高效液相色谱手性流动相添加剂法拆分佐匹克隆对映体

高效液相色谱手性流动相添加剂法拆分佐匹克隆对映体叶祥喜;宋燕西;陈旭涛;季有知;孙璐璐;吴小倩;杜春燕【摘要】以β-环糊精作为手性流动相添加剂,研究了佐匹克隆对映体在反相高效液相色谱系统中的拆分情况.探讨了β-环糊精浓度、流动相中甲醇含量、流动相pH 值、流动相流速及温度等因素对佐匹克隆对映体拆分的影响.通过采用单一变量法对实验条件进行考察,最终得到了佐匹克隆对映体手性拆分的最佳色谱条件.结果表明:当采用Inertsil ODS-SP(5μ.m,4.6 mm×250 mm)色谱柱,甲醇为有机相,流动相为20mmol/L磷酸二氢钾缓冲液(含15 mmol/Lβ-环糊精)-甲醇(85∶15),流速为0.8 mL/min,pH值为5.5,温度为35℃,紫外检测波长为305 nm,进样量为20 μL 时,佐匹克隆对映体得到良好分离,其对映体的保留时间分别为67.42 min和74.48 min,分离度(R)为1.62.该方法操作简单,灵敏度高,拆分效果理想,且比手性固定相法成本低,从而为佐匹克隆对映体的进一步深入研究提供了一种新方法.【期刊名称】《分析测试学报》【年(卷),期】2014(033)004【总页数】4页(P471-474)【关键词】高效液相色谱法;手性流动相添加剂;佐匹克隆;β-环糊精;对映体分离【作者】叶祥喜;宋燕西;陈旭涛;季有知;孙璐璐;吴小倩;杜春燕【作者单位】东华大学环境科学与工程学院,上海201620;东华大学环境科学与工程学院,上海201620;东华大学环境科学与工程学院,上海201620;东华大学环境科学与工程学院,上海201620;东华大学环境科学与工程学院,上海201620;东华大学环境科学与工程学院,上海201620;东华大学环境科学与工程学院,上海201620【正文语种】中文【中图分类】O657.7;TQ460.72佐匹克隆(Zopiclone)是一种安全性较高的速效催眠药，有催眠、镇静、抗焦虑和抗惊厥等作用，以及延长睡眠时间、提高睡眠质量、减少夜间觉醒和早醒次数等效果，且对呼吸系统的抑制作用极小，因而具有次晨残余作用低的特点［1］。

佐匹克隆的化学名称为6-(5-氯吡啶-2-基)-7-(4-甲基哌嗪-1-基)-羰氧基-5，6-二氢吡啶(3，4-b)吡嗪-5-酮，其分子结构中含有1个手性碳原子，属于手性药物，目前临床上通常以消旋体给药，其结构式见图1。

但近年来的研究证明，与消旋的佐匹克隆相比，右旋佐匹克隆具有更强的药效，且药物不良反应小［2－3］。

因此，对佐匹克隆对映异构体进行拆分研究，建立快速、灵敏、分离效果好的对映体测定方法是一个具有理论和实际意义的课题。

迄今为止，关于佐匹克隆对映体拆分的方法主要为手性固定相法［4－5］。

Sangaraju等［6］采用乙酸铵和乙腈为流动相，以纤维素－三(3，5-二甲基苯基氨基甲酸酯)为固定相进行了佐匹克隆对映体的拆分;李海生等［7］采用硫酸铵和乙腈为流动相，以纤维素－三(3，5-二甲基苯基氨基甲酸酯)为固定相进行了佐匹克隆对映体的拆分;丁国生等［8］采用β-环糊精为手性固定相直接拆分佐匹克隆对映体。

手性固定相法虽然操作简单，但手性柱价格昂贵，使用寿命短，消耗大。

此外，剧崙等［9］采用β-环糊精为手性添加剂，利用毛细管电泳法对佐匹克隆对映体进行了拆分。

近年来，β-环糊精及其衍生物在高效液相色谱方面得到了越来越广泛的应用［10－15］。

本实验采用β-环糊精为流动相添加剂，以甲醇为有机相，C18柱为固定相，采用高效液相色谱法对佐匹克隆手性对映体进行拆分，并对β-环糊精浓度、甲醇比例、流动相pH值、流速和柱温等影响因素进行了优化，得到了理想的分离效果。

此方法操作简单，灵敏度高，拆分效果理想，且比手性固定相法经济。

图1 佐匹克隆的化学结构式Fig.1 Chemical structure of zopiclone1 实验部分1.1 仪器与试剂LC-20AT高效液相色谱仪(Shimadzu);SPD-20A紫外检测器;Rheodyne7725型手动进样阀;CTO-10ASvp柱温箱(Shimadzu);PHS-9V型酸度计(杭州华光无线电厂);FA1004型电子天平(上海恒平科学仪器有限公司)。

佐匹克隆(上海共价化学科技有限公司);β-环糊精(生化试剂，国药集团化学试剂有限公司);甲醇(色谱纯，上海凌峰化学试剂有限公司);磷酸、氢氧化钾(分析纯，国药集团化学试剂有限公司);磷酸二氢钾(优级纯，国药集团化学试剂有限公司);实验用水为二次重蒸水。

1.2 色谱分离条件色谱柱:Inertsil ODS－SP(5 μm，4.6 mm×250 mm);流动相:20 mmol/L磷酸二氢钾缓冲液(含15 mmol/L β-环糊精)－甲醇(85∶15，pH 5.5);流速:0.8 mL/min;紫外检测波长:305 nm;进样量:20 μL;柱温:35℃。

1.3 佐匹克隆溶液及流动相的配制精密称取佐匹克隆1.0 mg，置于20 mL容量瓶中，加入甲醇溶解并稀释至刻度，摇匀后于4℃避光保存，作为储备液。

进样前经0.22 μm的微孔滤膜过滤。

流动相使用前经0.22 μm的微孔滤膜过滤并超声脱气。

2 结果与讨论2.1 磷酸二氢钾浓度的影响流动相中加入缓冲盐有调节pH值、改善峰形和分离效果的作用，当流动相中未添加缓冲盐时，色谱峰形较差且分离度不佳［16］。

本实验考察了几种无机盐的效果，发现使用磷酸二氢钾时的分离效果最佳，且在10～30 mmol/L范围内改变磷酸盐的浓度时，对映体的容量因子随盐浓度的升高而降低，分离度逐渐增大。

这是因为无机盐的存在能增加环糊精包合物的稳定性，提高手性识别能力。

同时适量的盐也有利于提高β-环糊精的溶解度。

但高浓度的磷酸盐会对色谱柱和色谱仪造成损害。

综合考虑，在保证分离度的前提下，选择磷酸二氢钾的最佳浓度为20 mmol/L。

2.2 β-环糊精的手性识别机制β-环糊精是由多个葡萄糖分子以α-1，4糖苷键相连的七元环状低聚糖化合物，其分子中空并呈“V”型圆桶状构造。

组成β-环糊精的每个葡萄糖单元有5个手性碳原子，因而作为主体分子能够提供给客体分子良好的不对称环境［17］。

其手性识别机制主要是溶质手性碳原子附近的芳香环能够嵌入β-环糊精的疏水性空腔中形成包合物，而手性碳原子上的极性基团能与β-环糊精空腔开口处的手性碳原子上的羟基形成氢键，通过两对映体与β-环糊精结合的程度不同，形成非对映体络合物之间的保留差异和稳定性差异，从而实现对映体的分离。

2.3 β-环糊精浓度对分离度的影响β-环糊精浓度对手性分离起着重要作用，一般随着β-环糊精浓度的增加，手性对映体的分离度逐渐增大(见表1)。

由表1可知，当β-环糊精的浓度为8 mmol/L时，佐匹克隆对映体的分离度为0.80;当β-环糊精的浓度增至15 mmol/L时，可实现基线分离，此时分离度为1.62;继续增加β-环糊精的浓度至20 mmol/L时，对映体的分离度并未继续增大(R=1.54)，而是保持在一个相对稳定的范围内。

这是因为随着β-环糊精浓度的增加，其与佐匹克隆的作用增强，佐匹克隆对映体与β-环糊精生成的非对映体络合物保留值差异增大。

分离因子α为热力学参数，只与流动相、固定相、溶质性质及温度有关。

在本实验中，溶质、固定相、温度均保持不变，随着流动相中β-环糊精浓度的增加，分离因子逐渐增大。

但由于β-环糊精的溶解度较小，浓度过高时易从流动相中析出，损害色谱系统，且高浓度的环糊精会增大流动相的黏度，进入色谱系统后柱压的上升速度加快，不利于色谱柱的使用寿命。

因此，最终选择15 mmol/L β-环糊精对佐匹克隆对映体进行分离。

表1 β-环糊精浓度与分离度的关系Table 1 Influence of β-CD concentrationon the separationConcentration of β-CD c/(mmol·L －1) Capacity factor(kS) Capacity factor(kR) Resolution(R) Selective factor(α)8 15.76 15.05 0.80 1.04 12 15.97 15.03 1.07 1.06 15 17.23 15.50 1.62 1.11 20 18.75 16.94 1.54 1.11 2.4 流动相中甲醇含量对分离度的影响固定磷酸二氢钾浓度为20 mmol/L，β-环糊精浓度为15 mmol/L，水相pH值为5.5，改变甲醇和水相的相对含量，测定佐匹克隆对映体的保留值，并计算容量因子及分离度，结果见表2。

当甲醇的比例在13%～30%之间变化时，随着甲醇含量的降低，流动相的洗脱强度减弱，使佐匹克隆对映体与β-环糊精的作用时间延长，容量因子逐渐增大，分离度随之增大。

当甲醇含量为15%时，佐匹克隆对映体可实现基线分离，分离度(R)为1.62;增大甲醇含量时，保留时间逐渐减小，但分离度逐渐下降，当甲醇含量增至20%时，分离度(R)降至0.86;但当甲醇比例降低至13%时，分离度开始下降，这可能是由于保留时间延长，扩散作用使得峰变宽，导致分离度下降。

表2 甲醇含量与分离度的关系Table 2 Influence of methanol on the separationPercentage of methanol(%) Capacity factor(kS) Capacityfactor(kR) Resolution(R) Selective factor(α)13 17.35 16.07 1.46 1.10 1517.23 15.50 1.62 1.12 17 13.33 12.32 1.36 1.10 20 7.72 7.25 0.86 1.09 30 0 5.05 0 02.5 流动相pH值对分离度的影响在20 mmol/L磷酸二氢钾缓冲液(含15 mmol/L β-环糊精)－甲醇(85∶15)流动相体系中，用磷酸和氢氧化钾分别将其调至不同pH值，在最佳色谱分离条件下分离佐匹克隆对映体，其分离度与pH值的关系为:当流动相pH值在4.5～5.5之间变化时，随着pH值的增大，分离度逐渐增大;当pH值达到5.5时，分离度达最大值，继续增大pH值，则会导致分离度逐渐减小;当pH值为6.0时，分离度降至1.26。

这可能是由于佐匹克隆为弱酸性物质，适当的酸性条件有利于该物质的分离。

2.6 温度对分离度的影响温度对佐匹克隆对映体的分离具有显著影响。

保持其它实验条件不变，随着温度的升高，佐匹克隆对映体的分离度逐渐变小。

这是由于随着柱温的升高，β-环糊精的疏水性空腔逐渐变大，对映体与β-环糊精结合的络合物稳定性逐渐减小，降低了其手性识别作用，导致其保留时间差异减小，从而影响了对映体的分离度。