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蛋白的酵母双杂交实验——以钓饵蛋白筛选cDNA 文库研究蛋白相互作用第一部分 系统简介1. 实验原理蛋白的酵母双杂交实验是以酵母的遗传分析为基础，研究反式作用因子之间的相互作用 对真核基因转录调控影响的实验。
很早就已知道，转录活化蛋白可以和DNA 上特异的序列结合而启动相应基因的转录反应。
这种DNA 结合与转录激活的功能是由转录活化蛋白上两个相互独立的结构域即DNA 结合结构域(Binding Domain, BD)和转录活化结构域(Activation Domain, AD)分别来完成的，并且这两个结构域对于基因的转录活化都是必须的。
目前酵母双杂交实验采用的系统有LexA 系统和Gal4系统两种。
在LexA 系统中，DNA 结合结构域由一个完整的原核蛋白LexA 构成，转录活化结构域则由一个88个氨基酸的酸性的大肠杆菌多肽B42构成，它在酵母中可以活化基因的转录; 在Gal4系统中，BD 和AD 分别由Gal4蛋白上不同的两个结构域(1-147aa 与768-881aa)构成。
在利用GAL4系统筛选cDNA 文库或研究蛋白间的相互作用时，DNA 结合结构域与靶蛋白即“诱饵”相结合，转录活化结构域与文库蛋白或要验证的蛋白相结合。
一般情况下，单独的BD 可以与GAL4上游活化序列（GAL UAS ）结合但不能引起转录，单独的AD 则不能与GAL UAS 结合，只有当BD 与AD 分别表达的融合蛋白由于相互作用而导致两者在空间上相互靠近时，BD 与AD 才能与GAL UAS 结合并且引起报道基因的转录。
在BD 与AD 要导入的酵母菌AH109中，通过基因工程的方法在GAL4 UASs 和启动子的下游构建了3个报道基因——ADE2，HIS3，MEL1（或LacZ ），因此可以通过营养缺陷筛选和酵母菌表型的改变来筛选或验证两个蛋白之间是否存在相互作用。
GAL4系统的原理如图所示：图一：酵母双杂交系统工作原理Kan r Amp r pGBKT7-bait pACT2-cDNA 生物 w .e b i o e .c o m2．系统特点同以往研究蛋白质—蛋白质之间相互作用的实验手段相比，双杂交系统具有其独特优势。
酵母双杂交操作手册 by shenao Y2H所需材料:PJ69-4A PJ69-4α or AH109 Y187pGBKT7 DNA-BD Vector (bait)pGADT7 AD Vector (prey)pGBKT7-53 Control VectorpGBKT7-Lam Control VectorpGADT7-T Control VectorpCL1 Control Vector3' DNA-BD & AD Sequencing PrimersHerring testes carrier DNAYeast extract，Dextrose(glucose); SD base; DO Supplement; Peptone，with DMF) TE buffer DMSO PEG/LiAc (10X) TE/LiAc buffer (10X) X-a-gal(Yeast Phenotypes–––Ade, His, Leu, Requires adenine (Ade), histidine (His), leucine (Leu), or tryptophan (Trp) in the–or Trp medium to grow; is auxotrophic for at least one of these specific nutrients.Expresses the ADE2 reporter gene; i.e., does not require Ade in the medium to +Ade grow.+His Expresses the HIS3 reporter gene; i.e., does not require His in the medium to grow.+LacZ Expresses the lacZ reporter gene; i.e., is positive for b-galactosidase activity.+Mel1 Expresses the MEL1 reporter gene; i.e., is positive for a-galactosidase activity. MiscellaneousAde2p Protein encoded by the yeast ADE2 gene.3-AT 3-amino-1,2,4-triazole; a competitive inhibitor of the His3 protein.CHX CycloheximideDropout (supplement or solution); a mixture of specific amino acids and nucleosidesDO used to supplement SD base to make SD medium; DO solutions are missing one ormore of the nutrients required by untransformed yeast to grow on SD medium.His3p Protein encoded by the yeast HIS3gene.Minimal Synthetic Dropout medium; comprised of a nitrogen base, a carbon source SD medium (glucose or galactose), and a DO supplement.YPH Yeast Protocols HandbookSD/–Ade SD/–Met SD/–His SD/–Ura YPDA YPD/CHX SD/–Leu SD/–Trp StrainPJ69-4A – + – + + –––––– + + ––– PJ69-4α1SD/–Ade SD/–Met SD/–His SD/–Ura YPDA YPD/CHX SD/–Leu SD/–Trp StrainAH109 – + – + + –––––– + + ––– Y187Yeast selection Bacterial selection Fusion EpitopeCloning vectorspGBKT7 DNA/bait c-Myc TRP1 kanamycinpGADT7 AD/library HA LEU2 ampicillin Control vectorspCL1 GAL4 LEU2 ampicillinpGADT7-T AD/T-antigen HA LEU2 ampicillin pGBKT7-53 DNA-BD/p53 c-Myc TRP1 kanamycin pGBKT7-Lam DNA-BD/lamin C c-Myc TRP1 kanamycin .缩写:Ade腺嘌呤(adenine) His组氨酸(histidine) Leu亮氨酸(leucine) Trp色氨酸(tryptophan)培养基成分及配制方法:YPD & SD Base from CLONTECH already contains a carbonsource(Dextrose(glucose))YPD: 20g/L Peptone, 10g/L Yeast extract, 2% Dextrose(20g/L), 20 g/L Agar (for plates only) 加入上述药品，加水至1L，调节PH值到6.5。
酵母双杂（Yeast two-hybrid）实验操作手册和注意事项一. 酵母双杂的原理1989年，Song和Field建立了第一个基于酵母的细胞内检测蛋白间相互作用的遗传系统。
很多真核生物的位点特异转录激活因子通常具有两个可分割开的结构域，即DNA特异结合域（DNA-binding domain，BD）与转录激活域（Transcriptional activation domain ，AD）。
这两个结构域各具功能，互不影响。
但一个完整的激活特定基因表达的激活因子必须同时含有这两个结构域,否则无法完成激活功能。
不同来源激活因子的BD区与AD结合后则特异地激活被BD结合的基因表达。
基于这个原理，可将两个待测蛋白分别与这两个结构域建成融合蛋白，并共表达于同一个酵母细胞内。
如果两个待测蛋白间能发生相互作用，就会通过待测蛋白的桥梁作用使AD与BD形成一个完整的转录激活因子并激活相应的报告基因表达。
通过对报告基因表型的测定可以很容易地知道待测蛋白分子间是否发生了相互作用。
酵母双杂交系统由三个部分组成：(1)与BD融合的蛋白表达载体，被表达的蛋白称诱饵蛋白(bait)。
(2)与AD融合的蛋白表达载体，被其表达的蛋白称靶蛋白(prey)。
(3)带有一个或多个报告基因的宿主菌株。
常用的报告基因有HIS3，URA3，LacZ和ADE2等。
而菌株则具有相应的缺陷型。
双杂交质粒上分别带有不同的抗性基因和营养标记基因。
这些有利于实验后期杂交质粒的鉴定与分离。
根据目前通用的系统中BD来源的不同主要分为GAL4系统和LexA系统。
后者因其BD来源于原核生物，在真核生物内缺少同源性，因此可以减少假阳性的出现。
二.所用的载体及相关信息1. pGBKT7载体的图谱和相关信息The pGBKT7 vector expresses proteins fused to amino acids 1–147 of the GAL4 DNA binding domain (DNA-BD). In yeast, fusion proteins are expressed at high levels from the constitutive ADH1promoter (PADH1); transcription is terminated by the T7 and ADH1 transcription termination signals(TT7 & ADH1). pGBKT7 also contains the T7 promoter, a c-Myc epitope tag, and a MCS. pGBKT7replicates autonomously in both E. coli and S. cerevisiae from the pUC and 2 m ori, respectively. Thevector carries the Kan r for selection in E. coli and the TRP1 nutritional marker for selection in yeast.Yeast strains containing pGBKT7 exhibit a higher transformation efficiency than strains carrying other DNA-BD domain vectors (1).b. pGADT7载体的图谱和相关信息pGADT7-T encodes a fusion of the SV40 large T-antigen (a.a. 86–708) and the GAL4 AD (a.a. 768–881). The SV40 large T DNA (GenBank LocusSV4CG) was derived from a plasmid referenced in Li & Fields (1993) and was cloned into pGADT7 using the EcoR I and Xho I sites. pGADT7-T has not been sequenced.三．实验主要流程A.需要准备的药品和设备1.两种酵母菌种(AH109,Y187)2.酵母培养所需的药品: Yeast nitrogen base without amino acidsAgar (for plates only)sterile 10×Dropout Solution单缺-T,-L(clontech公司)二缺-T/-L (clontech公司)四缺-T/-L/-Ade/-His(clontech公司)3.酵母转化所需的药品: 10×TE buffer10×LiAc40%PEGcarrier DNA4.酵母显色所需要的药品: x- -GAL5.其他仪器设备: 30℃恒温培养箱30℃摇床.水浴锅分光光度计B．DNA-BD和DN-AD fusion protein 载体的分别构建。
酵母双杂交实验酵母双杂交相关实验方法一、酵母总DNA提取方法（蜗牛酶法）1。
酵母质粒提取试剂bufferi0.9mol/lsorbitol0.1mol/ledtabufferii50mm/ltris20mm/ledtabufferiii10mm/l tris1mm/ledta2、操作步骤：（1）收集新鲜细菌，加入150μlbufferi、25μL蜗牛酶（30mg/ml）（2）37℃水浴1小时。
(3)10000rpm离心10min，去上清，沉淀中加入250μlbufferii。
(4)加入25μl10%sds，65℃水浴30min，每间隔5min中震荡一次。
(5)加入25μl5mol/l醋酸钾，冰浴60min。
(6)4℃12000rpm离心15min，取上清。
（7）向上清液中加入2-3倍体积的无水乙醇，充分混合，并在-20℃下静置1小时以上。
（8）取出，在4℃12000rpm下离心15分钟，丢弃上清液。
(9)加入150μlbufferiii溶解沉淀，用等体积苯酚/氯仿/异戊醇抽提。
(10)12000rpm离心15min。
（11）将上清液转移到新的离心管中，并添加6μl（10u/μl）核糖核酸酶，在37℃下放置30分钟。
（12）取上清液并添加等量的异丙醇。
（13）在4℃下静置10分钟超过1小时或过夜。
（14）在4℃下以10000 rpm离心5分钟。
(15)弃上清，并把沉淀溶于10μlbufferiii中。
二、小规模酵母转化1、酵母转化试剂：除PEG过滤灭菌外，其他转化试剂需要在与普通培养基灭菌相同的条件下进行高温高压灭菌。
(1)m醋酸锂（lithiumacetate）（2）聚乙二醇（PEG）分子量3350，浓度50%（w/V）（3）PEG/liac溶液的制备（即用）800μl50%peg100μl10×te100μl10×liac1ml总体积（4）1.1×TE/liac溶液（用于使用和制备）11ml10×TE（5）11ml10×liac（6）78mlddh202。
酵母双杂交实验步骤嘿，咱今儿就来唠唠酵母双杂交实验步骤这档子事儿！首先呢，你得准备好各种材料和试剂，这就好比要做饭得先把食材准备齐全一样。
酵母细胞那肯定是不能少的，就像做菜得有主要的食材原料呀。
然后呢，构建好你的“猎物”和“诱饵”载体。
这“猎物”和“诱饵”就像是游戏里的角色，得给它们打扮得妥妥当当，让它们能在这个实验的“大舞台”上好好表现。
接下来，把这些载体转化到酵母细胞里。
哎呀，这就好像把演员送上舞台，让它们开始表演啦。
之后，就是筛选的环节咯。
这就好比在一群人里找出最有特点、最合适的那一个，得仔细着点呢。
再然后，对筛选出来的阳性克隆进行验证。
这可不能马虎呀，得反复确认，就像你买了个宝贝，得好好鉴定鉴定是不是真货一样。
接着呢，分析实验结果。
这就像是看完一场精彩的表演后，得回味回味，看看哪里演得好，哪里还能改进。
在整个过程中，每一步都得小心谨慎，就跟走钢丝似的，一个不小心可能就前功尽弃啦！你想想，要是前面都做得好好的，到最后一步掉链子了，那不就太可惜了嘛！做这个实验啊，真的需要耐心和细心，就跟绣花似的，一针一线都不能马虎。
而且还得有敏锐的观察力，就像侦探一样，能从蛛丝马迹中发现关键信息。
咱再回过头来想想，这酵母双杂交实验不就像是搭积木嘛，一块一块地往上搭，每一块都得放对地方，最后才能搭出漂亮的城堡。
如果有一块放歪了，那这城堡可就不牢固啦！所以啊，做这个实验可得打起十二分的精神，不能有丝毫懈怠。
要是因为一点点小失误导致实验失败，那多不甘心啊！总之呢，酵母双杂交实验步骤虽然有点复杂，但只要咱认真对待，一步一个脚印地去做，肯定能取得好结果的。
加油吧！。
（酵母菌储存在-70℃中，引物和质粒DNA储存在-20℃中）概念：1. 次序转化:指的是先将一种质粒转化进酵母中（常是DNA-BD/bait plasmid），在选择培养基中选择出阳性克隆，之后再将另外一个质粒（AD fusion library）转化进去。
优点：就是比共转化使用更少的质粒DNA，也就是节约质粒DNA。
2. 共同转化：将两种质粒一起转化进酵母中。
优点：比次序转化更容易操作。
pGBKT7----的选择物是：kanamycin（卡那霉素）？pGADT7----的选择物是：ampicillin (氨苄西林) ？各种SD培养基：1)SD/-ade（腺嘌呤）/-leu（亮氨酸）/-trp（色氨酸）/-his （组氨酸）(1000 ml) （？“四缺”）酵母氮源（YNB）：6.7g ;-ade/-leu/-trp/-his DO supplement 0.60g （购买来就配好的） ;葡萄糖 20g (即2%)2)SD/-leu/-trp/-his (1000 ml)酵母氮源（YNB）：6.7g ;-leu/-trp/-his DO supplement 0.62g ; （购买来就配好的）葡萄糖 20g. (即2%)3)SD/-leu/-trp (1000 ml) （？“二缺”）酵母氮源（YNB）：6.7g ;-ade/-leu/-trp/-his DO supplement 0.64g （购买来就配好的）;葡萄糖 20g (即2%)4)SD/-leu (1000 ml)酵母氮源（YNB）：6.7g ;-leu DO supplement 0.69g ; （购买来就配好的）葡萄糖 20g (即2%)5)SD/-trp (1000 ml)酵母氮源（YNB）：6.7g ;-ade/-leu/-trp/-his DO supplement 0.74g ; （购买来就配好的）葡萄糖 20g (即2%)注意：YNB有两种，一种含有硫酸胺，另外一种不含硫酸胺。
（酵母菌储存在-70℃中，引物和质粒DNA储存在-20℃中）概念：1. 次序转化:指的是先将一种质粒转化进酵母中（常是DNA-BD/bait plasmid），在选择培养基中选择出阳性克隆，之后再将另外一个质粒（AD fusion library）转化进去。
优点：就是比共转化使用更少的质粒DNA，也就是节约质粒DNA。
2. 共同转化：将两种质粒一起转化进酵母中。
优点：比次序转化更容易操作。
pGBKT7----的选择物是：kanamycin（卡那霉素）pGADT7----的选择物是：ampicillin (氨苄西林)各种SD培养基：1)SD/-ade（腺嘌呤）/-leu（亮氨酸）/-trp（色氨酸）/-his （组氨酸）(1000 ml)（“四缺”）酵母氮源（YNB）： ;-ade/-leu/-trp/-his DO supplement 0.60g （购买来就配好的） ;葡萄糖20g (即2%)2)SD/-leu/-trp/-his (1000 ml)酵母氮源（YNB）： ;-leu/-trp/-his DO supplement 0.62g ; （购买来就配好的）葡萄糖 20g. (即2%)3)SD/-leu/-trp (1000 ml) （“二缺”）酵母氮源（YNB）： ;-ade/-leu/-trp/-his DO supplement 0.64g （购买来就配好的）;葡萄糖 20g (即2%)4)SD/-leu (1000 ml)酵母氮源（YNB）： ;-leu DO supplement 0.69g ; （购买来就配好的）葡萄糖 20g (即2%)5)SD/-trp (1000 ml)酵母氮源（YNB）： ;-ade/-leu/-trp/-his DO supplement 0.74g ; （购买来就配好的）葡萄糖 20g (即2%)注意：YNB有两种，一种含有硫酸胺，另外一种不含硫酸胺。
酵母双杂实验步骤2.1.1酵母双杂交2.1.1.1Gateway入门克隆设计Gateway引物时，在上游引物的5'端加上B1序列：GGGG-ACA-AGT-TT G-TAC -AAA-AAA-GCA-GGC-TNN-，下游引物的5'端加上B2序列：GGGG-ACC-ACT-TT G-T AC-AAG-AAA-GCT-GGG-TN-。
其中，5'-GGGG序列是保护碱基，防止引物的重要部分被降解，下划线加粗的部分是在整个的Gateway克隆中可以保存下来的序列，3'端的碱基N是为了保证经过入门载体构建目的载体时阅读框的正确性，一般建议为C。
通过PCR扩增获得带有att B位点的基因片段，扩增体系和条件见3.2.2.2，其中将退火温度改为65℃。
获得扩增产物后对其进行回收纯化，测定纯化后DNA 的质量和浓度后进行下一步的BP反应，反应体系如下：att B-PCR产物（≥10 ng/μL）1-7μLpDONR221 (150 ng/μL)1μLTE buffer, pH 8.0 补足8μL将上述混合物加入离心管中，加入2μL BP反应酶，加入之前需将其在涡旋仪上轻轻振荡两次，所有组分混匀离心后，25℃反应1h，加入1μL蛋白酶K后，混匀离心，37℃反应10min终止BP反应，将BP 反应产物参照3.2.2.6进行转化，由于pDONR221载体为Kan抗性，所以选用含有50μg/mL Kan抗生素的LB平板进行阳性克隆筛选，参照3.2.2.7检测阳性克隆，然后根据3.2.2.8中的方法提取重组质粒，测定质量和浓度后送至测序公司进行测序。
进行BP反应时，需注意以下几项：(1)对于BP反应来说，最高效的是采用线性的att B-PCR产物和超螺旋的att P入门载体；(2)为了提高BP反应的效率，可以将建议的25℃反应1h适当延长至4-6h，可以将效率提高2-3倍，或者延长至过夜反应，可以将效率提高5-10倍，对于长片段克隆来讲，适当的延长反应时间是非常必要的；(3)提高体系中PCR产物的量可以增加反应效率，但每10μL体系中PCR产物最好不要超过250ng。
LexA酵母双杂交系统简介一、LexA酵母双杂交系统的设计原理报告质粒p8op-LacZ的GAL4 UAS编码序列被完全去除，因此在缺乏LexA融合激活剂的情况下，报告基因LacZ的转录活性为零，该基因的筛选标志为URA3，可以作为有自主复制能力的质粒存在于酵母EGY48菌株中，也可以被整合到EGY48基因组DNA上。
质粒pLexA的筛选标志为HIS3，在双杂交系统中用于表达DNA-BD(202个氨基酸残基组成的LexA蛋白)与目标蛋白(钓饵，Bait)的融合蛋白，该融合体的表达受酵母强启动子ADH1的调控，选择与报告基因的操纵子LexA×8结合。
质粒pB42AD的筛选标志为TRP1，在其供外源基因插入的多克隆位点(EcoR I与Xho I)上游，含有SV40核定位(SV40 nuclear localization)、HA(血凝素)及AD(来自于的88个氨基酸残基组成的B42蛋白)等几种编码序列，共同组成可以启动报告基因转录表达的激活成份。
在酵母EGY48的基因组中还整合有另一个报告基因Leu，它与LacZ报告基因具有相同的操纵子-LexA，但两者启动子不同。
根据双杂交系统的原理，如果某一复合物同时具有DNA-BD和AD的活性，即可激活报告基因的转录和表达。
分别将待测蛋白X、Y的编码序列插入pLexA质粒载体和pB42AD质粒载体的多克隆位点中，然后共同转入含有报告基因的酵母菌株，如果蛋白X与Y能相互作用，则启动报告基因的转录和表达，通过检测报告基因的表达情况，就可以间接反映蛋白X、Y是否具有相互作用以及作用的强弱。
如果将蛋白Y换为取自组织或血液的cDNA文库，则可用X从该文库中筛选出能与其相互作用的蛋白，并且可以获得编码这些蛋白的cDNA。
二、商品化酵母双杂交系统的组成1. 载体质粒：pLexA、pB42AD、p8op-LacZ、pB42AD-DNA文库2. 酵母菌株：EGY48、EGY48（p8op-LacZ）、YM4271（EGY48的伴侣菌株）3. 大肠杆菌菌株： KC8株4. 对照质粒：质粒用途pLexA-53，pB42AD-T 阳性对照pLexA-Pos(LexA/GAL4 AD融合蛋白〕阳性对照pLexA-Lam(LaminC蛋白少与其它蛋白相互作用) 假阳性检测质粒5. 引物：pLexA测序引物及pB42AD测序引物。
LexA酵母双杂交系统简介一、LexA酵母双杂交系统的设计原理报告质粒p8op-LacZ的GAL4 UAS编码序列被完全去除，因此在缺乏LexA融合激活剂的情况下，报告基因LacZ的转录活性为零，该基因的筛选标志为URA3，可以作为有自主复制能力的质粒存在于酵母EGY48菌株中，也可以被整合到EGY48基因组DNA上。
质粒pLexA的筛选标志为HIS3，在双杂交系统中用于表达DNA-BD(202个氨基酸残基组成的LexA蛋白)与目标蛋白(钓饵，Bait)的融合蛋白，该融合体的表达受酵母强启动子ADH1的调控，选择与报告基因的操纵子LexA×8结合。
质粒pB42AD的筛选标志为TRP1，在其供外源基因插入的多克隆位点(EcoR I与Xho I)上游，含有SV40核定位(SV40 nuclear localization)、HA(血凝素)及AD(来自于E.coli的88个氨基酸残基组成的B42蛋白)等几种编码序列，共同组成可以启动报告基因转录表达的激活成份。
在酵母EGY48的基因组中还整合有另一个报告基因Leu，它与LacZ报告基因具有相同的操纵子-LexA，但两者启动子不同。
根据双杂交系统的原理，如果某一复合物同时具有DNA-BD和AD的活性，即可激活报告基因的转录和表达。
分别将待测蛋白X、Y的编码序列插入pLexA质粒载体和pB42AD质粒载体的多克隆位点中，然后共同转入含有报告基因的酵母菌株，如果蛋白X与Y能相互作用，则启动报告基因的转录和表达，通过检测报告基因的表达情况，就可以间接反映蛋白X、Y是否具有相互作用以及作用的强弱。
如果将蛋白Y换为取自组织或血液的cDNA文库，则可用X从该文库中筛选出能与其相互作用的蛋白，并且可以获得编码这些蛋白的cDNA。
二、商品化酵母双杂交系统的组成1. 载体质粒：pLexA、pB42AD、p8op-LacZ、pB42AD-DNA文库2. 酵母菌株：EGY48、EGY48（p8op-LacZ）、YM4271（EGY48的伴侣菌株）3. 大肠杆菌菌株：E.coli KC8株4. 对照质粒：质粒用途pLexA-53，pB42AD-T 阳性对照pLexA-Pos(LexA/GAL4 AD融合蛋白〕阳性对照pLexA-Lam(LaminC蛋白少与其它蛋白相互作用) 假阳性检测质粒5. 引物：pLexA测序引物及pB42AD测序引物。
（酵母菌储存在-70℃中，引物和质粒DNA储存在-20℃中）概念：1. 次序转化:指的是先将一种质粒转化进酵母中（常是DNA-BD/bait plasmid），在选择培养基中选择出阳性克隆，之后再将另外一个质粒（AD fusion library）转化进去。
优点：就是比共转化使用更少的质粒DNA，也就是节约质粒DNA。
2. 共同转化：将两种质粒一起转化进酵母中。
优点：比次序转化更容易操作。
pGBKT7----的选择物是：kanamycin（卡那霉素）？pGADT7----的选择物是：ampicillin (氨苄西林) ？各种SD培养基：1)SD/-ade（腺嘌呤）/-leu（亮氨酸）/-trp（色氨酸）/-his （组氨酸）(1000 ml) （？“四缺”）酵母氮源（YNB）：6.7g ;-ade/-leu/-trp/-his DO supplement 0.60g （购买来就配好的） ;葡萄糖 20g (即2%)2)SD/-leu/-trp/-his (1000 ml)酵母氮源（YNB）：6.7g ;-leu/-trp/-his DO supplement 0.62g ; （购买来就配好的）葡萄糖 20g. (即2%)3)SD/-leu/-trp (1000 ml) （？“二缺”）酵母氮源（YNB）：6.7g ;-ade/-leu/-trp/-his DO supplement 0.64g （购买来就配好的）;葡萄糖 20g (即2%)4)SD/-leu (1000 ml)酵母氮源（YNB）：6.7g ;-leu DO supplement 0.69g ; （购买来就配好的）葡萄糖 20g (即2%)5)SD/-trp (1000 ml)酵母氮源（YNB）：6.7g ;-ade/-leu/-trp/-his DO supplement 0.74g ; （购买来就配好的）葡萄糖 20g (即2%)注意：YNB有两种，一种含有硫酸胺，另外一种不含硫酸胺。
我们这用的是含硫酸铵的。
（买来就加进去了的）。
如果不含硫酸铵，那么要在终浓度0.17%的YNB中再加入0.5%的硫酸铵，即最终在1000 ml溶液中加入总量为6.7g的YNB与硫酸铵。
实际配制的方法是：1.配制40%的葡萄糖贮存液（贮存在4℃），过滤除菌，待高压灭菌的溶液温度降至55℃以下时，再将50ml葡萄糖贮存液加入。
（过滤即可使用）2.酵母氮源6.7g，加DO supplement 在920ml水中溶解，调PH至5.8（大约加10M NaOH200ul即可），之后补水至950 ml。
3.高压完后待温度降至55℃以下，加入50 ml40%葡萄糖。
YPD培养基(1000 ml)20 g/L 蛋白胨10 g/L 酵母提取物20 g/L 琼脂（只有制作平板才用）20 g/L 葡萄糖 (即2%)1x YPDA培养基(1000 ml)20 g/L 蛋白胨10 g/L 酵母提取物0.03 g/L 腺嘌呤（即终浓度为0.003％）腺嘌呤可以耐受高温20 g/L 葡萄糖 (即2%)实际配制的方法是：1.配制40%的葡萄糖贮存液（贮存在4℃），过滤除菌，待高压灭菌的溶液温度降至55℃以下时，再将50ml葡萄糖贮存液加入。
（李博士经验这一步不高压，过滤即可使用）2.配制0.2%的腺嘌呤溶液，过滤除菌，待高压灭菌的溶液温度降至55℃以下时，再将15ml腺嘌呤溶液加入。
（或将腺嘌呤直接加进去，为了方便我将直接加进去一起高压）3.（蛋白胨 20g ；酵母提取物10g ；水大约925ml）混合后，调至PH至6.5，加水至935ml，121℃高压15min。
注意：◆高压的温度和时间不能太长与太高，121℃高压15min即可。
◆可以在YPDA中加入20 g/L的琼脂，以配成平板。
◆需要加kanamycin时，kan终浓度是10–15 mg/L。
（kanamycin可以20℃贮存一个月，加入到平板中去可以4℃贮存一个月。
）PEG/LiAc溶液（即配即用）用下列贮存液来配制50% PEG 3350：用灭菌水配，如需要可以加热至50℃以助溶。
10X TE buffer：用灭菌水配，如需要可以加热至50℃以助溶。
10X LiAc：用灭菌水配，如需要可以加热至50℃以助溶。
最后配成PEG/LiAc溶液是：（以10ml为例）终浓度为配制10mlPEG/LiAc需要加入的物质PEG 4000 40% 8 ml of 50% PEGTE buffer 1X 1 ml of 10X TELiAc 1X 1 ml of 10X LiAc无菌1x TE/LiAc溶液（用10x已灭菌的贮存液稀释）10x TE buffer :0.1 M Tris-HCl, 10 mM EDTA, pH 7.5(高压)10x LiAc ： 1 M 用稀醋酸调节PH至7.5 高压For β-galactosidase 滤膜实验Z buffer溶液：Na2HPO4•7H2O 16.1 g/L （如换Na2HPO4•14H2O 则20.739 g/L）NaH2PO4•H2O 5.50 g/L （如换NaH2PO4•2H2O 则 6. 21g/L）KCl 0.75 g/LMgSO4•7H2O 0.246 g/L最后调PH至7.0，高压，室温下可以贮存1年X-gal 溶液：X-GAL溶解于DMF（二甲基甲酰胺）中至浓度为20 mg/ml.，–20°C避光保存Z buffer/X-gal 溶液：100 ml Z buffer0.27 ml β-mercaptoethanol （β-巯基乙醇）1.67 ml X-gal 贮存液ONPG 溶液：（即配即用）ONPG溶于Z buffer中，终浓度4 mg/ml，调PH至7.0.注意：1.ONPG需要1～2h才能溶解2.每次用之前新鲜制备。
带有β-巯基乙醇的Z buffer将0.27 mlβ-巯基乙醇加入100 ml Z buffer中即可为了转化成功的小提示：1.用一个1～3周龄（直径2～3mm）的菌落去接种液体培养基。
如果菌落直径＜2mm，就用多几个菌落去接种。
（也要大力涡旋使细胞团分散开来。
）2.如果过夜或者3hr之后的培养基明显成块，那么在使用之前一定要充分涡旋使培养基。
3.当通过离心收集细胞的时候，使用一个离心管即可，可以更好、更充分地收集细胞。
4.为了提高转化效率，要在1小时内准备酵母感受态细胞。
如果有必要，可以在11步之后在室温条件下储存酵母感受态细胞几个小时，而活性却只有一点降低。
5.当进行通同转化的时候，诱饵（BD）质粒的量必须过度，而AD质粒的量要不足。
一般BD是AD的两倍。
（李博士：此要求一般是针对文库筛选而言）6.为了使菌落更好地生长，在涂布转化复合物到琼脂平板上时要直到所有液体被吸收。
可以选择直径5mm的无菌玻璃珠（每一个100mm的平板用5-7个玻璃珠，直径150mm的平板用7-9个玻璃珠）去促进转化复合物的扩散，摇动的时候shake the plate back and forth —not round and round. （科内似并无此操作，而仅仅以玻棒涂布耳）一. 复苏酵母：将酵母细胞接种到YPD固体培养基中培养，培养1-3周。
（接种的时候采取四区分区画线法）二. 酵母感受态细胞置备和转化步骤：1.取直径2～3mm的克隆接种到1ml的YPD或SD培养基中。
2.剧烈振荡或涡旋5min，使所有团块分散开来。
3.转移酵母液到50 mlYPD（？固体——也有液态的，未加入琼脂粉耳）或者SD培养基中。
4.置于30℃摇床中，以250 rpm的转速震荡培养基16～18h，直到OD600>1.55.转移部分过夜培养物（30ml）到300mlYPD培养基（？固体）中，使最终OD600在0.2～0.3之间。
6.30℃摇床以230 rpm的转速震荡培养基3～4h直至OD为0.4～0.6.（If the OD600 is < 0.4, something is wrong with the culture）7.转移酵母液至50ml离心管中，1000g室温（20～21°C）离心5min8.弃去上清，加入25～50ml无菌水或无菌的1x TE重悬酵母。
9.在1000g室温（20～21°C）条件下离心5min10.轻轻倒出（弃去）上清11.将细胞重悬于1.5ml新鲜准备的，无菌的1xTE/1xLiAc（在实验开始之前置备）(至此酵母感受态细胞制备完毕)12. 向无菌的1.5ml微量离心管中加入质粒DNA各0.1ug和0.1mg鲱鱼精载体DNA，之后轻轻混匀。
13.再向每管中加入0.1 ml 酵母感受态细胞，并且震荡混匀。
14.向每一管加入600 ul无菌PEG/LiAc溶液，高速振荡混匀。
15.30℃摇床以200 rpm的转速振荡培养30 min16.向每一管加入70 ul DMSO 轻轻颠倒混匀，不要震荡。
17.42℃水浴热激15 min18.取出后在冰上冷却1-2 min19.1000 rpm室温离心5 min，弃去上清。
20.用0.5 ml 无菌的1×TE重悬酵母。
21.取合适体积的菌液（一般是100 ul）涂在选择性的SD培养基的平板上，在30℃培养箱中培养2-4天。
（将克隆分成三份涂与不同平板上，1/3涂在SD/–His/–Leu/–Trp，1/3涂在SD/–Ade/–His/–Leu/–Trp，最后1/3涂在SD/–Leu/–Trp上。
）（科内仅涂布二缺与四缺板）（在21步之后涂一个二缺板和一个四缺板）因为在二缺板中AH109能生长，说明BD和AD已经转进去了。
如果在四缺板中能生长，说明诱饵和文库肯定有作用，接着做一个α- gal 实验。
如果是将质粒转到Y187中的话，21步之后涂一个二缺板就行了。
如果酵母能生长的话就接着做一个β- gal。
所以有的人同时转化两种菌种。
这样就完全可以确定两蛋白是否有作用了。
之后计算转化率，如果转化率达到10的6次方以上，那么就可以接着做后面的检验实验。
三. α和β-gal实验：（我就做β-gal试验，要注意如果做β-gal的话，这时候菌种要换成Y187，而不是之前的AH109）（在protocol 的24～28页）1.试剂：2.原理：◆ONPG为无色物质，在β-半乳糖苷酶的作用催化下生成黄色的onitrophenol(硝基苯酚)，在420 nm (OD410)处有光吸收。
◆Na2CO3可以提高PH值，使酶变性，从而终止反应。
（Na2CO3在配制时，不需要高压）3.实验方法一. Colony-lift Filter Assay（滤膜分析或滤膜试验）（这是定性试验）a)将要测试的菌株（直径1-3mm）转接到新的选择性SD培养基中，30℃培养2-4天。
