酵母菌感受态制作及转化

酿酒酵母电转感受态制备的研究与应用酵母是一种被广泛应用于食品工业中的微生物，其中酿酒酵母在酿造过程中起着至关重要的作用。

近年来，随着科技的发展，研究人员发现了一种新的酿酒酵母电转感受态制备方法，为酵母的利用与应用开辟了新的途径。

电转感受态是指在外界电场的作用下，细胞膜发生结构改变，从而使细胞对化合物的感受性提高。

酿酒酵母的电转感受态制备方法主要包括电渗透法和电击法两种。

电渗透法是通过电场作用下，使细胞膜发生临时孔结构，从而增加外界物质进入细胞的渗透性；电击法则是利用电场对细胞膜施加高压脉冲，使细胞膜发生破裂，从而使细胞对外界物质的吸收能力增强。

酿酒酵母电转感受态制备方法的研究不仅提高了酿酒酵母的利用效率，还为酿酒技术的创新与发展提供了新的思路。

在酿造过程中，常常需要添加剂来改善产品的风味、稳定性等特性，传统方法通常需要较长时间才能使剂量达到预期效果。

而通过电转感受态制备的酿酒酵母，其对外界物质的感受性大大增强，可以更快速地吸收添加剂，并在较短时间内完成酿造过程。

这不仅提高了生产效率，还降低了生产成本。

此外，酿酒酵母电转感受态制备还可以应用于其他领域的研究。

例如，在药物研发中，通过对细胞膜的电转感受态制备可以提高药物的吸收率，从而提高药效；在环境保护中，酿酒酵母可以作为一种生物传感器，利用其电转感受态对环境中的污染物进行监测
与检测。

总之，酿酒酵母电转感受态制备方法的研究与应用为酿酒技术的发展带来了新的机遇。

通过提高酿酒酵母对外界物质的感受性，可以提高酿酒效率，降低生产成本，并在其他领域的研究与应用中发挥重要作用。

毕赤酵母感受态细胞制作1、GS115活化：100ml三角瓶中装入20ml YPD培养基，接种100ul菌保，过夜活化。

2、转接：500ml三角瓶中装入100ml YPD培养基，取1ml活化菌液接种到100ml YPD培养基中，培养至OD约为1.3-1.5。

3、收菌：将菌放置冰上15min，或者放于4°冰箱冷却。

一般100ml菌液可以制备4份感受态细胞。

将无菌水和过滤除菌的山梨醇（1M）提前置于4°冰箱冷却。

4、用100ml离心管收集菌体，4000rpm/min离心5min去除YPD培养基。

5、用20ml预冷的无菌水洗菌体，4000rpm/min离心5min，重复一次。

6、用20ml预冷的山梨醇洗菌体，4000rpm/min离心5min。

7、每个离心管中加入3ml预冷的山梨醇，重悬菌体。

7、将菌体分装至1.5ml灭菌离心管中，分装4管，4000rpm/min离心5min，弃上清。

8、每管加入80ul预冷山梨醇，重悬菌体，置于冰上待用或加入10%DMSO保存于-80冰箱。

毕赤酵母电击法转化1、将感受态细胞在冰上融化，电转杯和山梨醇在冰上预冷。

2、将80ul感受态细胞与5-10ug线性化质粒混合，转移至0.2cm电转杯中，置于冰上5min。

3、根据电转仪选择合适的程序，进行电击。

4、电击后立即加入500ul预冷的山梨醇，将电击杯中液体全部转移至无菌的1.5ml离心管中，30℃水浴2h。

5、将菌体低转速离心5min，吸出多余上清，留100ul涂板即可。

6、将菌液均匀涂布于His缺陷型培养基，30℃培养1-2天。

要准备灭菌的有：水，1M山梨醇，滤器，大离心管，1.5ml离心管，大小枪头，所有的离心都是低温离心。

酵母感受态细胞的制备以下是酵母感受态细胞的制备流程：一、基因突变1. 细胞外DNA转化：将基因要进行突变的DNA提取出来，放到细胞外，同时加入一定量的外源DNA去促进转基因的完成；2. 高效增幅：将一定的量外源DNA通过吞噬电穿孔的方法把外源DNA效率的转入细胞内，从而加快基因突变。

二、诱导表达和突变检测1. 选择表达载体：根据要转入突变要表达的基因，选择匹配的表达载体；2. 诱导表达：通过加入不同的诱导因子或者培养条件来促使载体的表达；3. 突变检测：通过筛选、测序和碱基错配检测等方法来检测是否发生了突变。

三、表达筛选1. 抗药基因筛选：对突变的酵母细胞，加入不同程度的抗药性因子，筛选出能够生存的突变细胞；2. 免疫细胞筛选：检验突变后的酵母细胞中能够产生免疫识别和反应细胞因子的存在，因为普遍认为有可能产生免疫细胞的能力。

四、选择迁移1. 抗药性筛选：对抗药性筛选出的突变酵母细胞进行对比，以确定是否能够开花；2. 免疫细胞筛选：通过检测免疫细胞因子的存在，筛选出产生免疫细胞的能力最强的突变细胞，并将其迁移至感受细胞中保存。

五、酵母感受态细胞的制备收尾1. 养殖酵母细胞：选择最佳突变细胞，把其分段离心至细胞密度稀释到一定水平；2. 生长管理：按照不同的培养环境加以调节，保证其正常的增殖和生长；3. 继代培养：当突变酵母细胞进行繁殖增殖后，可以进行继代繁殖，以不断增加细胞数量；4. 收尾清理：当满足实验要求时，对细胞进行收尾，进行清洗和分装，并保存细胞，以便后续使用。

总结：酵母感受态细胞的制备，主要分为基因突变、诱导表达和突变检测、表达筛选、选择迁移、酵母感受态细胞的制备收尾等步骤。

通过这些步骤，可以有效的制备可用于实验的突变的酵母感受态细胞，从而为对基因的研究和开发提供了非常有价值的材料。

1、毕氏酵母氯化锂转化法（1）试剂1M LiCl（用去离子蒸馏水配制，滤膜过滤除菌；必要时用消毒去离子水稀释）50% PEG3350（Sigma P3640 用去离子蒸馏水配制，滤膜过滤除菌，用较紧的盖子的瓶子分装）2mg/ml salmon sperm DNA / TE（10mM Tris-Cl, pH8.0, 1.0mM EDTA）-20℃保存注：醋酸锂对毕氏酵母无效，仅氯化锂有效；PEG3350可屏蔽高浓度LiCl的毒害作用；（2）感受态毕氏酵母的制备接种Pachia pastoris到50ml YPD培养基中，30℃摇菌过夜（约24～28h）培养到OD值为0.8～1.0（约108 Cells/ml）；收获细胞，用25ml无菌水洗涤一次，室温下1500g离心10min；重悬细胞于1ml 100mM LiCl溶液中，将悬液转入1.5ml离心管；离心机最大速度离心15秒沉淀菌体，重悬菌体于400ul 100mM LiCl溶液中；按50ul/管分装，立即进行转化；注：不要将感受态酵母菌冰浴；（3）毕氏酵母的转化煮沸1ml鲑鱼精DNA 5min，迅速冰浴以制备单链担体DNA；将感受态酵母菌离心，以Tips去除残余的LiCl溶液；对于每一个转化，按以下顺序加入：50% PEG3350 240ul1M LiCl 36ul2mg/ml 单链Salmon sperm DNA 25ul5～10ug/50ul H2O 质粒DNA 50ul剧烈旋涡混匀直至沉淀菌体完全分布均匀（约1min）；30℃水浴孵育30min；42℃水浴热休克20～25min;6000～8000rpm离心收集酵母菌体；重悬酵母于1ml YPD培养基，30℃摇床孵育；1～4h后，取25～100ul菌液铺选择性培养基平板，于30℃培养2～3天鉴定；2、毕氏酵母PEG1000转化法（1）试剂缓冲液A：1.0M Sorbitol，10mM Bicine，pH8.35（sigma）,3%（v/v）ethylene gl ycol缓冲液B：40%（w/v）PEG1000（sigma），0.2M Bicine，pH8.35缓冲液C：0.15M NaCl，10mM Bicine，pH8.35未污染的新鲜、试剂级DMSO，-70℃保存注：缓冲液A、B、C均用滤膜过滤，-20℃保存;将DNA直接加在冻结的酵母细胞上是本实验的关键之处（即使在冰上解冻的待转化细胞，其摄取外源DNA的能力也在解冻过程中迅速下降；如进行多样品的转化，建议按6样品/组进行）;（2）待转化毕氏酵母的制备接种环接种Pachia pastoris于YPD平板，30℃培养2d;挑取单克隆酵母菌株于10mlYPD培养基中，30℃振荡培养过夜；取步骤2中小量菌液接种到100mlYPD培养基中振荡培养，待其OD值从0.1升到0. 5～0.8；室温下3000g离心收集酵母菌体，50ml缓冲液A洗涤一次；重悬菌体于4ml缓冲液A中，按0.2ml/管分装于1.5ml的离心管中，每管加入11ulD MSO，混合后迅速于液氮中冷冻，-70℃保存（3）毕氏酵母的转化将约50ug线性化质粒DNA溶于20ul TE或水中，直接加于冻结的酵母细胞中；加入担体DNA（40ug变性超声线性化鲑鱼精DNA）以获得最大转化率；37℃水浴孵育5min，中间混合样品1～2次；取出离心管，加入1.5ml缓冲液B，彻底混匀；30℃水浴孵育1h；室温下2000g离心10min，去除上清液，菌体沉淀重悬于1.5ml缓冲液C中；离心样品，去除上清液，轻微操作将样品重悬于0.2ml缓冲液C中；将所有转化液铺于选择性平板，于30℃孵育3～4天后，鉴定；3、毕氏酵母电转化法（1）E.coli TOP10F’感受态细胞的制备取10ul TOP10F’菌液，接种于200ml LB液体培养基中活化培养，37℃，200 rpm，16～18小时。

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毕氏酵母（Pichia pastoris）感受态细胞制备及转化1、毕氏酵母氯化锂转化法（1）试剂1M LiCl（用去离子蒸馏水配制，滤膜过滤除菌；必要时用消毒去离子水稀释）50% PEG3350（Sigma P3640 用去离子蒸馏水配制，滤膜过滤除菌，用较紧的盖子的瓶子分装）2mg/ml salmon sperm DNA / TE（10mM Tris-Cl, pH8.0, 1.0mM EDTA）-20℃保存注：醋酸锂对毕氏酵母无效，仅氯化锂有效；PEG3350可屏蔽高浓度LiCl的毒害作用；（2）感受态毕氏酵母的制备接种Pachia pastoris到50ml YPD培养基中，30℃摇菌过夜（约24～28h）培养到OD 值为0.8～1.0（约108 Cells/ml）；收获细胞，用25ml无菌水洗涤一次，室温下1500g离心10min；重悬细胞于1ml 100mM LiCl溶液中，将悬液转入1.5ml离心管；离心机最大速度离心15秒沉淀菌体，重悬菌体于400ul 100mM LiCl溶液中；按50ul/管分装，立即进行转化；注：不要将感受态酵母菌冰浴；（3）毕氏酵母的转化煮沸1ml鲑鱼精DNA 5min，迅速冰浴以制备单链担体DNA；将感受态酵母菌离心，以Tips去除残余的LiCl溶液；对于每一个转化，按以下顺序加入：50% PEG3350 240ul1M LiCl 36ul2mg/ml 单链Salmon sperm DNA 25ul5～10ug/50ul H2O 质粒DNA 50ul剧烈旋涡混匀直至沉淀菌体完全分布均匀（约1min）；30℃水浴孵育30min；42℃水浴热休克20～25min;6000～8000rpm离心收集酵母菌体；重悬酵母于1ml YPD培养基，30℃摇床孵育；1～4h后，取25～100ul菌液铺选择性培养基平板，于30℃培养2～3天鉴定；2、毕氏酵母PEG1000转化法（1）试剂缓冲液A：1.0M Sorbitol，10mM Bicine，pH8.35（sigma）,3%（v/v）ethylene glycol 缓冲液B：40%（w/v）PEG1000（sigma），0.2M Bicine，pH8.35缓冲液C：0.15M NaCl，10mM Bicine，pH8.35未污染的新鲜、试剂级DMSO，-70℃保存注：缓冲液A、B、C均用滤膜过滤，-20℃保存;将DNA直接加在冻结的酵母细胞上是本实验的关键之处（即使在冰上解冻的待转化细胞，其摄取外源DNA的能力也在解冻过程中迅速下降；如进行多样品的转化，建议按6样品/组进行）;（2）待转化毕氏酵母的制备接种环接种Pachia pastoris于YPD平板，30℃培养2d;挑取单克隆酵母菌株于10mlYPD培养基中，30℃振荡培养过夜；取步骤2中小量菌液接种到100mlYPD培养基中振荡培养，待其OD值从0.1升到0.5～0.8；室温下3000g离心收集酵母菌体，50ml缓冲液A洗涤一次；重悬菌体于4ml缓冲液A中，按0.2ml/管分装于1.5ml的离心管中，每管加入11ulDMSO，混合后迅速于液氮中冷冻，-70℃保存（3）毕氏酵母的转化将约50ug线性化质粒DNA溶于20ul TE或水中，直接加于冻结的酵母细胞中；加入担体DNA（40ug变性超声线性化鲑鱼精DNA）以获得最大转化率；37℃水浴孵育5min，中间混合样品1～2次；取出离心管，加入1.5ml缓冲液B，彻底混匀；30℃水浴孵育1h；室温下2000g离心10min，去除上清液，菌体沉淀重悬于1.5ml缓冲液C中；离心样品，去除上清液，轻微操作将样品重悬于0.2ml缓冲液C中；将所有转化液铺于选择性平板，于30℃孵育3～4天后，鉴定；3、毕氏酵母电转化法（1）E.coli TOP10F’感受态细胞的制备取10ul TOP10F’菌液，接种于200ml LB液体培养基中活化培养，37℃，200 rpm，16～18小时。

一、实验目的1. 掌握酵母转化实验的基本原理和操作步骤。

2. 熟悉酵母转化过程中所使用的试剂和仪器。

3. 通过实验，了解酵母转化实验在基因工程中的应用。

二、实验原理酵母转化是指将外源DNA分子导入酵母细胞内，使其在酵母细胞内表达的过程。

本实验采用化学转化法，利用氯化钙处理酵母细胞，使其成为感受态细胞，从而实现外源DNA的导入。

三、实验材料与试剂1. 实验材料：- 酵母菌株：Saccharomyces cerevisiae- 载体质粒：pUC19- 酵母转化试剂盒：S.C. EasyComp Transformation Kit- YPD培养基：酵母提取物、蛋白胨、葡萄糖- 氯化钙：CaCl2- 甘油：丙三醇- 碘化钾：KI- 磷酸氢二钠：Na2HPO4- 磷酸二氢钠：NaH2PO4- 水合氯醛：CHCl3- 无水乙醇：C2H5OH- 70%乙醇：C2H5OH2. 实验试剂：- 20%葡萄糖溶液：20g葡萄糖溶于80ml蒸馏水中- 10mg/mL质粒DNA溶液：取适量质粒DNA，加入适量无菌水，配制成10mg/mL 的溶液- Solution I：0.2mol/L磷酸缓冲液（pH 7.0），含1.0mol/L氯化钠- Solution II：0.1mol/L磷酸缓冲液（pH 7.0），含1.0mol/L氯化钠和1.0mol/L甘露醇四、实验步骤1. 酵母细胞培养- 将酵母菌株接种于YPD培养基中，于30℃培养过夜。

- 次日，挑取单菌落，接种于50mlYPD培养基中，于30℃、220rpm摇床培养过夜。

2. 酵母细胞感受态制备- 取适量菌液，于4500rpm、室温离心5min，弃上清。

- 加入10ml Solution I，重悬菌体。

- 4500rpm、室温离心5min，弃上清。

- 加入1ml Solution II，重悬菌体。

- 将菌液分装至1.5ml离心管中，每管50μl，于-80℃保存。

3. 酵母转化- 取适量质粒DNA溶液，加入适量无菌水，配制成10ng/μl的溶液。

毕赤酵母感受态细胞制备
1.毕赤氏酵母GS115感受态细胞制备
(1)从YPD平板上挑取单菌落2~3个于含25mL YPD的250mL 三角瓶中，220r/min，30o C过夜（下午5点接，到第二天9点转接）;
(2)取1mL 过夜培养物，接种含50mL 新鲜培养基（YPD）的250mL 摇瓶（接种两瓶，共100mL培养液），生长至OD600~1.3-1.5(4h左右）；
(3)将100mL培养液分装于3个50mL离心管中，4o C，5000g 离心5min，用少许预冷的灭菌水悬浮细胞后并于1管中，加预冷的灭菌水至20mL；
(4)如上离心，用10mL 预冷的灭菌水悬浮细胞；
(5)如上离心，用10mL 预冷的1 mol/L山梨醇溶液悬浮细胞；
(6)如上离心，用0.5mL 预冷的1 mol/L山梨醇溶液悬浮细胞。

2.转化（电击转化）
(1)取80μL上述细胞与10μL 线性化DNA混合，转入预冷的0.2cm电转杯中；
(2)在冰上放置5min；
(3)根据所使用电转仪制造商推荐的酿酒酵母参数进行电击细胞（1.5KV，6ms）；
(4)立即加入0.9 mL 预冷的1 mol/L山梨醇溶液至杯中，将内容物转移至灭菌离心管中；
(5) 5000g离心5min，剩余200μL菌液吹吸重悬细胞，涂布1块MD平板；
(6)在30o C孵育平板至菌落明显形成（大约3~4天）。

酵母感受态YIp的制备是一个复杂的过程，涉及到细胞培养、细胞分离、基因转化等多个步骤。

下面将详细介绍酵母感受态YIp的制备过程、注意事项以及可能遇到的问题及其解决方法。

一、准备工作1. 器材和试剂：培养箱、离心机、灭菌锅、移液器、细菌培养皿、显微镜、PCR仪、氯化钙溶液、甘油、感受态细胞质提取液、酵母基因组DNA提取液等。

二、制备步骤1. 酵母细胞培养：选择酵母菌株，将菌株接种到适宜的培养基中，培养酵母细胞。

当酵母细胞生长到适当的密度时，停止培养，用移液器将酵母细胞收集到离心管中，进行离心操作。

2. 细胞分离：将离心后的酵母细胞用氯化钙溶液悬浮，并通过梯度离心法或其他分离方法，将细胞分离得到感受态细胞。

3. 基因转化：将目的基因或质粒DNA与酵母感受态细胞混合，在一定的温度下进行转化。

转化过程中，DNA分子进入酵母细胞并被复制，最终形成基因组整合。

4. 筛选鉴定：通过PCR或酶切等方法对转化细胞进行筛选鉴定，确定是否成功转化。

三、注意事项1. 培养基和环境的控制：要保证培养基的质量和适宜的温度、pH值等环境条件，以保证酵母细胞的正常生长和增殖。

2. 细胞的收集和离心：要确保收集到的酵母细胞数量和质量，以保证感受态细胞的制备效果。

3. 感受态细胞的制备：要保证细胞的活性，避免长时间离心或暴露在空气中，以保持细胞的感受态状态。

4. 转化过程的控制：要确保DNA进入酵母细胞并成功整合，需要控制转化过程中的温度、时间等因素。

5. 筛选鉴定的准确性：要确保筛选鉴定的准确性，需要建立有效的筛选方法和标准，并对筛选结果进行反复验证。

四、可能遇到的问题及其解决方法1. 酵母细胞生长不良：检查培养基的质量和配方，调整培养条件，如温度、pH值、渗透压等。

2. 感受态细胞活性不足：制备过程中要保证细胞的活性，可以尝试增加细胞的离心时间和温度等。

3. 转化效率低：可以尝试增加DNA的浓度、延长转化时间、优化转化条件等方法来提高转化效率。

1．接种5ml液体YPAD或10ml SC，30℃下振荡培养过夜。

2．计数过夜培养物细胞密度，以最终5×106个/ml的细胞密度接种50ml YPAD培养液。

3．置30℃，200r/min振荡培养至2×107个细胞/ml，通常需要3～5小时，该培养物的细胞足够供十次转化用。

4．用50ml无菌离心管以3000g（2500r/min）离心5分钟，收获细胞。

5．弃培养液，把细胞悬浮在25ml无菌水中，再同上离心。

6．弃水，把细胞悬浮在1ml的100mmol/L醋酸锂中，转悬浮物到一个无菌1.5ml离心管。

7．高速离心5秒钟沉淀细胞，用微量移液器吸出醋酸锂。

8．悬浮细胞到最终500μl体积其中大约含400μl的100mmol/L醋酸锂。

9．将1ml单链载体DNA样品煮沸5分钟，快速在冰水中冷却。

10．振荡细胞悬浮液，取50μl样品加到标记的离心管中，离心沉淀细胞，用微量取样器除去醋酸锂。

11．基本“转化混合液”由下列成分组成，小心按下列顺序如下：240μl PEG（50% w/v）36μl 1.0mol/L 醋酸锂25μl 单链载体DNA（2.0mg/ml）50μl 水和质粒DNA（0.1～10μg）12．剧烈振荡每个反应管每个反应管直到细胞完全混匀，通常需要1分钟左右。

13．置30℃保温30分钟。

14．置42℃水浴中热激20～25分钟。

15．以6000～8000r/min离心15秒，用微量移液器除去转化混合液。

16．吸0.2～1.0ml无菌水加到每个反应管中，用移液器上下轻轻抽提以悬浮沉淀。

17．用等份的200μl转化混合液涂选择平板。

Y187 酵母感受态制作及转化1）挑新鲜单菌落Y187 于 8 ml YPDA 培养液， 30℃，250 rpm 培养 16-18h；2）至 OD600＞ 1.5， 1： 10 转接，此时OD600≈ 0.3；3）30℃， 250 rpm，4-7 h，每 2 h 检测一次，直到OD600=0.4-0.6；4）转入 2 个 50 ml 离心管， 5100 rpm,5 min,弃上清；5）加入 1/2 V ddH2O, 洗涤细胞， 5100 rpm,5min,弃上清；6）每管中分别加 1 ml 1 ×TE/LiAc ，冰上混匀， 10000 rpm，15 s，去上清；7）每管中分别加 0.5 ml 1 TE/LiAc×，冰上混匀， 10000 rpm，15 s，去上清；8）每管中分别加0.5 ml 1 TE/LiAc×，冰上混匀， 10000 rpm，15 s，去上清；9）每管中分别加0.4 ml 1 TE/LiAc×，每管 100 ul 分装；10）分别加入 100 ng 左右 DNA（ plasmid）和 0.1 mg 鲑鱼 DNA（10 mg/ml,10 ul） ,移液器抽吸混匀溶液；11）分别加入600 ul LiAc/PEG ，高速混匀（ 10 s-1 min 内）；12）30℃摇床恢复30 min；13）超净台（无菌条件下）加入70 ul DMSO, 轻轻颠倒混匀；14）42℃热激 15 min；15）冰上放置1-2 min；16）14 000 rpm,15 s,去上清；17）300 ul TE 重悬细胞；18）100 ul/1 ul 分别涂布于YPDA 平板；100 ul/1 ul 分别涂布于SD/-Trp 单缺陷平板；100 ul/1 ul 分别涂布于SD/ -Trp/ -His 双缺陷平板上， 30℃倒置培养48-72 h可见转化菌落。

毕氏酵母（Pichia pastoris）感受态细胞制备及转化1、毕氏酵母氯化锂转化法（1）试剂1M LiCl（用去离子蒸馏水配制，滤膜过滤除菌；必要时用消毒去离子水稀释）50% PEG3350（Sigma P3640 用去离子蒸馏水配制，滤膜过滤除菌，用较紧的盖子的瓶子分装）2mg/ml salmon sperm DNA / TE（10mM Tris-Cl, pH8.0, 1.0mM EDTA）-20℃保存注：醋酸锂对毕氏酵母无效，仅氯化锂有效；PEG3350可屏蔽高浓度LiCl的毒害作用；（2）感受态毕氏酵母的制备接种Pachia pastoris到50ml YPD培养基中，30℃摇菌过夜（约24～28h）培养到OD 值为0.8～1.0（约108 Cells/ml）；收获细胞，用25ml无菌水洗涤一次，室温下1500g离心10min；重悬细胞于1ml 100mM LiCl溶液中，将悬液转入1.5ml离心管；离心机最大速度离心15秒沉淀菌体，重悬菌体于400ul 100mM LiCl溶液中；按50ul/管分装，立即进行转化；注：不要将感受态酵母菌冰浴；（3）毕氏酵母的转化煮沸1ml鲑鱼精DNA 5min，迅速冰浴以制备单链担体DNA；将感受态酵母菌离心，以Tips去除残余的LiCl溶液；对于每一个转化，按以下顺序加入：50% PEG3350 240ul1M LiCl 36ul2mg/ml 单链Salmon sperm DNA 25ul5～10ug/50ul H2O 质粒DNA 50ul剧烈旋涡混匀直至沉淀菌体完全分布均匀（约1min）；30℃水浴孵育30min；42℃水浴热休克20～25min;6000～8000rpm离心收集酵母菌体；重悬酵母于1ml YPD培养基，30℃摇床孵育；1～4h后，取25～100ul菌液铺选择性培养基平板，于30℃培养2～3天鉴定；2、毕氏酵母PEG1000转化法（1）试剂缓冲液A：1.0M Sorbitol，10mM Bicine，pH8.35（sigma）,3%（v/v）ethylene glycol 缓冲液B：40%（w/v）PEG1000（sigma），0.2M Bicine，pH8.35缓冲液C：0.15M NaCl，10mM Bicine，pH8.35未污染的新鲜、试剂级DMSO，-70℃保存注：缓冲液A、B、C均用滤膜过滤，-20℃保存;将DNA直接加在冻结的酵母细胞上是本实验的关键之处（即使在冰上解冻的待转化细胞，其摄取外源DNA的能力也在解冻过程中迅速下降；如进行多样品的转化，建议按6样品/组进行）;（2）待转化毕氏酵母的制备接种环接种Pachia pastoris于YPD平板，30℃培养2d;挑取单克隆酵母菌株于10mlYPD培养基中，30℃振荡培养过夜；取步骤2中小量菌液接种到100mlYPD培养基中振荡培养，待其OD值从0.1升到0.5～0.8；室温下3000g离心收集酵母菌体，50ml缓冲液A洗涤一次；重悬菌体于4ml缓冲液A中，按0.2ml/管分装于1.5ml的离心管中，每管加入11ulDMSO，混合后迅速于液氮中冷冻，-70℃保存（3）毕氏酵母的转化将约50ug线性化质粒DNA溶于20ul TE或水中，直接加于冻结的酵母细胞中；加入担体DNA（40ug变性超声线性化鲑鱼精DNA）以获得最大转化率；37℃水浴孵育5min，中间混合样品1～2次；取出离心管，加入1.5ml缓冲液B，彻底混匀；30℃水浴孵育1h；室温下2000g离心10min，去除上清液，菌体沉淀重悬于1.5ml缓冲液C中；离心样品，去除上清液，轻微操作将样品重悬于0.2ml缓冲液C中；将所有转化液铺于选择性平板，于30℃孵育3～4天后，鉴定；3、毕氏酵母电转化法（1）E.coli TOP10F’感受态细胞的制备取10ul TOP10F’菌液，接种于200ml LB液体培养基中活化培养，37℃，200 rpm，16～18小时。

酵母转化试剂盒使用说明书（第二版）储存条件：Carrier DNA短期4℃，长期-20℃保存，其它组分可室温或4℃保存，有效期1年。

产品内容：Components SK2400-200PEG Solution50mlLiAc Solution50mlCarrier DNA2×1ml说明书1份酵母感受态细胞的制备：1.活化菌种。

-80℃保存的菌种在固体YPDA培养基（YPDA加20g Agar/L）上划线，在30℃培养2-4天。

2.挑取酵母单菌落在固体YPDA培养基上划3-5mm的短线，在30℃培养2-4天。

待酵母单菌落长至2mm长时，接种。

3.首先把酵母细胞接种到3ml液体YPDA培养基中，30℃过夜培养。

4.第二天转接到含有30ml液体YPDA培养基的三角瓶中继续培养，待OD600到0.4-0.5范围内。

收集细胞，1000g，离心5min,去上清。

5.沉淀用30-50ml的无菌的去离子水悬浮。

1000g，离心5min，去上清。

6.沉淀用合适体积的1/10浓度的LiAc悬浮（30ml的酵母菌最多用不超过1mL的1/10浓度的LiAc悬浮，通常100μl的酵母细胞用于转化一个质粒，即一个反应）。

1/10浓度的LiAc稀释方法：100μl LiAc Solution+900μl无菌水。

7.把酵母细胞的悬浮液分装到1.5ml的离心管中，每管分装100μl，用于转化一个质粒即一个反应。

1000g，离心5min，去上清。

制备好的感受态细胞备用。

酵母转化：1.配制预混液，每转化一个质粒即一个反应需要360μl的预混液。

PEG Solution240μlLiAc Solution36μlCarrier DNA10μl质粒（大约200ng/μl）5μl（根据质粒的浓度加入相应的体积）O补充）总体积360μl（不足体积用ddH22.吸取360μl的预混液加入到感受态细胞中，用枪头反复吹吸沉淀，使离心管底的酵母细胞彻底地悬浮在含有PEG的预混液中。

酵母感受态制备是一种通过培养酵母菌并在特定条件下进行处理，以获得酵母菌感受态的方法。

感受态酵母菌具有更高的DNA吸收能力，可以用于遗传转化或基因编辑等实验操作。

以下是一种常见的酵母感受态制备方法：
准备培养基：制备合适的培养基，例如YPDA培养基（酵母蛋白胨培养基加入葡萄糖和酵母提取物）。

培养酵母：在含有培养基的培养皿中培养酵母菌，通常在30°C温度下培养过夜，直到达到合适的生长阶段（一般为对数生长期）。

洗涤酵母：用无菌蒸馏水或缓冲液洗涤培养皿中的酵母菌，以去除培养基中的营养物质和代谢产物。

悬浮酵母：将洗涤后的酵母用合适的缓冲液悬浮均匀。

处理酵母：向悬浮酵母中加入聚乙二醇和DNA（转化质粒或目的基因），并进行短暂的热冲击（热激）。

恢复酵母：将处理后的酵母菌悬液进行恢复培养，可以在含有完整营养物质的培养基上进行培养，以让酵母菌恢复生长。

通过上述步骤，酵母菌就可以在感受态下吸收外源DNA，并进行转化。

这种方法常用于酵母菌基因组编辑、基因敲除、基因表达和功能研究等实验中。

不同实验目的和酵母菌菌株可能需要略微调整上述步骤中的条件和参数。

1，(1)从YPD阴性培养板上挑取单个菌落ppastorisGslls，接种于YPD 2mL培养基中，30℃振荡培养过夜(225r/mln)。

(2)取过夜活化的GS115菌液100微升接种于培养基YPD10mL中，30℃下摇床过夜。

(3)当菌液的OD600为0.8一1.2时，取出，用预冷的无菌水多次洗涤，4℃离心(3000r/mln)5min，最后沉淀以冰冷的lM的D一山梨醇重悬细胞沉淀，4℃离心(3000r/mln)5min(4)该沉淀溶于冰冷的1M的山梨醇200微升，以备转化。

醋酸钠溶液20林L、冰冷的无水乙醇40林L，于一20，r/min)20而n，弃上清，待乙醇挥干后，以nDw(2)将新鲜制备的GS115感受态细胞80微升与质粒10微升充分混匀，转入电转杯，冰浴5Min，1500v，25uf, 250电击。

(3)立即加入冰冷的1mo比山梨醇1ml,，转移入一无菌EB管中，30℃下静置2h,然后从中分别取出20微升，50，100，200微升涂板于含有抗生素的YPDS板上。

(4)30℃避光保存3天后，挑取单克隆至YPD2 ml中，30℃摇床震荡避光培养至对数生长期，冻存。

(4)与此同时，以不含目的基因Tal一TPS的空质粒电转化感受态GS115，操作方法同上。

电转化的单克隆冻存菌10微升经过夜活化后，接种于含有抗生素的YPD培养液2ml中，，30℃振荡避光培养过夜，次日分别于含zcocin高浓(1000ug/mL)的YPDs平板上进行培养，挑取20个单克隆菌落，YPD扩增培养4d。

(3)收集上清500ul，8000r/min离心5min后除去菌体，获得的上清加2倍体积冰冷的无水乙醇，-20℃放置30min，12000r/mln离心5min，弃去上清，获得的沉淀即为浓缩的蛋白。

(4)获得的浓缩蛋白溶于样品缓冲液20ul中，100℃变性3min，并按表2-6进行电泳。

(5)电泳分2个阶段进行，浓缩胶中:电压60V，电流13mA，lh;分离:电压150V，电流20mA，l.5h。

实验一细菌感受态的制备和质粒的转化实验目的通过实验学会感受态细胞的制备方法和DNA转化的最基本操作，以及如何提高转化效率的思路。

本实验综合因素较多，难度较大，是分子生物学中的一个很关键的实验手段。

实验原理转化是指某一细胞系由于接受了外源DNA，而导致其原来的遗传性状发生改变，这种遗传性状包括遗传型和表型的改变。

感受态是受体菌能接受外源DNA能力的一种生理状态。

用CaCl2处理细菌，改变细胞膜的结构，使质粒DNA能够穿过细菌细胞膜进入细胞。

然后在选择性培养基中培养转化处理过的细菌，转化成功的细菌可以在选择性培养基上生长形成菌落。

本实验采用质粒pUC118转化大肠杆菌DH-5 ，通过氨苄青霉素抗性筛选转化子。

图1-1质粒pUC118/pUC119图谱实验材料和试剂（一）实验材料大肠杆菌DH-5α质粒pUC118（ampicillin，Amp R）（二）培养基和试剂1. LB液体培养基(%)胰蛋白胨（Tryptone）0.5酵母浸出粉（Yeast extract）1.0NaCl 0.5pH 7.2～7.4（用2mol/L NaOH调节）（分装：20ml/250ml三角瓶，每组2瓶。

3ml/试管，每组2管。

0.07Mpa 高压灭菌30分钟）。

2. LB固体培养基LB液体培养基加入1.6%的琼脂粉即可。

（分装：50ml/250ml三角瓶，加入0.8克琼脂粉，每组1瓶。

0.07Mpa 高压灭菌30分钟）。

3. 抗生素：氨苄青霉素（ampicillin,，Amp），配制成100mg/ml备用。

4. 0.1mol/L CaCl2溶液(配制方法：称取1.1克无水CaCl2，溶于90ml蒸馏水中，定容至100ml，装于250ml三角瓶中，0.07Mpa高压灭菌30分钟，4℃保存。

）（三）器材接种针10ml移液管50ml塑料离心管5ml移液管90mm培养皿1ml移液管1.5ml Eppendorf管200μl吸头三角爬15×150试管冰块试管铝帽牛皮纸纱布盖线绳硫酸纸（四）仪器净化工作台摇床机恒温水浴锅离心机培养箱实验步骤以下均需无菌操作（一）感受态细胞的制备1. 大肠杆菌DH-5α冷冻保存的菌种，挑取一环，划线接种在LB固体培养基平板上（活化菌种），37℃培养过夜（约16小时）。

几种酵母转化方法酵母转化原理：像酿酒酵母,线性化的转化DNA和Pichiapastoris基因组的同源区域发生同源重组,使得线性化DNA产生稳定的转化子（Cregg et al., 1985; Cregg etal.,1989）.这样的整合方式显示极强的稳定性,即使多拷贝转化子在没有选择压力的情况下也很稳定.单交换事件（插入）比双交换事件（置换）发生几率更大.单插入事件中约发生1-10%概率的多插入事件.电转化注意点：一、制备感受态的菌液收集时间：1、准确测定OD值：OD在1.2～1.5之间。

1）为了准确测定OD值，建议将菌液稀释不同浓度测定（1、2、4、8、16倍稀释，看其OD值是否呈线性关系）。

每个倍数做3－5个重复，应该可以大致推断OD值是否准确！菌液看上去浑浊，但OD值不高，很可能OD稀释倍数不够！2） OD值是否测准也可以这样估算：OD600为40左右时，菌体湿重（6000rpm离心5min）约0.95g/10ml。

高密度发酵时菌体湿重将相应下降。

2、75ml的菌，经18h左右的培养，最后sorbital洗涤完毕后，50ml离心管里所剩菌体特别浓，需要1mlsorbitol才可溶解为糊状。

正常培养的OD在1.2～1.5之间的500ml菌液，收集的感受态也用1ml稀释的，没那么粘稠。

可以看看降低培养温度（27摄氏度）或缩短培养时间（12h）。

3、甚至不用转接,直接挑单克隆在50－100mlYPD中摇过夜，效果也很好二、制备感受态的菌液量如果只转一个样品，50ml就够了，一般50ml的培养液如果OD值正常的话够做10管感受态的，其他的按比例缩小。

用大试管摇5ml菌液，然后取1ml毫升在1.5mlEP管中制感受态，每一步的离心时间30秒就行。

整个流程时间短，制备好的感受态用来做转化的效率很高。

山梨醇离心，洗涤的过程之后的重悬的时候注意浓度，不要过于粘稠和稀释。

三、感受态的保存感受态细胞做好后由于电转化杯还没有处理好等原因，在冰上放几个小时再做可能有一定的影响，尽量马上制备马上转化。