DNA甲基化检测技术PPT课件

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MS-HRM检测方法及步骤
1. 引物设计：
a) 引物需包含１－２个CpG二核苷酸序列； b) CpG二核苷酸序列应尽量靠近引物的５’端； c) 引物的Tm值应尽量接近，最好控制在１℃内； d) 引物的３’端应包含有１个或多个T碱基，从而确保只有经
过重亚硫酸盐修饰的DNA模板得到扩增； e) 引物不能有二聚体存在； f) 扩增子的长度尽量控制在100bp左右
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DNA甲基化与肿瘤的关系
➢ 肿瘤细胞的特征： 癌基因低甲基化 ——被激活； 抑癌基因高甲基化 ——被沉默 ➢ 甲基化水平与肿瘤生物学特性密切相关，DNA甲基化
水平越低，染色体越容易发生功能异常，肿瘤的浸润能力 就越高，临床分期也愈晚
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常见易被甲基化的抑癌基因与修复基因及其作用
基因
APC
肺癌、脑瘤 非白血性白血病、淋巴瘤、鳞状细胞癌、肺癌
RASSF1A
失去了对G1/S负调控抑制作用
肺癌、乳腺癌、卵巢癌、肾癌、鼻咽癌

Rb
不能抑制DNA复制和细胞分裂必需的基因转录
成视网膜细胞瘤、少突神经胶质(细胞)瘤
VHL
错误的降解RNA结合蛋白质，改变RNA稳定性
肾细胞癌
缩写: APC, adenomatous polyposis coli; BRCA1, breast cancer 1; CDKN2A/p16, cyclin-dependent kinase 2A; DAPK1, death-associated protein kinase 1; ER, estrogen receptor; GSTP1, glutathione S-transferase Pi 1; hMLH1, Mut L homologue 1; MGMT, O-6 methylguanine-DNA methyltransferase; RASSF1A, Ras association domain family member 1; Rb, retinoblastoma; VHL, von Hippel-Lindau; GIT, gastrointestinal tract; NHL, non-Hodgkin’s lymphoma.
用HRM方法检测MGMT启动子区域内的甲基化状态，可检测 低达0.1%的甲基化程度；并且可以根据已知甲基化程度的标准 曲线对未知样品的甲基化百分比进行测定。
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MS-HRM检测技术原理
采用重亚硫酸盐处理DNA模板后，在非CpG岛位置设计 一对针对经亚硫酸氢钠处理后DNA链的引物，这对引物中 间包含有意义的甲基化CpG岛，一旦这些CpG岛发生甲基化， 胞嘧啶不发生变化，而未甲基化的胞嘧啶转变成胸腺嘧啶， 样品中的GC含量发生了变化，最终被转化成了熔解曲线Tm 值之间的差异。CpG位点在小的扩增片段内的相对位置也 会对熔解峰的形状产生影响，因此，根据Tm值和熔解峰的 形状可以检测出样本的甲基化位点和甲基化程度．
BRCA1 CDKN2A/p16 DAPK1
基因沉默对肿瘤的意义
肿瘤类型
对细胞增殖、迁移、粘附、骨架重组及染色质稳定性 乳腺癌、肺癌、食管癌、结肠癌、胃癌、胰、 肝
失去调节作用
癌
与DNA 修复与转录激活有关 周期素依赖性蛋白激酶抑制剂
乳腺癌、卵巢癌 GIT 、头与颈部瘤、NHL、肺癌
钙/钙调素-依赖的丝氨酸/苏氨酸磷酸化酶; 凋亡抑制 肺癌
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3、损伤与修复
一方面参与凋亡和修复的基因受DNA 甲基化调控,另一方面异常甲 基化往往会导致DNA 的多种损伤。此外 ,甲基化还可能直接参与DNA损 伤的识别和修复过程.
4、其他 ：
甲基化还参与DNA 的复制和包装及 DNA片段的转座等。
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基因组甲基化的特点：
可逆性——许多甲基化位点可以根据细胞活性的要求重新 甲基化或去甲基化； 组织特异性——不同的组织细胞具有不同的甲基化模式， 为基因表达设定程序。 异常的甲基化可分为高甲基化和低甲基化 ，前者指正常 组织中不发生甲基化的位点被甲基化 ，后者是指在正常组 织中发生甲基化的位点去甲基化。
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MS-HRM检测结果分析
Figure 4. The MS-HRM assay for BNIP3 methylation. Results of the BNIP3-MS-HRM assay for five clinical samples compared to the dilution standards. Samples 1–5 show different methylation levels. The samples have been distributed over three panels to help distinguish the individual samples.
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MS-HRM检测方法及步骤
1. 引物设计：
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MS-HRM检测方法及步骤
2. DNA样本的准备：
可使用新鲜组织或石蜡组织样本，一般不使用血液样本；
3. 仪器选择（一般可进行HRM分析的仪器均可）：
如LightCycler480 (Roche), RotorGene6000 (Corbett Research), Applied Biosystems 7500 FAST real-time PCR system(Applied Biosystems), LightScanner System and the HR-1 instrument(Idaho Technologies).
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CpG island的功能：通过甲基化与去甲基化，调控下游基因的表达 —— 基因表达的调控开关
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DNA甲基化的生物学意义
1、转录抑制
基因启动子 区的甲基化可影 响转录激活因子 和其识别序列 的结合.
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DNA甲基化的生物学意义
2、影响基因表达
直接抑制基因表达 或甲基化的 CpG双核苷 酸序列可被甲基结合蛋 白家族 识别,而后者可通 过吸引补充组蛋白去乙 酞化酶 和组蛋白甲基化 转移酶 等组蛋 白修饰蛋 白质来改变染色质的活 性 ,以间接方式影响基因 表达.
在甲基转移酶的催化下，DNA的CG两个核苷酸的胞嘧啶被选择性地添加 甲基基团的化学修饰现象。
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DNA甲基化的形式：
DNA甲基化主要形成5-mC和少量的N6-甲基嘌呤（N6-mA）及7-甲基鸟嘌 呤（7-mG）
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CpG 岛（CpG Island）
在基因组的某些区域中，通常是基因的启动子区域，5’端非翻译 区和第一个外显子区，CpG序列密度非常高，超过均值5倍以上，成为 鸟嘌呤和胞嘧啶的富集区，称之为CpG岛(CpG Islands, CGIs)。 正常结构基因组中70%～ 90% 的独立CpG 都被甲基化, 未甲基化的CpG 成簇地聚集形成CpG 岛 主要位于结构基因的启动子和第一外显子区域，约有60％以上基因的启 动子含有CpG岛。 — 是结构基因启动子的核心序列和转录起始点
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谢谢！
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知识回顾 Knowledge Review
DNA甲基化检测之 甲基化特异性HRM检测技术 （ Methylation-sensitive high
resolution melting）
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内容提示
➢ DNA甲基化的定义及生物学意义 ➢ MS-HRM检测的原理 ➢ MS-HRM检测的方法及步骤 ➢ MS-HRM检测结果分析
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DNA甲基化的定义
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DNA 甲基化的检测方法
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DNA 甲基化的检测方法 MS-HRM检测技术
目前，甲基化检测的方法很多，例如甲基化特异性PCR， Northern印迹法、Western印迹法、免疫细胞化学等，这些检 测方法由于需要花费大量时间，成本高等等，在临床推广应用 时均存在一定的困难。最新报道了一种基于熔解曲线的高分辨 率熔解（High Resolution Melt，HRM）的新方法，为甲基化 的检测带来了新的曙光。
E-cadherin ER GSTP1 hMLH1
MGMT P15
增强增殖、侵袭与转移 激素抵抗 失去对致癌物活性代谢产物的解毒作用 缺损DNA错配修复,基因点突变
p53-相关基因，与DNA 修复及耐药性有关 细胞的过度激活与增殖
乳腺癌 、甲状腺癌、胃癌 乳腺癌、前列腺癌 前列腺癌、乳腺癌、肾癌 结肠癌、胃癌、子宫内膜瘤、卵巢癌
MgCl2 (25 mM) dNTP（10 mM） 20× Eva-green饱和染料 10μm Primers Template（5ng/μL） Taq酶(5U/μL)
ddH2O
加入的体积（μL） 2
0.4 0.5 1.0 0.5+0.5 1.0 0.2 14.3
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MS-HRM检测方法及步骤
b. PCR-HRM反应程序：
Figure 1 | The effect of the PCR annealing temperature on the sensitivity of the ATM MS-HRM assay. The dilutions of methylated and unmethylated templates are indicated as follows: 100% methylated-red, 10% methylated-blue, 1% methylated-green and 0.1% methylated-brown and unmethylated-black.
过程
温度
时间
循环数 cycles
预变性
95℃
5min
1
95℃
10s
PCR
60℃
15s
50
72℃
25s(收集荧光)
95℃
1min
40℃ HRM