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限制性酶解改性鲢鱼肌原纤维蛋白功能性质的研究刘书来;周欢;何小庆;刘建华;丁玉庭【期刊名称】《核农学报》【年(卷),期】2017(31)1【摘要】为了提高肌原纤维蛋白的功能,采用不同酶(胰蛋白酶、中性蛋白酶及复合酶)对鲢鱼肌原纤维蛋白进行限制性酶解改性,在酶解过程中,通过对水解度、蛋白分子量大小、肌原纤维形态学变化及功能性质进行测定与观察,探究其功能性质随改性程度的动态变化规律。
结果表明,随着酶解的进行,鲢鱼肌原纤维长度逐渐变短,蛋白的溶解性逐渐增加,酶解80 min时,肌原纤维主要以1~3个肌节形式存在,3组蛋白质的溶解性分别达到61.2%、36.9%和58.4%;3组酶解蛋白的乳化性和起泡性随反应时间的增加均呈先增后减的趋势,其中复合蛋白酶酶解40 min时乳化活性及起泡性最大,分别达到65.5m2·g-1和110%,胰蛋白酶改性20min时蛋白乳化稳定性最好,可达46.6 min,远大于未酶解蛋白的14.7 min。
分子量分布及SDS-PAGE图谱显示,蛋白平均分子量均为20~30 k Da,水解度均低于5%。
综上,酶的选择对溶解性的改善至关重要,而乳化性及起泡性的改善不仅需要对酶进行筛选,还需对水解度进行严格限制,保持酶解后蛋白具有较大的分子量,避免酶解过度。
本研究结果为蛋白质乳化性和起泡性的改性研究提供了参考。
【总页数】8页(P110-117)【关键词】肌原纤维蛋白;限制性酶解;溶解性;乳化性;起泡性【作者】刘书来;周欢;何小庆;刘建华;丁玉庭【作者单位】浙江工业大学海洋学院食品科学与工程系;浙江工业大学海洋研究院【正文语种】中文【中图分类】S984.1【相关文献】1.鲢鱼中肌原纤维蛋白酶法水解的研究 [J], 黄敏;周程;严奉伟2.限制性酶解乳清蛋白功能性质研究 [J], 刘颖;刘丽宅;于晓红;付薇;张丹;窦博鑫3.鲢鱼肌原纤维结合型丝氨酸蛋白酶的研究 [J], 曹敏杰;李燕;翁凌;王锡昌4.双酶法对大豆浓缩蛋白限制性酶解及其功能性质研究 [J], 张娜;曲玲玲;刘晓飞5.大豆分离蛋白的限制性酶解及其功能性质研究 [J], 李胤静;张娜;杨宝柱;刘雪梅;陈迪因版权原因，仅展示原文概要，查看原文内容请购买。
鲢冻结过程中肌肉组织及蛋白质的变化
缪宇平;乔庆林;裘塘根;陈琪
【期刊名称】《中国水产科学》
【年(卷),期】2001(008)002
【摘要】以鲜活鲢为研究对象，从肌肉组织冷冻切片、盐溶蛋白、Ca2+-ATP酶活性等角度研究在缓慢冻结条件下鲢的冷冻变性情况，并探讨鲢冷冻变性的机理。
结果表明：冻结前后，鲢肌肉纤维组织结构变化十分显著；鲢冻结至-35℃后盐溶蛋白下降了14.8％；Ca2+-ATP酶活性变化则不明显。
【总页数】3页(P85-87)
【作者】缪宇平;乔庆林;裘塘根;陈琪
【作者单位】中国水产科学研究院东海水产研究所,;中国水产科学研究院东海水产研究所,;中国水产科学研究院东海水产研究所,;中国水产科学研究院东海水产研究所,【正文语种】中文
【中图分类】S984.110.2
【相关文献】
1.鲢肌球蛋白胶凝过程中化学键变化与动态流变特性的关系 [J], 刘海梅;夏文娟;王静
2.细胞凋亡过程中核糖体蛋白质S3a水平变化的研究(三)—检测细胞凋亡过程中RPS3a水平的变化 [J], 孙阿萍;马洪星;郑寒松;曹秀华;刘敏;吕学诜
3.冻结速率和冻藏温度对鲢肉蛋白质冷冻变性的影响 [J], 汪之和;王憫;苏德福
4.中华绒螯蟹蜕壳过程中螯足肌肉组织学及主要蛋白质含量变化 [J], 田志环;焦传
珍;吴旭干;成永旭
5.加热过程中虾肌肉组织蛋白酶L的酶活力变化及其动力学 [J], 曹晓杰; 孙钦秀; 魏帅; 刘书成; 吉宏武; 邵海艳; 郝记明; 毛伟杰
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1、水产食品学主要研究内容有哪些？2、简述水产食品原料的营养学特点？3、简述水产食品原料的特性？4、简述我国水产品加工存在的问题？5、简述我国水产加工的重点发展方向？水产食品原料的营养成分一、填空1、鱼类肌肉组织可分为（）（）（），鱼肉的肌肉是由许多（）和一部分结缔组织、脂肪细胞、血管和神经等按一定的顺序排列构成的。
2、鱼肉根据所含肌红蛋白和色素的含量可分为（）和（）。
3、鱼贝类的肌原纤维是由（）和（）组成，前者是由（）蛋白组成，后者是由（）（）（）等组成。
4、新鲜的鱼贝类水分活度为（）。
5、鱼肉蛋白质主要由（）、（）和（）组成。
6、鱼贝类的结缔组织属于（）蛋白，它主要由（）和（）。
7、水产原料蛋白质中（）含量较高，可同谷物类食品配合起到蛋白质互补作用。
8、鱼贝类脂质根绝其作用的不同可分为（）和（）。
9、鱼类的糖原代谢产物是（），而贝类糖原代谢产物是（）。
10、软骨鱼类提取物中含氮成分比硬骨鱼类多，其原因是所含（）和（）较多；红肉鱼提取物中含氮成分比白肉鱼多，其原因是所含（）较多。
11、鱼贝类提取物中的游离氨基酸最重要的是（）和（）。
12、进食不新鲜的红肉鱼容易引起中毒，其原因是（）。
13、鱼贝类中称为咪唑化合物的是（）（）（）（）。
14、鱼贝类的中的核苷酸主要是（），其关联化合物有（）。
15、鱼贝类提取物中冠缨碱类是一类（）物质，分子内均具有（）的结构。
16、板鳃类随着鲜度的下降带有强烈的氨臭味，其原因是（）。
17、TMAO中文名是（），它的还原产物（）是鱼类腥味的主要成分之一。
18、海藻中的主要化学成分是（），其含量大概占干基（）。
19、海藻多糖根据存在部位可分为（）（）（）。
20、海藻多糖根据其来源可分为（）（）（）。
21、红藻细胞间质多糖的本质是（），可分为（）和（）两种类型。
22、琼胶的化学本质是（），它是由（）和（）组成，琼胶中（）含量越高，其凝胶强度越低。
23、卡拉胶的化学本质是（）。
鲢鱼肌原纤维结合型丝氨酸蛋白酶的结构建模、内源抑制剂对接及其钙结合机制冯淳淞;梁释介;罗永康;谭雨青;洪惠【期刊名称】《广东海洋大学学报》【年(卷),期】2023(43)1【摘要】【目的】分析鲢(Hypophthalmichthys molitrix)肌原纤维结合型丝氨酸蛋白酶(Myofibril-bound serine proteinase,MBSP)结构的基础特性。
【方法】使用AlphaFold2对鲢MBSP进行结构建模,通过保守性分析、静电势计算、分子对接等手段探讨鲢鱼MBSP的结构特征,并借助分子动力学模拟研究钙结合对其结构的影响。
【结果与结论】鲢鱼MBSP的活性酶形式含222个残基,有胰蛋白酶样丝氨酸蛋白酶的典型结构特征,但表面充斥着更多赖氨酸,使其表面“粗糙”且利于离子键形成。
62Asn及61Glu是其关键的钙结合位点,钙结合导致的结构变动可传至C端,40His、自溶环、氧阴离子稳定环等关键区域的柔性变化是钙激活机制中的重要部分。
葡萄糖-6-磷酸异构酶二聚体上的10Arg及17Lys是参与鲢鱼MBSP底物结合竞争的潜在关键位点。
除催化活性口袋外,潜在的变构位点亦是MBSP抑制剂设计的可选出发点。
【总页数】8页(P87-94)【作者】冯淳淞;梁释介;罗永康;谭雨青;洪惠【作者单位】中国农业大学食品科学与营养工程学院;中国农业大学食品胶体与功能递送研究中心【正文语种】中文【中图分类】TS254.1【相关文献】1.鱼类肌原纤维结合型丝氨酸蛋白酶研究进展2.鲢鱼肌原纤维结合型丝氨酸蛋白酶的研究3.鲤肌肉肌原纤维结合型丝氨酸蛋白酶的分子克隆4.白鲢肌原纤维结合型丝氨酸蛋白酶单域抗体文本库构建及淘选5.外源蛋白对白鲢鱼糜肌原纤维蛋白结构及其结合特征腥味物质能力的影响因版权原因，仅展示原文概要，查看原文内容请购买。
腌干鲢鱼组织蛋白酶B、L活力变化的响应面法预测研究高瑞昌;苏丽;黄星奕;袁丽;马海乐【期刊名称】《食品科学》【年(卷),期】2012(033)017【摘要】以鲢鱼为原料，进行腌制和热泵干燥加工，研究内源组织蛋白酶B、L活性在加工过程中的变化。
选取加工过程对鲢鱼（Hypophthalmichthysmolitrix）组织蛋白酶B、L活力影响较大的3个工艺参数（温度、pH值、盐质量分数）作为试验因素，并根据酶学特性和干燥过程中各理化指标的测定结果确定其试验水平。
采用响应面法考察此3因素对组织蛋白酶B、L活性的影响，并根据回归方程对腊干鲢鱼加工过程中的组织蛋白酶活力进行预测。
结果表明：回归方程可用于组织蛋白酶B、L实际活力预测；两种酶的潜在活力在加工过程中均呈下降趋势，加工结束时组织蛋白酶B和L的潜在酶活力分别为初始的43．18％和26．08％；通过回归方程对组织蛋白酶B、L在腌制前、腌制后、干燥2d、干燥5d、干燥7d实际活力进行预测，组织蛋白酶B实际酶活力分别为潜在酶活力的36．7％、39．9％、46．5％、46．5％和53．5％，而组织蛋白酶L则为6．6％、5．6％、10．4％、10％和12．6％。
【总页数】5页(P136-140)【作者】高瑞昌;苏丽;黄星奕;袁丽;马海乐【作者单位】江苏大学食品与生物工程学院,江苏镇江212013;江苏大学食品与生物工程学院,江苏镇江212013;江苏大学食品与生物工程学院,江苏镇江212013;江苏大学食品与生物工程学院,江苏镇江212013;江苏大学食品与生物工程学院,江苏镇江212013【正文语种】中文【中图分类】S377【相关文献】1.干腌羊火腿工艺过程部分理化性状的动态变化研究 [J], 王晶;章建浩;杨海燕2.响应面法优化马鲛鱼的干腌工艺 [J], 李湘銮;赵文红;刘巧瑜;白卫东;陈杰;王军喜3.干腌牛肉加工过程中蛋白质变化对品质的影响 [J], 伏慧慧;马雪莲;普莉雯;王念念;袁湖川;黄桂芳;王庆玲4.干腌鱼鲜味物质在不同干腌工艺下的变化及对滋味贡献的研究进展 [J], 梁进欣;李珊;陈晓红;杨娟;赵文红;白卫东5.腌干鱼贮藏过程生物胺的变化及其货架期研究 [J], 陈玉峰;吴燕燕;李来好;杨贤庆;邓建朝;林婉玲;胡晓;荣辉因版权原因，仅展示原文概要，查看原文内容请购买。
鱼类肌原纤维结合型丝氨酸蛋白酶研究进展
杜翠红;曹敏杰
【期刊名称】《食品科学》
【年(卷),期】2013(034)009
【摘要】本文综述鱼类肌原纤维结合型丝氨酸蛋白酶(myofibril-bound serine proteinase,MBSP)的分离纯化、酶学特性、分子生物学及基因重组表达等方面的研究进展.鱼类MBSP是一种弱碱性蛋白酶,它普遍存在于鱼类肌肉中.MBSP降解肌原纤维蛋白是造成鱼糜凝胶劣化的主要原因.同时,由于鱼类MBSP具有良好的热稳定性及对精氨酸或赖氨酸残基羧基端特异分解的底物特异性,因此,该蛋白酶有望开发成为一种新颖的工具酶应用于蛋白质质谱鉴定等研究领域.
【总页数】4页(P336-339)
【作者】杜翠红;曹敏杰
【作者单位】集美大学生物工程学院,福建厦门 361021;集美大学生物工程学院,福建厦门 361021
【正文语种】中文
【中图分类】TS254.1
【相关文献】
1.鲢鱼肌原纤维结合型丝氨酸蛋白酶的研究 [J], 曹敏杰;李燕;翁凌;王锡昌
2.丝氨酸蛋白酶 Pic 在迟缓爱德华氏菌侵染鱼类中的作用 [J], 张璐;张书仁;孙铂光
3.鲤肌肉肌原纤维结合型丝氨酸蛋白酶的分子克隆 [J], 郭川;梁银龙;刘光明;苏文
金;曹敏杰
4.白鲢肌原纤维结合型丝氨酸蛋白酶单域抗体文本库构建及淘选 [J], 周文锦; 屈跃宽; 张; 林洪; 隋建新
5.NaCl对添加丝氨酸蛋白酶的肌原纤维蛋白凝胶特性的影响 [J], 陆益钡;吕春霞;廖慧琦;胡远辉;雷叶斯;曹少谦;杨华
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第13卷 第3期2008年7月集美大学学报(自然科学版)Journa l o f Ji m e iU n i versity (N atura l Sc ience)V o l 13 N o .3Ju.l 2008[收稿日期]2007-08-28 [修回日期]2007-09-25[基金项目]福建省自然科学基金资助项目(B0710024);福建省属高校资助项目(2006F5063);集美大学创新团队基金资助项目[作者简介]杨远帆(1971 ),女,讲师,主要从事农产品贮藏与加工方向的研究.通讯作者:蔡慧农(1957 ),男,教授,从事生物工程方向研究.[文章编号]1007-7405(2008)03-0205-052种蛋白酶对鲢鱼蛋白质的酶解作用杨远帆,倪 辉,陈申如,邹青梅,蔡慧农,黄志勇(集美大学生物工程学院,福建厦门361021)[摘要]为了利用蛋白酶水解低值鱼或鱼加工下脚料生产水解鱼蛋白质,以鲢鱼蛋白质为原料对比研究了原料前处理、底物浓度、酶解时间、产物抑制浓度等对碱性蛋白酶和复合蛋白酶水解鱼蛋白质的影响,并研究了用2种蛋白酶分阶段水解鱼蛋白质的工艺.结果表明,碱性蛋白酶水解鲢鱼蛋白质在p H 8 0时的适宜条件为:温度45 ,酶解时间20m in ,蛋白质质量分数低于6%,产物氨基态氮质量浓度低于2 55g /L ;复合蛋白酶在p H 6 5时的最适水解条件为:温度50 ,酶解时间20m i n ,蛋白质质量分数小于6%,产物氨基态氮质量浓度小于2 25g /L ;用2种蛋白酶分段水解鲢鱼蛋白质可大大提高水解产物的氨基态氮含量,增加水解产物的得率.[关键词]鲢鱼蛋白质;碱性蛋白酶;复合蛋白酶;水解条件[中图分类号]TS 254 1[文献标志码]A0 引言低值水产蛋白质资源主要包括低值鱼和水产加工副产物,这类原料的食用价值和加工价值都很低,因而鲜销价值不高.目前,对低值水产蛋白质资源的利用主要是简单加工成鱼粉,或直接作为饲料,利用价值较低.随着经济鱼类产量的衰退、低值鱼产量的增加及鱼类加工业的发展,低值水产蛋白质原料的总量在渔业中所占的比例越来越高[1].开发新的技术,提高低值鱼和鱼加工副产物的综合利用水平,实现低值水产蛋白质资源综合利用的高值化已经成为渔业增收的重要难题.用蛋白酶水解技术处理低值水产蛋白质资源不仅可以回收优质的鱼类蛋白质,还可以改变鱼类蛋白质的功能特性,生产出许多不同功能特性的水解产物,如鱼蛋白胨、鱼蛋白乳化剂、鱼蛋白发泡剂、鱼蛋白肽、海鲜调味料,等等,是实现水产蛋白质资源功能化、高值化利用的重要技术.鲢鱼(H yp ophthal m ich thy s m o litrix )是一种食用价值较低、产量很大的淡水鱼,研究鲢鱼蛋白质的酶水解技术,并对其酶解蛋白进行氨基酸分子量范围分析,不但对鲢鱼的深加工和高值化利用具有重要的理论和应用价值,而且可以减少资源浪费和环境污染.本文对比研究了碱性蛋白酶和复合蛋白酶水解鲢鱼蛋白质的工艺条件,为鲢鱼蛋白质酶解产物的高值化利用提供了一定的理论依据.1 材料与方法1 1 实验材料1)原料.鲢鱼购于集美菜市场.2)试剂.碱性蛋白酶、复合蛋白酶购于诺维信公司;甲醛、Na OH 、HC l 均为分析纯.集美大学学报(自然科学版)第13卷3)仪器设备.电子天平(Scout Pro ,奥豪斯国际贸易上海有限公司);分光光度计(UV -2000,尤尼柯仪器有限公司);酸度计(P H 211型,北京哈纳科仪科技有限公司);磁力搅拌器(79-1,常州国华电器有限公司);离心机(TD5M -W S,湖南赛特湘仪离心机仪器有限公司);恒温水浴锅(HH -4,国华电器有限公司);冰箱(BCD-215,海尔集团).1 2 实验方法1)原料处理.将鲢鱼去头去骨后切块,用搅碎机绞成糜状,加入9倍体积的水,用HC l 将p H 值调至2 42左右,使蛋白质大部分溶解,滤去不溶物,用N a OH 将滤液pH 值调至5 4,使蛋白质沉淀,5000r/m i n 离心15m in ,收集蛋白质,冷冻干燥备用[2].2)酶解实验.配制鲢鱼蛋白质水溶液和酶液,分别水浴预热5m i n ,二者2!1(体积比)均匀混合,调至合适的p H 值,放入相应温度的水浴锅中水解.反应一定时间后(反应过程中不断用Na OH 溶液和HC l 溶液进行调节,使反应体系维持在所需的p H 值),用移液管吸取5mL 水解液,加入5mL 质量分数10%的三氯乙酸终止反应,测定其游离氨基态氮含量[3-4].以相同条件下先加入三氯乙酸的反应结果作为对照.每个实验及测定均平行3次.3)测定方法.总蛋白质含量:凯氏定氮法[5];氨基态氮含量:甲醛滴定法.2 结果与分析2 1 原料前处理及水解温度对酶水解的影响为了研究前处理及温度对鲢鱼蛋白质酶解的影响,配制质量分数为1%的鲢鱼蛋白质水溶液,分成2份,1份未做任何处理,1份经沸水煮5m i n ,加入质量分数为0 1%的蛋白质酶液,再根据实验需要各自分成若干份,分别置于35、40、45、50、55 条件下水解20m i n ,反应过程中维持体系p H 值不变(碱性蛋白酶反应体系p H =8;复合蛋白酶反应体系p H =6 5).反应结束后测定水解液的氨基态氮含量,结果如图1所示.由图1可以看出,用碱性蛋白酶水解鲢鱼蛋白质,在45 时出现了氨基态氮的峰值;用复合蛋白酶水解鲢鱼蛋白质,在50 时出现了氨基态氮的峰值,这说明用碱性蛋白酶水解鲢鱼蛋白质的最适水解温度在45 左右,而用复合蛋白酶水解鲢鱼蛋白质的最适水解温度在50 左右.相对未变性处理的蛋白质而言,热变性后的鱼蛋白质可能由于高级结构被破坏,酶与蛋白质作用位点之间的接触频率增大,水解产物氨基态氮的含量普遍增加,其增加率见表1,说明热处理变性有利于碱性蛋白酶和复合蛋白酶对鲢鱼蛋白质的进一步水解.表1 鲢鱼蛋白质热处理后在不同温度下水解产物的增加率Tab 1 E ff ec t o f hea t trea t m ent on t heincreas i n g ra t e o f ammon iaca l n itrogen温度/增加率/%碱性蛋白酶复合蛋白酶3520040401145147501717552002 2 底物浓度对酶水解的影响在其他条件固定不变的情况下(加酶量质量分数0 1%,碱性蛋白酶反应体系pH 值8 0,反应时间20m i n ,温度45 ;复合蛋白酶反应体系p H 值6 5,反应时间20m in ,温度50 ),改变体系∀206∀第3期杨远帆,等:2种蛋白酶对鲢鱼蛋白质的酶解作用∀207∀集美大学学报(自然科学版)第13卷 从图4、图5可以看出,当反应体系的底物浓度达到一定值时,继续加入酶粉并没有相应地增加产物浓度和得率;虽然在第一次加酶粉的同时加入适量底物可以使产物浓度增加,但得率却降低了,再次加入酶粉和底物,产物量没有进一步增加,而得率则继续减少.这表明,当产物浓度达到某一程度时,酶对蛋白质的作用程度降低.2 5 2种蛋白酶对鱼蛋白质的分段水解由于不同的蛋白酶对蛋白质作用的位点不同,所以水解产物的分子大小、功能特性及氨基态氮含量都可能不同.为了研究用2种蛋白酶分阶段水解鲢鱼蛋白质的特点,进行两组实验,一组用质量分数6%的鱼蛋白质和质量分数0 1%的碱性蛋白酶液,控制p H 值8 0,45 水解35m i n ,加热灭酶后加入质量分数0 1%的复合蛋白酶粉,控制pH 值6 5,50 反应20m in .另一组用质量分数6%的鱼蛋白质和质量分数0 1%的复合蛋白酶液,先控制pH 值6 5,50 水解35m in ,然后加入质量分数0 1%的碱性蛋白酶粉,控制pH 值8 0,45 水解20m i n ,定时测定体系中氨基态氮质量含量,同时计算得率,结果如图6所示.由图6可以看出,碱性蛋白酶水解后加入复合蛋白酶,产物氨基态氮的质量含量从2 40g /L 增加到2 50g /L ,得率从7 57%增加到7 86%;而复合蛋白酶水解后加入碱性蛋白酶,产物氨基态氮的质量含量从1 97g /L 升至2 57g /L ,得率从6 40%增加到8 09%.也就是说,先复合蛋白酶后碱性蛋白酶的分段水解明显好于先碱性蛋白酶后复合蛋白酶的作用效果,表现为得率的明显提高.从图6曲线的趋势上看,还有提高的可能性,今后可就此做进一步的研究.3 结论1)碱性蛋白酶水解鲢鱼蛋白质在pH 8 0时的最适条件为:酶解温度45 ,酶解时间20m i n ,蛋白质质量分数低于6%,产物氨基态氮质量浓度低于2 55g /L .2)复合蛋白酶水解鲢鱼蛋白质在pH 6 5时的最适条件为:酶解温度50 ,酶解时间20m i n ,蛋白质质量分数小于6%,氨基态氮质量浓度小于2 25g /L .∀208∀第3期杨远帆,等:2种蛋白酶对鲢鱼蛋白质的酶解作用3)用两种酶分段水解鲢鱼蛋白质,尤其是先复合蛋白酶后碱性蛋白酶的水解顺序,可明显提高水解产物的氨基态氮含量,增加水解产物的得率.[参考文献][1]赵玉红,孔保华.鱼蛋白水解的研究进展[J].肉类工业,2000(3):31 34.[2]陈申如,张其标,倪辉.酸法提取鲢鱼鱼肉蛋白质技术的研究[J].海洋水产研究,2004,25(5):61 64.[3]王长云,林洪,周东,等.从鳕鱼碎肉中提取水解蛋白[J].海洋湖沼通报,1995(4):33 39.[4]余杰,陈美珍.酶法制备水解鳗鱼头蛋白及其应用的研究[J].中国海洋药物杂志,2005(5):50 54.[5]王秀奇,秦淑媛,高天慧,等.基础生物化学实验[M ].北京:高等教育出版社,1999.E ffect of Two Proteases on Enzym atic Character forH ydrolysis of Silver Carp Protei nYANG Yuan fan ,N IH u,i C HEN Shen ru ,ZOU Q i n g m e,i C A I H u i nong ,HUANG Zhi yong(Schoo l of B i o techno l ogy Eng i neeri ng ,Ji m e iU n i ve rsity ,X ia m en 361021,Ch i na)Abst ract :Cond itions of enzy m olysis (such as pre treat m en,t te m perat u re ,substrate concentrations ,hydro l y sis ti m e and product concentration)o f silver car p protei n by a lca l a se and m ulti protease w ere studied .The resu lts showed that the opti m u m hydro l y sis conditi o n o f a lca lase fo r silver car p pro tein w as pH 8 0,45 ,20m i n ,protei n concentrati o n belo w 6%,product a m i n o n itrogen concentrati o n belo w 2 55g /L ;t h e op ti m u m hydro lysis conditi o n of m ulti protease w as p H 6 5,50 ,20m i n ,protein concentrati o n less t h an 6%,pr oduct a m ino n itr ogen concentration less than 2 25g /L ;hydro l y sis w ith t w o proteases i n t w o steps could greatly enhance the content o f the a m i n o n itr ogen and i n crease the recover y o f a mm on iacal n itro gen .These results w ere i m po rtant for t h e further utilization of lo w va l u e fish prote i n w ith enzy m atic m e t h ods .K ey w ords :silver carp pro tein ;a lca lase ;m u lti pr o tease ;hydro lysis conditi o n(责任编辑 马建华)∀209∀。
鲢鱼背肌肌原纤维蛋白自溶与内源组织蛋白酶B,L ,H 的关系李树红 张楠 刘欢 马长伟(中国农业大学食品科学与营养工程学院,北京100083)收稿日期:2004205226基金项目:国家自然科学基金资助项目(30371122)作者简介:李树红,博士研究生;马长伟,教授,博士生导师,通讯作者,主要从事畜水产品加工理论与技术研究。
摘 要 鲢鱼鱼糜制品在加工过程中容易发生热诱导(50～70℃)的鱼糜凝胶软化(modori ),导致鱼糜制品品质下降。
为探明原因,本研究比较了在加工过程中漂洗前后鲢鱼鱼肉糜中组织蛋白酶B ,L ,H 活性的变化,结果表明漂洗后仍残留了组织蛋白酶B ,L ,H 活性,其中组织蛋白酶L 活性的残留率最高,为25161%±0182%。
用SDS 2PA GE 分析了有无E 264存在下,鲢鱼背肌肌原纤维蛋白自溶过程中(p H 615,50℃),肌球蛋白重链相对含量的差异,结果显示肌球蛋白重链相对含量的下降趋势与残留的组织蛋白酶活性变化趋势吻合;而且E 264部分抑制了肌球蛋白重链的自溶。
上述结果表明溶酶体半胱氨酸组织蛋白酶在鲢鱼鱼糜凝胶软化中起一定作用,而且组织蛋白酶L 可能是重要的蛋白水解酶。
关键词 鲢鱼;组织蛋白酶;鱼糜凝胶软化;漂洗中图分类号 TS 254 文章编号 100724333(2004)0520071205 文献标识码 APreliminary study of the relationship between autolysis ofsilver carp (Hypophthalmichthys molitrix )myofibrillarproteins and endogenous cathep sins B ,L and HLi Shuhong ,Zhang Nan ,Liu Huan ,Ma Changwei(College of Food Science and Nutritional Engineering ,China Agricultural University ,Beijing 100083,China )Abstract During silver carp s urimi processing ,considera ble gel s oftening often occurs due to heating ,and res ults in poor textural quality of s urimi products.This study was an attempt to investigate the reas on through comp aring the activities of cathepsin B ,L ,H in the silver carp mince before and after washing.Our res ults showe d that there were still s ome cathepsin B ,L ,H activities after washing ,11130%±1127%,25161%±0182%and 6189%±0144%resp ectively.The SDS 2PAGE analysis with and without E 264indicate d that the re duction of the relative quantity of myosin high chain (MHC )was consistent with the rudimentary catheptic activities during autolysis (pH 615,50℃)of silver carp dors al mus cle E 264p artly inhibite d the autolysis of myosin high chain (MHC ).It was s uggeste d that the modori of silver carp s urimi was p artly induce d by the thiol cathepsins in mus cle lys os ome ,esp ecially cathepsin L.K ey words silver carp ;cathepsin;s urimi gel s oftening ;washing 我国鲢鱼(Hypophthal m ichthys molit ri x )资源十分丰富,开发利用潜力巨大,其中以鲢鱼白肌为原料生产色白、低脂、高蛋白的鱼糜制品前景看好。
但是,鲢鱼鱼糜制品在加工过程中容易发生热(50～70℃)诱导的凝胶软化现象(modori ),从而导致鱼糜制品的品质下降[1]。
国外研究表明,鱼糜制品的软化是因内源热稳定蛋白酶水解了肌球蛋白的作用,这些蛋白酶包括溶酶体半胱氨酸组织蛋白酶B ,L 或类L (L 2like ),H 等蛋白酶[2～4]。
然而至今,鲢鱼鱼糜制品凝胶软化现象与内源热稳定组织蛋白酶的关系尚不清楚。
因此,本实验结合鱼糜制品加工过程中常用的漂洗方法,研究了漂洗后鲢鱼鱼糜中组织中国农业大学学报 2004,9(5):71～75Journal of China Agricultural University蛋白酶的残留情况,并通过鲢鱼肌原纤维蛋白在50℃自溶过程中肌球蛋白相对含量的变化,试图探明内源热稳定组织蛋白酶B,L,H与鲢鱼鱼糜凝胶软化的关系。
1 材料与方法111 实验材料鲢鱼(Hypophthal m ihthys molit ri x),市售活鱼,每条900～1200g。
112 实验方法1)鱼肉糜和漂洗鱼肉糜的制备(在4℃下进行)。
活鲢鱼宰杀后,立即去头、去内脏、清洗去皮、剖片、取背部白肌,采得3～6mm3的鱼肉糜颗粒。
然后经2次清水漂洗和1次0115%(质量分数)食盐水漂洗,离心脱水后称重,得漂洗鱼肉糜。
2)组织蛋白酶B,L,H活性的测定。
组织蛋白酶B,L,H活性的测定参考Barrett等[5,6]的方法,并略加改动,操作过程如下:鱼肉糜或漂洗鱼肉糜用4倍体积的50mmol・L-1p H510的乙酸盐缓冲液匀浆,12000×g离心20min,取上清,作为粗提酶液(在4℃下进行)。
分别以组织蛋白酶B,L的特异性荧光合成肽底物Z2Arg2Arg2MCA(Benzyloxycarbonyl2 arginylarginine242methyl272coumarylamide,苄氧羰基2精氨酰2精氨酰2酰胺2甲基香豆素)、Z2Phe2Arg2 MCA(Benzyloxycarbonyl2L2phenylalany2L2arginyl242 methyl272coumarylamide,苄氧羰基2苯丙氨酰2精氨酰2酰胺2甲基香豆素)测定粗提液中组织蛋白酶B,L 的肽水解活性。
取适量的粗提酶液,用Brij35 (Polyoxyethylene23lauryl ether,聚环氧乙烷23月桂醚)稀释至500μL,然后加入250μL014mol・L-1的磷酸盐反应缓冲液(B:p H610;H:p H618;L: p H515),40℃预热2min,然后加入底物(最终浓度为5μmol・L-1)。
40℃准确反应10min后加入1 mL终止液。
用荧光分光光度计RF25300PC(岛津)于激发波长380nm、发射波长460nm下测定AMC (72amino242methylcoumarin,酰氨甲基香豆素)的释放量。
对照管中先加入终止液。
以L2Arg2MCA(L2arginyl242methyl272 coumarylamide,精氨酰2酰胺2甲基香豆素)为底物测定组织蛋白酶H活性,方法同上,但以L2Arg2MCA 为底物测得的酶活性实际为氨肽酶和组织蛋白酶H 共同作用的结果(肌肉中的氨肽酶也可以水解L2Arg2MCA,对H酶活测定产生影响);故为获得组织蛋白酶H的真实活性,本实验向反应体系中添加了半胱氨酸蛋白酶专一不可逆抑制剂E264(Trans2 epoxysuccinyl2L2leucyl2amido(42guanidino)butane,反式环琥珀酰2亮氨酰氨2胍基丁酮),最终浓度为50μmol・L-1进行抑制处理(E264对氨肽酶无作用),处理后降低的活性即为组织蛋白酶H的活性。
一个酶活单位定义为在反应温度(40℃)及反应p H下,1min内能够水解底物并释放出1nmol AMC的酶的物质的量。
3)鲢鱼背肌肌原纤维蛋白的制备及自溶反应。
鲢鱼背肌肌原纤维蛋白的制备参考Ogata等[7]。
鲢鱼肉糜颗粒经4倍体积的磷酸盐缓冲液A (50mmol・L-1p H710)漂洗3次后,再用4倍体积的磷酸盐缓冲液B(50mmol・L-1p H710,011mol・L-1NaCl,012%(质量分数)TritonX2100)匀浆, 3000×g离心15min,沉淀后用等体积的磷酸盐缓冲液C(50mmol・L-1p H715)匀浆,20℃静置30 min,再次离心(3000×g,15min),收集沉淀,作为鲢鱼肌原纤维蛋白(MF)于-80℃保存备用。
取一定量的MF沉淀,按1∶215的比例悬浮于含2mmol・L-1D TT(DL2dithiothreitol,二硫苏糖醇)的100mmol・L-1磷酸盐缓冲液(p H615)中,于50℃进行自溶反应,作为对照组。
E264实验组为向MF溶液中加入最终浓度为50μmol・L-1的半胱氨酸蛋白酶专一不可逆抑制剂E264,以便充分抑制MF溶液中残留的组织蛋白酶B,L,H活性。
不同时间间隔,分别从对照组和实验组中取样10μL,然后与等体积的终止液(质量分数为2%的SDS,8mol・L-1脲,体积分数为5%的β2巯基乙醇,质量分数为01005%的溴酚蓝,体积分数为20%的甘油,6215 mmol・L-1p H618Tris2HCl)混合,煮沸5min,作为电泳样品。
同时,对照组额外取样400μL,监测自溶过程中残留组织蛋白酶B,L,H活性的变化。
4)SDS2PA GE。
SDS2PA GE参照Laemmli等[8]的方法。
分离胶质量分数为715%,浓缩胶质量分数为4%。
上样量为20μL,约含15μg蛋白质。
样品在浓缩胶中采用稳流(1mA/泳道)方式;待样品进入分离胶后,采用稳压(120V)方式。
电泳结束后,固定染色、脱色参照Neuhoff等[9]方法。
