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1. 挑取INVScI单菌落于5 mL YPAD培养基的试管中，30℃振荡（约250 rpm)培养过夜，OD600为1-2，取2 mL转入30 mL YPAD的50 mL的三角瓶中，30℃振荡（约250 rpm）孵育直至OD600为0.6（注：高培养密度会导致转化率下降）。
2. 4℃下1500×g离心10 min收集细胞。
3. 用1×TE Buffer ( pH 7.4) 冲洗细胞一次。
4. 用含200 mMLiAc 10-15 mL 的1×TE Buffer 9（无菌）重悬细胞，室温下放置10分钟。
5. 2500g离心收集细胞弃上清。
6. 用含200 mMLiAc的0.5 mL 1×TE Buffer(无菌)重悬细胞，用于转化。
7. 每次转化用上述制备好的感受态细胞溶液100μL。
8. 在含有100μL感受态细胞的离心管中，加入1μg待转化质粒DNA和100μg变性鲑鱼精DNA(salmon sperm DNA)。
9. 加入700μL的1XLiAc/40% PEG-3350/1XTE，彻底混匀。
10. 30℃孵育溶液30 min。
11. 加入88μL的二甲基DMSO，混匀，42℃热激7 min。
12. 高速离心10s，收集细胞。
13. 1mM 1× TE重新悬浮，再次离心，去除上清。
14. 重新加入50-100μL1×TE，混匀，均匀涂抹在筛选平板上。
15. 30℃生长2-3d，观察结果。
-80℃冰箱取出保存的polh菌株，在YPD平板上划线，28℃培养约24小时长出单菌落，挑单菌落到YPD液体培养基（500ml三角瓶，50ml培养基），摇瓶培养约16小时，此时OD600=0.8左右，取其中1ml转接到另一瓶YPD液体培养基中，摇瓶培养5小时左右OD600约0.8，准备做感受态，并转化。
1.离心收集菌体，用ph7.5的TE（改为10ml无菌水）重悬菌体，取1ml到EP管中，10000rpm离心1min，去上清；
2.加600μl 醋酸锂（0.1M pH 6.0）
3.在28℃水浴锅中保温1h；
4.3000rpm离心2min，弃上清；
5.加40μl醋酸锂轻轻悬浮细胞；（轻轻悬浮）
6.40μl的感受态细胞，加2μl ssDNA（重新处理）和3μl转化用的DNA；（轻轻混匀）
7.在28℃水浴锅中保温15min，然后加350μl PEG4000－醋酸锂溶液和16μl DTT;（轻轻混匀）
8. 在28℃水浴锅中保温1h,再加40μlDMSO,39℃热激10min；
加一步：4000rpm,5min离心收集菌体
9.加200μl醋酸锂重悬，再涂在5（2块平板）块选择平板上（120μl（100μl）/平板）
我每次平行做5管，共涂10块平板。
MD平板要倒稍微厚点儿，不要太薄;涂平板时，平板要干。
酵母转化(一)原理：我们采用的是PEG/ LiAc法转化酵母。
PEG是一种高分子聚合物,只有分子量达到3000 左右的PEG才会发挥最大的转化促进作用。
本文使用的PEG分子量为3350 ,实验结果表明促转化效果可以达到103～105cfu/μg 。
PEG在酵母转化中起到在高浓度醋酸锂环境中保护细胞膜,减少醋酸锂对细胞膜结构的过渡损伤,同时促进质粒与细胞膜接触更紧密。
PEG的浓度是务必适宜,这一点很重要。
LiAc可使酵母细胞产生一种短暂的感受性状态,此时它们能够摄取外源性DNA 。
鲑鱼精担体DNA 为短的线形单链DNA ,在转化实验中主要是保护质粒免于被DNA 酶降解;另外还可能在酵母细胞摄取外源性环形质粒DNA 中发挥协助作用。
在每次使用前务必进行热变性,使可能结合的双链DNA 打开,保证鲑鱼精担体DNA在转化实验体系中以单链形式存在(二)材料、仪器设备及试剂：1.SD 培养基：●YNB： 1.6 g/L●硫酸铵：5g/L●氨基酸：根据质粒的筛选压力选择性添加●调节pH=5.8，121°灭菌15min2.YPDA培养基●胰蛋白胨20g/L●酵母浸膏10g/L●琼脂20g/L(固体)●腺嘌呤15ml 0.2% 腺嘌呤/ L●调节pH =7.5，121°灭菌15min3.0.9%NaCl（w/v）●NaCl: 0.9g●milipore水定容到100ml●灭菌121°，20min4.100%DMSO从试剂瓶中分装到ep管中，500ul每管，室温保存5.10×TE（pH=7.5）：（0.1M Tris-HCl，10mM EDTA）●Tris-HCl 1.211g/100ml●EDTA 0.37g/100ml●调节pH=7.5, 121°，20min6.10×LiAc（pH=7.5）●1M LiAc 10.202g/100ml●用醋酸调节pH=7.5，121°灭菌20min7. 1.1×TE/LiAc●Tris-HCl 11ml 10×LiAc（pH=7.5）/100ml●EDTA 11ml 10×EDTA （pH=7.5）/100ml●调节pH=7.5, 121°，20min8.50% PEG3350：●PEG3350：50g●已灭菌的milipore水：定容到100m●（可用50°水浴助溶，PEG易吸水，不可灭菌）9.PEG/LiAc：现配现用，在超净台中操作，吸取母液到ep管或50ml离心管中终浓度10mlPEG3350 40% 8ml 50%PEG3350TE buffer 1×1ml 10×TELiAc 1×1ml 10×LiAc10.变性的鲑鱼精DNA(10mg/ml)ipore水，70%酒精棉球，50ml离心管4个，ep管一盒，15ml试管架，50ml试管架，ep管架(三)具体方法：◆A：酵母感受态制备1.从平板上或保种管中，挑少许酵母，在YPDA平板上划单克隆，30°培养3天左右。
电转法设计方案一:感受态制备：1 .挑一环酵母菌接种于5mLYEPD培养基中，30C、250-300rpm培养过夜；2 .取1mL一级种子分别接种于两瓶50mLYEPD培养基中，30C、250-300rpm培养约16-18h（OD:1.3-1.5）;3 .于4c离心收集菌体，用25mL冰无菌水洗涤一次后，细胞用10ml冰无菌水重悬，可换成较小的离心管；4 .加入1ml,pH7.5,10灯E缓冲液，摇晃均匀，再加入1ml10*iAc,旋转摇匀，于30度轻轻摇动45min；5 .再加入0.4ml1mol/LDTT,并同时旋转摇动，于30度轻轻摇动15min；6 .于4c离心，弃上清（用枪吸），再用25mL冰无菌水洗涤；7 .2.5ml冰冷的1mol/L山梨醇洗涤，离心收集菌体，弃上清（用枪吸）；8 .每管用100ul山梨醇溶解，分装于EP管中（80ul/管），于-70C冰箱保存。
电转化：1 .向感受态细胞中加入约5〜10ug（体积小于10ul）的DNA,用枪吹吸均匀，转移至预冷的电转杯中，静置5min；2 .擦干电转杯，电击，电击参数：1.5KV,25uF,200欧姆；3 .立即加入1ml预冷的山梨醇，转移至EP管中，于30c静置1h;4 .离心，弃上清，加入1mLYEPD后，于30C、200rpm培养2h;5 .离心得菌体后，吸除550ul上清液，然后按150ul版进行涂板。
说明：该方法可直接采用50或100mL体系的一步法，即直接挑单菌落于YEPD中培养至预定菌浓，也可采用试管摇菌收集菌体制备感受态。
设计方案二：感受态制备：1 .挑一环酵母菌接种于5mLYEPD培养基中，30C、250-300rpm培养过夜；2 .取1mL一级种子分别接种于两瓶50mLYEPD培养基中，30C、250-300rpm培养约16-18h（OD:1.3-1.5）;3 .于4C,5000rpm,5min离心收集菌体，用25mL冰无菌水洗涤后，细胞重悬于8ml处理液中（处理液配方：100mMLiAc,10mMDTT,0.6M山梨醇，10mMTris-HCl,pH7.5）,室温静置30min;4 .4C,5000rpm,5min离心收集菌体，用1.5mL1mol/L预冷的山梨醇洗涤三次，离心条件一样；5 .每管用100ul山梨醇溶解（以黄枪头能吸取为宜，菌浓低时可适量少加入山梨醇），最后以80ul的终体积转移至EP管中（菌体太多可适当放弃部分），置于-70C冰箱保存。
酵母转化的原理
酵母转化指的是酵母菌体内发生的一系列生化反应，将底物转化为产物的过程。
其原理是酵母菌体内的酶作用下，将底物分解为较小的分子或化合物，进而合成新的产物。
酵母转化的具体过程包括底物的吸附、底物与酵母酶的结合、催化反应、产物的释放等。
其中，底物吸附与酵母酶的结合是酵母转化的第一步，在这一步中，底物需要与酵母酶发生亲和作用，才能进一步发生催化反应。
催化反应是酵母转化的核心步骤，酵母酶将底物分解为较小的分子或化合物，从而形成新的产物。
催化反应的速度受到多种因素的影响，如底物浓度、酵母酶浓度、反应温度、反应pH等。
在酵母转化的过程中，产物的释放同样是十分关键的一步。
产物必须及时地从酵母菌体中释放出来，以避免在酵母菌体内积累过多的产物，影响酵母菌体的生长和发育。
总之，酵母转化是一种复杂的生化过程，是酵母菌体内多种酶协同作用的结果。
了解酵母转化的原理，对于优化酵母发酵、提高发酵产物的质量和产量等方面具有重要的作用。
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在精编分子生物学实验指南上有一部分讲到了酿酒酵母，电转化具体过程如下：1）将转化用酵母菌株的单菌落接种于5ml YPD培养基中，30度过夜培养至饱和。
2）转化前一天晚上，在装有500ml YPD培养基的2L无菌烧瓶中接种适量的过夜培养液，于30度剧烈振摇，直到细胞密度达1*10的8次方（OD600约为1.3-1.5）。
3）于4度4000g离心收获培养细胞，细胞用80ml无菌水重悬。
为了增加细胞对电击的感受性，继续步骤4。
如果不需要可接步骤64）加入10ml，pH7.5，10*TE缓冲液，摇晃均匀，再加入10ml10*乙酸锂，旋转摇匀，于30度请请摇动45min5）加入2.5ml 1 mol/L DTT,并同时旋转摇动，于30度轻轻摇动15min6）将酵母菌悬液稀释在500ml水中，洗涤3次，每次以4000-6000g于4度离心沉淀细胞，依次重悬细胞，所用的溶液如下：第一次沉淀：250ml冰冷的水第二次沉淀：20-30ml冰冷的1mol/L山梨醇第三次沉淀：0.5ml冰冷的1mol/L山梨醇最终的OD600应为约2007）电转化：在无菌冰冷的微量离心管中加入40ul 酵母菌细胞和小于等于100ng 待转化的DNA（体积小于5ul），混匀。
转移至冰冷的电转槽中，接下来按照你的电穿孔仪的说明操作就可以啦。
8）往电击槽中加入1ml冰冷的1mol/L山梨醇，轻轻吹吸混匀9）直接涂布在山梨醇选择培养基平板上，于30度培养3-6天，直到平板上出现菌落。
步骤7-8可能会因电转仪的不同而有所不同。
其实用乙酸锂法也很方便的。
在一本酵母操作的实验手册上还看到了一个lazy-bones的转化实验方法，按照它做下来也得到了菌落。
1.电转化相关事项①在电转完毕涂MD平板时，我是不加抗生素的，因为MD平板本身就有组氨酸营养缺陷的筛选标记，据说再加抗生素很容易压力过大，不长菌。
20度培养48-55h后，酵母长出来，挑单菌落，到YPD液体培养基（刚筛选时我一般只加0.5mg/ml的G418），菌长好后，提基因组，验证插入基因和拷贝数，拷贝数这时也可以通过添加不同浓度G418的平板来验证。
如果基因插入没问题，再培养诱导，测活。
②YPD可以直接灭菌，刚开始我葡萄糖单灭，后来发现酵母粉蛋白胨葡萄糖一起加也没问题。
③.温度方面，毕赤酵母最常用的是30度，只要不长时间超过32度就没有问题，诱导温度与表达的蛋白是否被降解有关，但通常30度。
④.生物素方面，只要用到酵母粉的培养基都可以不用。
⑤. MD是的氮源是无机氮，没有组氨酸，空的毕赤酵母不在它上面不会长，长的有99％都是重组菌⑥可以用G418 YPD平板筛选高考贝菌，一般情况下拷贝数高的表达量就高（但有些蛋白酶不一定表达量高就好），一般情况下MD平板上长出的菌可以直接用牙签挑到1.5mg/ml或2mg/ml G418的平板上，这个时候一般培养三天时间，长的大的菌落可能就没有几个了，这几个大的获得高表达的可能性是最大的。
⑦灭菌温度方面，只要有葡萄糖的都115度20分钟，没有的都可以121度20分钟。
⑧甲醇诱导方面，一天加一次终浓度1％的甲醇即可，前提条件是第一次一定要换掉培养基。
⑨蛋白降解方面，在发酵上一般通过调整pH,收获时间来解决，通过诱导温度是不理想的；从宿主上可以选用SMD1168，SMD1165,SMD1163,SMD1168用的最多，从分子上，可以突变掉目标蛋白的酶切位点。
可以通过不同的载体不同的线性化位点对已有的高表达酵母进行再转化，以获得更高表达的菌株；些方法也可以进行两种不同蛋白的共表达。
⑩电击之后，加入1ml的山梨醇，吸入1.5ml的ep管中，置于30度摇床低速培养1h，再涂板。
重组法酵母转基因的原理与操作流程下载提示：该文档是本店铺精心编制而成的，希望大家下载后，能够帮助大家解决实际问题。
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酵母转化方法步骤
1.YPD固体培养基
Yeast Extract：10 g；Peptone：20 g；葡萄糖：20 g；Agar：20 g
2.1M LiAc
LiAc：10.2 g；加水到100 ml
高压蒸汽灭菌，4℃保存。
100 mM的LiAc只需将1M LiAc稀释10倍即可。
3.50% PEG3350（50% W/V）
4.鲑鱼精DNA（2 mg/ml）
i.鲑鱼精DNA：2 mg；加TE缓冲液至10 ml
ii.振荡溶解后用注射器剧烈抽吸30-40次，沸水浴20分钟后马上置于冰上降温，分装100 μl到1.5ml离心管中-80℃保存。
5.SD-Trp培养基（1L, pH
6.8）
无氨基氮源（含硫胺酸）：6.7g；葡萄糖：20g；-Trp DO supplement：0.74g。
调节pH，121℃高压灭菌20分钟。
酵母热激转化
1.将酵母XK1-35在YPD固体培养基划线活化，3-4天菌落长到直径大约2-3 mm
待用（菌落平板可放在4℃冰箱保存2至3周）。
2.将单菌落挑到含有50 ml YPD的100 ml三角瓶中，30℃, 220 rpm摇12 h。
3.用分光光度计测量OD值到1.0（即5×107个/ml）,吸取5ml培养液加入到含有
45 ml YPD的100 ml三角瓶中，终浓度约为5×106个/ml。
4.置于30℃摇床中，200rpm摇至OD值为0.4-0.6（即2-3×107个/ml），约用时3小
时（2.5小时测一次OD值防止浓度摇过）。
5.将OD值为0.4-0.6的培养物转移到预冷的50ml的离心管中，置于冰上冷却15
分钟，3000g离心5分钟。
后面用到的试剂和仪器都要预冷，所有操作都要在冰上或者4℃。
6.倒掉上清液，加入30 ml预冷的无菌水并将酵母悬浮，同上步离心。
7.倒掉上清液，将酵母悬浮于1 ml 100 mM的LiAc中并转移到一个预冷2 ml无
菌离心管中。
8.高速离心15秒，吸出多余的LiAc。
9.悬浮细胞到终体积500 μl（约2×109个/ml），其中大约需加入400 μl 100mM的
LiAc。
可加DMSO到中浓度7%分装50μl后置于-80℃保存，但转化效率会降低。
10.将分装的50 μl酵母感受态细胞，15秒高速离心后将多于LiAc吸出。
11.按照下列顺序小心加入“转化混合液”：
i.240 μl50%PEG
ii.36 μl1M LiAc
iii.25 μl鲑鱼精DNA（2mg/ml）
iv.酶切载体和插入片段各0.5-1ug（摩尔数比值为，载体：插入片段=1：3-5）。
注意50%的PEG必须第一个加入已防止高浓度LiAc对酵母细胞的伤害，鲑鱼精DNA起担体DNA的作用可以促进载体和插入片段进入酵母感受态细胞。
12.剧烈涡旋每个反应管直到完全混匀，通常要1到2分钟。
13.置于30℃水浴，保温30分钟。
14.转移到42℃水浴中，热激20-40分钟。
15.8000 rpm离心15秒，除去转化混合液。
16.吸取600 μl无菌水到每个反应管中，用枪吹打悬浮。
17.吸取200 μl转化液涂选择性平板，此处用SD-trp平板，大约2到3天后长出转
化子。
