群的多样
动物营养学报2010,22(4):9852991Chinese J ournal of Animal Nutritiondoi :10.3969/j.issn.10062267x.2010.04.026利用ERIC 2PCR 和PCR 2D GGE 技术分析喂服枯草芽孢杆菌肉鸡肠道菌群的多样性潘康成 陈正礼 崔恒敏3 冯 兴 盛 琴 赵 爽(四川农业大学动物医学院,动物疫病与人类健康四川省重点实验室,雅安625014)摘 要:本文旨在采用ERIC 2PC R 和PC R 2D G G E 方法研究肉鸡喂服枯草芽孢杆菌后肠道菌群的多样性。
选用15羽28日龄肉鸡,按2mL /kg B W 喂服枯草芽孢杆菌悬液(109C FU/mL ),每天2次,连续3d ,34日龄时,利用ER IC 2PC R 和PC R 2D G G E 方法分析肠道菌群的多样性,并对D G G E 条带进行回收、测序。
结果表明,肉鸡口服枯草芽孢杆菌后各肠段的条带数显著多于对照组(P <0105或P <0101),2种方法检测结果相似,2组之间肠道总菌群相似性为5312%;电泳指纹图谱和统计条带数量分析,PC R 2D G G E 明显优于ERIC 2PC R ;回收条带以乳杆菌属细菌为主。
结果提示,34日龄肉鸡肠道菌群具有一定的稳定性,以乳杆菌为主要菌群,饲喂芽孢杆菌后能提高肉鸡肠道菌群的丰度和种群密度;PC R 2D G G E 检测方法明显优于ERIC 2PC R 。
关键词:枯草芽孢杆菌;肉鸡;肠道菌群;多样性;ERIC 2PC R ;PC R 2D G G E中图分类号:S831 文献标识码:A 文章编号:10062267X (2010)0420985207收稿日期:2010-01-14基金项目:“教育部长江学者和创新团队发展计划”创新团队资助项目(I R T0848)作者简介:潘康成(1971-),男,苗族,贵州榕江人,副教授,博士,主要从事动物微生态学和发酵工程研究。
PCR-DGGE技术评价抗生素诱导的肠道菌群失调
PCR-DGGE技术评价抗生素诱导的肠道菌群失调况炜;唐欢;袁静;张志学;魏泓【期刊名称】《中国微生态学杂志》【年(卷),期】2008(20)5【摘要】目的利用PCR-DGGE技术结合活菌计数评价抗生素引起的肠道菌群失调。
方法SPF级BALB/c雌性小鼠连续4d灌胃头孢曲松溶液125mg/ml,0.4ml/d,运用基于细菌16S DNA的PCR-DGGE技术结合活菌计数分析小鼠肠道菌群变化。
结果活菌计数结果与PCR-DGGE图谱显示,头孢曲松处理3d后小鼠肠道菌群出现严重失调。
结论PCR-DGGE技术可直观而灵敏地显示抗生素处理过程中肠道菌群的动态变化,适用于评价抗生素引起的肠道菌群失调。
【总页数】3页(P425-427)【关键词】PCR-DGGE;肠道菌群失调;头孢曲松;BALB/c小鼠【作者】况炜;唐欢;袁静;张志学;魏泓【作者单位】西南大学生命科学学院;第三军医大学基础部实验动物学教研室【正文语种】中文【中图分类】Q814.2【相关文献】1.变应性气道反应与抗生素诱导的肠道菌群失调关系研究 [J], 刘崇海;杨锡强;刘春花;何云;王莉佳2.王氏保赤丸对抗生素诱导肠道菌群失调小鼠肠道保护作用及肝脏毒性的影响研究[J], 李建婷;邝枣园;宋珊珊;肖珊珊;高智群;郭新峰;罗海燕3.王氏保赤丸对抗生素诱导肠道菌群失调小鼠肠道保护作用及肝脏毒性的影响研究[J], 李建婷;邝枣园;宋珊珊;肖珊珊;高智群;郭新峰;罗海燕4.抗生素诱导肠道菌群失调对肠黏膜屏障和肝脏功能的动态影响 [J], 李娜;赵玉民;陈正元;王碧君;罗霞;王青;何国林;熊天琴;桑传兰5.抗生素诱导的肠道菌群失调加重小鼠肺炎支原体感染 [J], 曾芜薇; 余斓; 丁伟艳; 黄立军; 陈列松; 游晓星; 朱翠明因版权原因，仅展示原文概要，查看原文内容请购买。
PCR_DGGE的原理及在动物肠道菌群分析中的应用
PCR-DGGE的原理及在动物肠道菌群分析中的应用吴高锋1,李文刚2,高卫科1,魏娟1,杨慧敏1,王鑫1(1.河南农业大学,郑州450002; 2.郑州牧专,郑州450011)摘要:肠道菌群是机体常在菌群的重要组成部分,机体的健康和疾病的发生和发展与其多样性及种群的变化有着密切关系。
因此,对肠道菌群进行研究具有重要意义。
变性梯度凝胶电泳(DG GE)主要是基于突变型和野生型核酸序列的不同而导致其变性浓度的差异,利用变性梯度胶进行分离。
它是一种分析微生物群落的有效工具,可以用于研究肠道菌群结构多样性和种群结构的变化。
作者对PCR-D GGE的原理、优缺点及在动物肠道菌群分析中的应用和前景作一简要综述。
关键词:P CR-DGG E;肠道菌群;原理;应用中图分类号:Q503文献标识码:A文章编号:1671-7236(2008)06-0037-03动物肠道中寄生着种类繁多和数量巨大的微生物,它可以促进营养的消化吸收,诱导黏膜免疫保护,甚至调节宿主脂肪的储存等功能,要了解这些过程均需要解析相关的微生物学信息,并且这些微生物主要是由大量细菌组成的。
因此,对肠道菌群结构多样性及种群动态变化进行研究具有至关重要的意义。
在DNA分子技术出现之前,人们对肠道微生物的认识大多数是靠纯培养或靠直接形态观察来获得部分信息。
但是由于微生物形态过于简单,并不能提供太多的信息,而且肠道内微生物很多都是厌氧菌,目前只有少部分微生物能够被分离培养,若以这部分的微生物来代表肠道中复杂的微生物菌群将导致极大的偏差。
Pace等(1986)首先用核酸测序技术研究微生物生态和进化,将分子生物学技术应用于微生态学的研究,开辟了认识微生物的新途径。
分子生物学技术的应用克服了传统方法的限制,使得微生物学者可以从基因水平上估计种的丰度、均度,查明种的变异情况等,从而可以客观上认识微生物的天然的生态状况。
目前用于肠道菌群研究的分子技术有rRNA/rDNA序列分析、RAPD(随机扩增多态性分析)、ERIC-PCR、TGGE(温度梯度凝胶电泳)、PCR-DGGE(denaturing gradient g el e-lectr ophoresis,变性梯度凝胶电泳)等。
PCR-DGGE技术在肉品微生物生态学中的应用
PCR-DGGE技术在肉品微生物生态学中的应用李沛军;孔保华;郑冬梅;王营;杨赫鸿【期刊名称】《食品科学》【年(卷),期】2012(033)019【摘要】人们一直通过传统的纯化、培养方法对肉和肉制品中的微生物进行研究，其操作过程复杂且无法准确描述完整的菌群结构。
聚合酶链式反应-变性梯度凝胶电泳(PCR-DGGE)技术因其具有快速、精确的特点在微生物生态学中得到了广泛应用。
本文主要介绍PCR-DGGE技术的原理，从非发酵肉制品腐败和发酵肉制品成熟两个角度综述其在肉品微生物生态学研究中的应用，并对该技术今后在肉品微生物研究中的应用进行展望。
【总页数】6页(P338-343)【作者】李沛军;孔保华;郑冬梅;王营;杨赫鸿【作者单位】东北农业大学食品学院，黑龙江哈尔滨 150030;东北农业大学食品学院，黑龙江哈尔滨 150030;东北农业大学食品学院，黑龙江哈尔滨 150030;东北农业大学食品学院，黑龙江哈尔滨 150030; 东北农业大学乳品科学教育部重点实验室，黑龙江哈尔滨 150030;东北农业大学食品学院，黑龙江哈尔滨 150030【正文语种】中文【中图分类】TS207.3【相关文献】1.PCR-DGGE技术及其在微生物生态学中的应用 [J], 张宝涛;王立群;伍宁丰;石鹏君2.PCR-DGGE技术在微生物生态学中的应用 [J], 梁英娟;罗湘南;付红霞3.PCR-DGGE技术及其在微生物生态学中的应用 [J], 张宝涛;王立群;伍宁丰;石鹏君4.PCR-DGGE在水产养殖微生物生态学研究中的应用 [J], 林阿乞;陈小红;蔡俊鹏5.PCR-DGGE技术在我国冷水鱼微生态学研究中的应用前景 [J], 穆贵强;卢彤岩;刘红柏;王荻因版权原因，仅展示原文概要，查看原文内容请购买。
《2024年不同前处理方式对枯草芽孢杆菌固态发酵过程的影响及机制研究》范文
《不同前处理方式对枯草芽孢杆菌固态发酵过程的影响及机制研究》篇一一、引言枯草芽孢杆菌作为一种重要的微生物资源，在生物肥料、生物农药以及生物制造等领域具有广泛的应用价值。
近年来，固态发酵技术因其高效、环保等优点在枯草芽孢杆菌的发酵过程中得到了广泛应用。
然而，不同的前处理方式可能会对枯草芽孢杆菌的固态发酵过程产生显著影响。
本文旨在探讨不同前处理方式对枯草芽孢杆菌固态发酵过程的影响及其作用机制。
二、材料与方法2.1 材料实验所用枯草芽孢杆菌菌种购自ATCC。
实验所用的前处理方式包括热处理、酸处理、碱处理和未处理对照组。
2.2 方法（1）前处理：分别对枯草芽孢杆菌进行热处理（60℃、90℃）、酸处理（pH 3.0、pH 5.0）、碱处理（pH 8.0、pH 10.0）以及未处理对照组的预处理。
（2）固态发酵：将经过前处理的枯草芽孢杆菌与固态培养基混合，置于恒温恒湿条件下进行发酵。
（3）检测与分析：采用扫描电子显微镜、PCR-DGGE等手段对发酵过程中的菌体形态、菌群结构等进行观察与检测。
三、不同前处理方式对枯草芽孢杆菌固态发酵过程的影响3.1 对菌体生长的影响实验结果表明，热处理和酸碱处理均能在一定程度上促进枯草芽孢杆菌的生长。
其中，90℃热处理和pH 10.0的碱处理对菌体生长的促进作用最为显著。
然而，过高的温度和过强的酸碱度也会对菌体生长产生抑制作用。
3.2 对发酵产物的影响前处理方式对固态发酵产物的种类和产量有显著影响。
例如，热处理能够提高某些酶的活性，从而促进产物的合成；酸碱处理则可能影响产物的代谢途径，导致产物的种类和比例发生变化。
四、不同前处理方式影响枯草芽孢杆菌固态发酵的机制研究4.1 对菌体细胞膜的影响前处理方式可能改变菌体细胞膜的通透性，影响菌体内外物质的交换，从而影响菌体的生长和代谢。
例如，热处理可能破坏细胞膜的结构，使细胞内的物质更容易释放出来；而酸碱处理可能改变细胞膜的电荷性质，影响其吸附和转运功能。
枯草芽孢杆菌作用机制及其在养殖业中的应用研究进展
枯草芽孢杆菌作用机制及其在养殖业中的应用研究进展王利宾;孙利娜【摘要】枯草芽孢杆菌作为一种广泛存在的益生菌,具有提高动物生产性能、免疫力等重要功能.目前已广泛应用于养殖业中.文章对枯草芽孢杆菌作用机制及在养殖业中的应用进展进行了简要综述.【期刊名称】《饲料博览》【年(卷),期】2015(000)001【总页数】4页(P35-38)【关键词】枯草芽孢杆菌;作用机制;养殖业;进展【作者】王利宾;孙利娜【作者单位】河北省献县农业局,河北沧州062250;河北省献县农业局,河北沧州062250【正文语种】中文【中图分类】S816.7近年来，我国养殖业面临着日益严峻的食品安全问题，传统的抗生素虽然在治疗动物疾病、促进动物生长方面具有巨大的优势，但由于其降解慢、易产生耐药性等缺陷而饱受诟病，在养殖业中受到了越来越多的限制[1]。
中国是世界上最大的抗生素生产国和消费国。
根据2012年美国《科学》杂志报道，中国年产抗生素达21万t，2013年德国科学家发表了一份共同声明，其中提到限制抗生素在兽医兽药中的使用，在这种背景下寻找安全绿色的抗生素替代品成为当前研究的热点[2]。
微生态制剂由于其无残留、无耐药性、显著提高饲料报酬等优点而受到了越来越多研究者的重视，具有广阔的应用前景。
枯草芽孢杆菌作为众多微生态制剂中的一种，由于其兼具提高动物生产性能和防御疾病等多重功能，显示出巨大经济效益。
早在1996年，枯草芽孢杆菌就作为我国农业部正式批准的6种生物兽药之一投入工厂化生产。
本文就枯草芽孢杆菌的作用机理及其在提高动物生产性能中的应用研究进展进行综述。
人类研究和应用枯草芽孢杆菌可以追溯到100多年前，1835年，Ehrenberg发现并命名了枯草芽孢杆菌“Vibrio subtilis”。
1872年，Cohn建立了第一个细菌分类系统，将枯草芽孢杆菌重新命名为“Ba⁃cillus subtilis”，并使用至今[3-4]。
枯草芽孢杆菌作为芽孢杆菌属的一种，呈革兰氏阳性，直径0.6～1.0 μm，长1.5～2.0 μm，芽孢中生，椭圆，孢囊不膨大，琼脂平板上37℃培养36 h形成的菌落为圆形，直径3.0～10.0 mm，淡黄色，中间色深，表面平整不光滑，无光泽，边缘不整齐[5]。
利用ERIC-PCR和PCR-DGGE技术分析喂服枯草芽孢杆菌肉鸡肠道菌群的多样性
草芽孢杆菌后各肠段的条带数显著多于对照组（ Ｐ＜ Ｏ ０ ． ５或 Ｐ＜ Ｏ ０ ） ２种 方 法 检 测 结 果 相 似 ， 之 间 肠 道 总 菌 ．１ ， ２组 群相似性为 ５．％ ； ３ ２ 电泳 指 纹 图谱 和统 计 条 带 数 量 分 析 ， Ｃ — Ｐ Ｒ ＤＧＧＥ 明显 优 于 Ｅ Ｃ Ｐ Ｒ； 收 条 带 以乳 杆 菌 属 ＲＩ — Ｃ 回
动 物肠道 中寄生 着种 类繁 多和数 量 巨大 的微生
鸡 饲 喂枯草 芽孢杆 菌 Ｄ１制剂 后 可显 著增 加 肠 道 中 乳 杆菌 的数 量和极 显 著 减 少 沙 门 氏菌 的数 量 ， 对 但 大肠杆 菌没 有影 响 。Ｔ ｏ等 口 ｅ 报道 肉鸡饲 喂每 ｔ 含 有 １ 。个枯草 芽 孢杆 菌 的饲 粮 ， 肠 道乳 杆 菌和 双 ０ 对 歧 杆菌 的数量 没有 影 响 ， 可 使有 害菌 如 大肠 杆 菌 但 和梭 菌 的 数 量 减 少 １～ ２ ｌ Ｃ Ｕ／ ） 但 利 用 ｇ（ Ｆ ｇ 。 Ｅ Ｃ Ｐ Ｒ 和 Ｐ Ｒ— ＲＩ ． Ｃ Ｃ ＤＧＧＥ分析 动物 饲喂芽 孢杆 菌 之后 肠道 菌群 结构 及 多样 性 未 见 报 道 ， 此本 试 验 因 拟通 过对 肉鸡 喂服 枯 草 芽孢 杆 菌 Ｐ ｂ ２菌 悬 液后 ， ａ０ 采用 Ｅ Ｃ Ｐ Ｒ 和 Ｐ ＲＩ ． Ｃ ＣＲ． ＤＧＧＥ 方 法 研 究 肠 道 菌
微 生 物 培 养 的 分 子 生 物 技 术 为 研 究 肠 道 微 生 态 提 供
化后 ， 接种于 ２０ ０ｍＬ营养 肉汤 中，７℃、６ ／ ｎ ０ ３ １０ｒｍｉ
振 荡 培 养 １ 。５ ０ ０ｒ ｍｉ 、 离 心 ２ ｎ 收 ８ｈ ０ ／ ｎ ４ｏ Ｃ ０ｍｉ ，
了简便 而 快 捷 的 方 法 ］ 其 中变 性 梯 度 凝 胶 电泳 ， （ ＤＧＧＥ 技术 近年来 逐渐 被应 用于检 测猪 、 、 和 ） 牛 羊
动 物肠道 中寄生 着种 类繁 多和数 量 巨大 的微生
鸡 饲 喂枯草 芽孢杆 菌 Ｄ１制剂 后 可显 著增 加 肠 道 中 乳 杆菌 的数 量和极 显 著 减 少 沙 门 氏菌 的数 量 ， 对 但 大肠杆 菌没 有影 响 。Ｔ ｏ等 口 ｅ 报道 肉鸡饲 喂每 ｔ 含 有 １ 。个枯草 芽 孢杆 菌 的饲 粮 ， 肠 道乳 杆 菌和 双 ０ 对 歧 杆菌 的数量 没有 影 响 ， 可 使有 害菌 如 大肠 杆 菌 但 和梭 菌 的 数 量 减 少 １～ ２ ｌ Ｃ Ｕ／ ） 但 利 用 ｇ（ Ｆ ｇ 。 Ｅ Ｃ Ｐ Ｒ 和 Ｐ Ｒ— ＲＩ ． Ｃ Ｃ ＤＧＧＥ分析 动物 饲喂芽 孢杆 菌 之后 肠道 菌群 结构 及 多样 性 未 见 报 道 ， 此本 试 验 因 拟通 过对 肉鸡 喂服 枯 草 芽孢 杆 菌 Ｐ ｂ ２菌 悬 液后 ， ａ０ 采用 Ｅ Ｃ Ｐ Ｒ 和 Ｐ ＲＩ ． Ｃ ＣＲ． ＤＧＧＥ 方 法 研 究 肠 道 菌
微 生 物 培 养 的 分 子 生 物 技 术 为 研 究 肠 道 微 生 态 提 供
化后 ， 接种于 ２０ ０ｍＬ营养 肉汤 中，７℃、６ ／ ｎ ０ ３ １０ｒｍｉ
振 荡 培 养 １ 。５ ０ ０ｒ ｍｉ 、 离 心 ２ ｎ 收 ８ｈ ０ ／ ｎ ４ｏ Ｃ ０ｍｉ ，
了简便 而 快 捷 的 方 法 ］ 其 中变 性 梯 度 凝 胶 电泳 ， （ ＤＧＧＥ 技术 近年来 逐渐 被应 用于检 测猪 、 、 和 ） 牛 羊
重组枯草芽孢杆菌SE1对肉鸡生长性能、肠道消化酶活性和菌群的影响
重组枯草芽孢杆菌SE1对肉鸡生长性能、肠道消化酶活性和菌群的影响李佳骏;王振华;胡正茂;唐慧琴;谷笑笑;廖成斌;潘康成【期刊名称】《动物营养学报》【年(卷),期】2018(030)004【摘要】本试验旨在研究芽孢表面展示鸡白痢沙门氏菌OmpC重组枯草芽孢杆菌SE1对肉鸡生长性能、肠道消化酶活性和菌群的影响.选择7日龄肉鸡120只,随机分为3组,每组4个重复,每个重复10只鸡.A组(对照组)饲喂基础饲粮,B组和C组分别在基础饲粮中添加0.1%(1.0×106CFU/g)枯草芽孢杆菌168制剂和0.1%(1.0×106CFU/g)重组枯草芽孢杆菌SE1制剂,试验期35 d.结果显示:1)与A 组相比,C组肉鸡的终末体重和平均增重分别增加6.14%和6.76%(P>0.05),料重比降低8.21%(P>0.05).2)28、42日龄时,B组和C组肉鸡的空肠脂肪酶和回肠蛋白酶活性显著高于A组(P<0.05);B组和C组肉鸡的肠道消化酶活性无显著差异(P>0.05).3)28、42日龄时,B组和C组肉鸡的回肠、盲肠大肠杆菌数量显著低于A 组(P<0.05),盲肠乳杆菌数量显著高于A组(P<0.05).16S rRNA V3区聚合酶链式反应-变性梯度凝胶电泳(PCR?DGGE)结果显示,B组和C组肉鸡的盲肠菌群丰富度、均匀度和香农-维纳指数均显著高于A组(P<0.05);C组肉鸡盲肠菌群的相似性在28、42日龄时分别比A组高26.8%和15.6%,C组和B组之间无显著差异(P>0.05).结果表明,重组枯草芽孢杆菌SE1具有与枯草芽孢杆菌168相同的效果,能有效促进肉鸡生长,提高肠道脂肪酶和蛋白酶活性,调节肉鸡肠道菌群,提高肠道菌群稳定性和多样性.%This experiment was conducted to investigate the effects of recombinant Bacillus subtilis SE1 spore surface display ofSalmonella pullorum OmpC on growth performance,intestinal digestive enzyme activities and microflora of broilers. One hundred and twenty seven?day?old broilers were randomly divided into 3 groups with 4 replicates per group and 10 broilers per replicate. Broilers in groupA(control group)were fed a basal diet, and the others in groups B and C were fed the basal diets supplemented with 0.1%(1.0×106CFU/g) Bacillus subtilis 168 and 0.1%(1.0×106CFU/g)recombinant Bacillus subtilisSE1,respectively. The experi?ment lasted for 35 days. The results showed as follows:1)compared with group A,the final weight and aver?age gain of broilers in group C increased by 6.14% and 6.76%(P>0.05), respectively,and ratio of feed to gain in group C decreased by 8.21%(P>0.05).2)The activities of jejunal lipase and ileal protease of broilers in groups B and C were significantly higher than those in group A at 28 and 42 days ofage(P<0.05), and there were no significant differences on intestinal digestive enzyme activities of broilers between group B and groupC(P>0.05). 3)At 28 and 42 days of age,the number of Escherichia coli in ileum and cecum of broil?ers in groups B and C was significantly lowerthan that in group A(P<0.05),and the number of Lactobacillus in cecum in groups B and C was significantly higher than that in group A(P<0.05). The results of polymerase chain reaction?denatured gradient gel electrophoresis(PCR?DGGE)of 16S rRNA V3 zone showed that the richness, evenness and Shannon?Wiener index of caecal microflora of broilers in groups B and C were signifi?cantly higher than those in group A(P<0.05), the similarity of caecal microflora in group C increased by 26.8% and 15.6%compared with group A at 28 and 42 days of age,respectively,and there was no significant difference between group C and group B(P>0.05). It is concluded that recombinant Bacillus subtilis SE1 have the same effect as Bacillus subtilis 168,can effectively promote growth of broilers,improve the activities of in?testinal lipase and protease,regulate the intestinal microflora of broilers,and improve the stability and diversity of intestinal microflora.【总页数】10页(P1582-1591)【作者】李佳骏;王振华;胡正茂;唐慧琴;谷笑笑;廖成斌;潘康成【作者单位】四川农业大学动物医学院动物微生态工程研究中心,成都611130;成都农业科技职业学院,成都611130;成都中牧生物药业有限公司,成都610000;四川农业大学动物医学院动物微生态工程研究中心,成都611130;四川农业大学动物医学院动物微生态工程研究中心,成都611130;成都中牧生物药业有限公司,成都610000;四川农业大学动物医学院动物微生态工程研究中心,成都611130【正文语种】中文【中图分类】S831【相关文献】1.芽孢杆菌在肉鸡肠道内的分布及对肠道菌群、消化酶活性的影响 [J], 汤江武;孙宏;姚晓红;吴逸飞;王新2.J-11菌剂对肉鸡肠道消化酶活性及生长性能的影响 [J], 顾雅君;张瑞英;李宾;王瑛;王世英3.枯草芽孢杆菌高耐菌株泡腾制剂对肉鸡生长性能、盲肠肠道菌群的影响 [J], 张晓云;周同茂;段宝轩;李玉佳;冯欣璞;冯英珍;许灿;王钊;李荣彦4.2种中药成分对肉鸡生产性能、营养物质消化利用率、肠道消化酶活性和肠道菌群的影响 [J], 孙耀贵;张向杰;程佳;王俊东5.枯草芽孢杆菌对断奶驴驹生长性能、营养物质表观消化率及肠道菌群的影响 [J], 张婷;冯培祥;王卓;刘晓颖;司华哲;姜桂苗;赵付伟;李光玉;刘晗璐因版权原因，仅展示原文概要，查看原文内容请购买。
ERIC—PCR及在肠道菌群分析中的应用
因 此 认 为 Ｅ Ｃ—Ｐ Ｒ 是 一 种 半 随 机 性 质 的 Ｐ Ｒ ＲＩ Ｃ Ｃ 。
能 广 泛 用 于肠 道 微 生 物 动 态 分 析 、 生 物 分 类 鉴 定 等 方 面 的 微
研究。
１ Ｒ Ｃ—Ｐ Ｒ 的 原 理 ，Ｅ Ｉ Ｃ １ １ ＥＲＩ 的 发 现 及 结 构 特 征 ． Ｃ
ＥＩ Ｒ Ｃ即 肠 杆 菌 基 因 间 重 复 序 列 （ｎｅ ｂｃ ｒ ｌ ｅｅｉ ｅｔｒ ａｔ ｉ ｐｒ ｏ ｅ ａｒ ． ｔ ｅｎｅｇｎｃ∞ｎｅｓｓＥ Ｃ ， 先 由 Ｓ ａｐｅ 等 … 于 １ ９ ｉ ｔｒｅｉ ｖｉ ｓｎｕ ，ＲＩ ）首 ｈｒｉ ｓ ９０ 年 在 Ｅ ｃｉ 发 现 ， 名 为 “ 因 间 重 复 单 位 ” ｉｔ ｇｎ． ．ｏ ｌ中 命 基 （ ｅ ｅｉ ｎｒ ｃ ｐａ ｕｉ， ｕ） 后 发 现该 序列 主 要 存 在 于 肠 杆 菌 科 ， 称 ｒ ｅｔ ｎ Ｉ ｅ ｔＲ ， 故 之为 Ｅ Ｉ Ｒ Ｃ。该 序列 具 有 不 完 整 的 反 向 重 复 性 ， 级 结 构 可 二 以形成 稳 定 的 茎 环 结 构 ， 布 在 整 个 基 因 组 中 ， 位 于 基 因 散 定 组 内可 转 录 的非 编 码 区 域 或 者 与 转 录 有 关 的 区 域 。该 序 列
高 的 灵 敏 度 ， 混 合 菌 中 ， 一 种 菌 占总 菌 量 的 ０ ５ 在 当 ． ％时 ， 即
可 被 该 方 法 准 确 地 检 测 出来 。 目前 关 于 Ｅ Ｉ Ｒ Ｃ—Ｐ Ｒ 的 扩 增 产 物 还 存 在 争 议 。 Ｖ ｒ ． Ｃ ｅａ ｓ
１ ｉ等 【 认 为 扩 增 产 物应 该 是 两 个 Ｅ Ｉ ｏｃ ４ ｖ Ｒ Ｃ之 间 的 序 列 片 段 ，
Ｄ Ａ 没有 严格 的 要 求 ， 养 的 细 胞 或 经 煮 沸 处 理 的 细 胞 均 Ｎ 培 可 作 为 模 板 ， 得 到 的指 纹 图 谱 比 Ｒ Ｐ 所 Ａ Ｄ—Ｐ Ｒ指 纹 图谱 具 Ｃ
能 广 泛 用 于肠 道 微 生 物 动 态 分 析 、 生 物 分 类 鉴 定 等 方 面 的 微
研究。
１ Ｒ Ｃ—Ｐ Ｒ 的 原 理 ，Ｅ Ｉ Ｃ １ １ ＥＲＩ 的 发 现 及 结 构 特 征 ． Ｃ
ＥＩ Ｒ Ｃ即 肠 杆 菌 基 因 间 重 复 序 列 （ｎｅ ｂｃ ｒ ｌ ｅｅｉ ｅｔｒ ａｔ ｉ ｐｒ ｏ ｅ ａｒ ． ｔ ｅｎｅｇｎｃ∞ｎｅｓｓＥ Ｃ ， 先 由 Ｓ ａｐｅ 等 … 于 １ ９ ｉ ｔｒｅｉ ｖｉ ｓｎｕ ，ＲＩ ）首 ｈｒｉ ｓ ９０ 年 在 Ｅ ｃｉ 发 现 ， 名 为 “ 因 间 重 复 单 位 ” ｉｔ ｇｎ． ．ｏ ｌ中 命 基 （ ｅ ｅｉ ｎｒ ｃ ｐａ ｕｉ， ｕ） 后 发 现该 序列 主 要 存 在 于 肠 杆 菌 科 ， 称 ｒ ｅｔ ｎ Ｉ ｅ ｔＲ ， 故 之为 Ｅ Ｉ Ｒ Ｃ。该 序列 具 有 不 完 整 的 反 向 重 复 性 ， 级 结 构 可 二 以形成 稳 定 的 茎 环 结 构 ， 布 在 整 个 基 因 组 中 ， 位 于 基 因 散 定 组 内可 转 录 的非 编 码 区 域 或 者 与 转 录 有 关 的 区 域 。该 序 列
高 的 灵 敏 度 ， 混 合 菌 中 ， 一 种 菌 占总 菌 量 的 ０ ５ 在 当 ． ％时 ， 即
可 被 该 方 法 准 确 地 检 测 出来 。 目前 关 于 Ｅ Ｉ Ｒ Ｃ—Ｐ Ｒ 的 扩 增 产 物 还 存 在 争 议 。 Ｖ ｒ ． Ｃ ｅａ ｓ
１ ｉ等 【 认 为 扩 增 产 物应 该 是 两 个 Ｅ Ｉ ｏｃ ４ ｖ Ｒ Ｃ之 间 的 序 列 片 段 ，
Ｄ Ａ 没有 严格 的 要 求 ， 养 的 细 胞 或 经 煮 沸 处 理 的 细 胞 均 Ｎ 培 可 作 为 模 板 ， 得 到 的指 纹 图 谱 比 Ｒ Ｐ 所 Ａ Ｄ—Ｐ Ｒ指 纹 图谱 具 Ｃ
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动物营养学报2010,22(4):9852991Chinese J ournal of Animal Nutritiondoi :10.3969/j.issn.10062267x.2010.04.026利用ERIC 2PCR 和PCR 2D GGE 技术分析喂服枯草芽孢杆菌肉鸡肠道菌群的多样性潘康成 陈正礼 崔恒敏3 冯 兴 盛 琴 赵 爽(四川农业大学动物医学院,动物疫病与人类健康四川省重点实验室,雅安625014)摘 要:本文旨在采用ERIC 2PC R 和PC R 2D G G E 方法研究肉鸡喂服枯草芽孢杆菌后肠道菌群的多样性。
选用15羽28日龄肉鸡,按2mL /kg B W 喂服枯草芽孢杆菌悬液(109C FU/mL ),每天2次,连续3d ,34日龄时,利用ER IC 2PC R 和PC R 2D G G E 方法分析肠道菌群的多样性,并对D G G E 条带进行回收、测序。
结果表明,肉鸡口服枯草芽孢杆菌后各肠段的条带数显著多于对照组(P <0105或P <0101),2种方法检测结果相似,2组之间肠道总菌群相似性为5312%;电泳指纹图谱和统计条带数量分析,PC R 2D G G E 明显优于ERIC 2PC R ;回收条带以乳杆菌属细菌为主。
结果提示,34日龄肉鸡肠道菌群具有一定的稳定性,以乳杆菌为主要菌群,饲喂芽孢杆菌后能提高肉鸡肠道菌群的丰度和种群密度;PC R 2D G G E 检测方法明显优于ERIC 2PC R 。
关键词:枯草芽孢杆菌;肉鸡;肠道菌群;多样性;ERIC 2PC R ;PC R 2D G G E中图分类号:S831 文献标识码:A 文章编号:10062267X (2010)0420985207收稿日期:2010-01-14基金项目:“教育部长江学者和创新团队发展计划”创新团队资助项目(I R T0848)作者简介:潘康成(1971-),男,苗族,贵州榕江人,副教授,博士,主要从事动物微生态学和发酵工程研究。
E 2mail :p anka ngcheng71@ 3通讯作者:崔恒敏,教授,博士生导师,E 2mail :cui hengmin2008@ 动物肠道中寄生着种类繁多和数量巨大的微生物,正常情况下,它们之间以稳定的比例关系与宿主肠道相互依存又相互影响,形成动态的微生态平衡。
肠道正常菌群与肠道免疫系统的形成和功能、肠上皮细胞的生长有密切关系,并可以阻挡病原微生物的入侵[123]。
过去对肠道菌群结构的认识常采用传统的微生物培养技术,但由于肠道中约占总数90%的微生物不能在体外培养[4],因此不能客观评价肠道中微生物群落的变化规律。
肠道细菌基因间保守重复序列(ER I C )-聚合酶链反应(PC R )是近年来被广泛用于菌群结构及种群变化的一种分子生物学方法,该方法快速、简洁、不依赖于纯培养,可直接根据样品ER I C 条带的分布、数量和亮度等信息去分析,灵敏度、可重复性和可靠性较好[526]。
基于16S rD N A 为基础的分子生物学技术发展,不依赖微生物培养的分子生物技术为研究肠道微生态提供了简便而快捷的方法[7],其中变性梯度凝胶电泳(D G G E )技术近年来逐渐被应用于检测猪、牛、羊和鸡等肠道主要细菌类群的多态性[8212]。
目前,关于用传统的分离培养方法检测枯草芽孢杆菌对肉鸡消化道菌群的影响已有报道。
闫凤兰等[13]报道肉仔鸡饲喂枯草芽孢杆菌D1制剂后可显著增加肠道中乳杆菌的数量和极显著减少沙门氏菌的数量,但对大肠杆菌没有影响。
Teo 等[14]报道肉鸡饲喂每t 含有109个枯草芽孢杆菌的饲粮,对肠道乳杆菌和双歧杆菌的数量没有影响,但可使有害菌如大肠杆菌和梭菌的数量减少1～2lg (C FU /g )。
但利用ERI C 2PC R 和PC R 2D G G E 分析动物饲喂芽孢杆菌之后肠道菌群结构及多样性未见报道,因此本试验拟通过对肉鸡喂服枯草芽孢杆菌Pa b02菌悬液后,采用ER I C 2PC R 和PC R 2D G G E 方法研究肠道菌群结构的多样性,为该菌的应用提供理论基础。
1 材料与方法111 芽孢杆菌菌悬液的制备枯草芽孢杆菌Pab02菌种(本实验室保存)经活化后,接种于2000mL 营养肉汤中,37℃、160r/min 振荡培养18h 。
5000r/min 、4℃离心20mi n ,收集菌体,无菌PBS (0105mol/L 、p H 615)调整活菌浓度至1×109C FU /mL ,4℃保存备用。
112 动物分组及饲养1日龄的艾维茵肉鸡30只常规饲养至28日动 物 营 养 学 报22卷 龄,体重(105015±5611)g,随机分成2组,即试验组和对照组。
试验组按2mL/kg B W喂服菌悬液,每日08:00和20:00各1次,连续3d。
对照组喂服等量的灭菌PBS液。
2组鸡分别饲养于不同鸡舍内,自由采食不含任何抗生素和微生态制剂的饲料,自由饮水。
舍内温度控制在20～25℃。
113 肠道菌群总D NA的提取上述鸡只,在停服芽孢杆菌3d后即34日龄时,每组取5只,颈动脉放血处死,各取十二指肠、空肠、回肠和盲肠内容物约1g,称重并置于50mL灭菌离心管内,按照张保卫等[15]的方法抽提细菌基因组,基因组定容于50μL T E缓冲液中溶解,-70℃保存备用。
114 ERIC2PCR和PCR2D GGE分析11411 ER I C2PC R反应引物ERIC21:5′2ATGT AA GCTCCTGGGGAT2 TCAC23′和ERIC22:5′2AA GT AA GTGACT2 GGGGTGA GCG23′。
PCR反应体系(25μL):215μL 10×T aq Buffer(500mmol/L KCl、100mmol/L Tris2 HCl、15mmol/L MgCl2),4μL dN TP mixture(各215mmol/L),015μL T aq酶(5U/μL),20p mol/L 上下游引物各115μL,2μL D N A模板,补dd H2O 至25μL。
反应条件:95℃7mi n,30个循环(95℃30s、52℃1mi n、65℃8mi n),65℃16min。
11412 16S r RN A V3区PC R扩增根据大肠杆菌16S r RN A基因V3片段(339～539)设计一对引物:HD A12GC(5′2C GCCC G G2 G GC GC GCCCC G G GC G G G GC G G G G GCA C G G2 G G G GA C TCC TA C G G GA G GCA GCA G T23′)和HD A2(5′2G TA T TA CC GC G GC T GC T G GCA C2 3′)。
PC R反应体系(25μL):2×L ong Ta q Maste r Mix10μL,引物(10p mol/μL)各1μL,模板D N A 1μL,dd H2O补足25μL。
PC R扩增条件:94℃4min,30个循环(94℃30s、58℃30s、72℃2min),最后72℃延伸10mi n。
1.4.3 肠道菌群D NA的ER I C2PC R/PC R2D G G E图谱分析以提取的各肠段细菌D N A作为模板,按上述反应体系和反应条件进行扩增,ER I C2PC R产物经2%琼脂糖凝胶电泳并拍照。
16S r RN A V3区PC R 扩增产物进行D G G E分离,反应条件为:10%聚丙烯酰胺凝胶,变性剂浓度梯度为35%～65% (7mol/L尿素和40%去离子甲酰胺为100%变性剂),电泳采用D2code D G G E系统(Bio2Ra d),电泳缓冲液为1×TA E,200V预电泳5mi n,85V电泳16h,电泳结束后进行硝酸银染色,并将D G G E条带用凝胶成像系统拍照。
使用分析软件N TS YS 211对ER I C2PC R/PC R2D G G E指纹图谱进行条带计数,用Dice方法计算相似性指数Cs,用U P GMA (unweighted p air group mea n average)进行聚类。
115 割胶回收条带并克隆测序将D G G E图谱上出现的特征性条带割胶回收,用无菌去离子水冲洗3次,放入115mL离心管中,加入100μL TE缓冲液4℃过夜,取1μL为模板,按11412方法再次扩增16S rD NA V3区,扩增产物做D G G E电泳确认正确性,重复1～3次,直至在图谱上得到单一条带。
然后,取1μL回收的纯化D N A为模板,采用不带GC发夹的引物(HD A1:5′2 A C TCC TA C G G GA G GCA GCA G T23′,HD A2:5′2 G TA T TA CC GC G GC T G C T G GCA C23′)按11412方法扩增V3区。
PC R产物经p MD182T载体连接,转化E1coli D H5α感受态细胞,在含有氨苄青霉素的L B固体培养基上选择具有氨苄青霉素抗性的白色转化子,采用T载体通用引物进行菌落PC R 检测,送菌液至上海生工生物技术公司进行测序,将序列在Ge nB a nk数据库中进行同源性分析。
2 结 果2.1 肉鸡肠道菌群ERIC2PCR/PCR2D GGE指纹图谱及条带数ER I C2PC R扩增结果显示,对照组中扩增条带以盲肠数量最多,其次是空肠和回肠,十二指肠最少;肉鸡喂服芽孢杆菌Pa b02菌悬液后肠道的条带数都有一定程度增加,而且条带的亮度普遍提高,说明肠道菌群多样性丰富和种群密度有所增加,条带数量以空肠最多,其次是十二指肠,最后是盲肠和回肠。
16S r RNA V3区的PC R2D G G E扩增结果,对照组中扩增条带以盲肠数量最多,其次是空肠和回肠,十二指肠最少;肉鸡喂服芽孢杆菌Pa b02菌悬液后,各肠段的条带数及特征性条带均明显多于对照组,说明肉鸡口服芽孢杆菌Pa b02后肠道菌群多样性丰富和种群密度有所增加,与ER I C2PC R结果相似,不同的是PC R2D G G E的条带数量比ER I C2 PC R更多,肉鸡口服芽孢杆菌Pa b02后,肠道中的条带数量顺序分别为盲肠、空肠、十二指肠、回肠(图1和表1)。
689 4期潘康成等:利用ERIC 2PC R 和PC R 2D G G E技术分析喂服枯草芽孢杆菌肉鸡肠道菌群的多样性图1 肉鸡肠道菌群ERIC 2PCR (上图)和PCR 2DGGE(下图)指纹图谱Fig.1 ERIC 2PC R (above )and PC R 2D G G E (dow n )fingerp rint of intestinal microflora of broilers 泳道代号:第1个字母C 为对照组,T 为试验组;第2个字母D 为十二指肠,J 为空肠,I 为回肠,C 为盲肠;数字表示样品号。