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锦鲤致病性假单胞菌的分离鉴定及生物学特性研究周阳;庄国庆;林锋;蒋廷亚;袁少飞;高力;施海峰【摘要】从发病的外塘锦鲤的肝、膊、肾等组织中分离到大量优势生长的细菌,经表型特征分析和16S rDNA序列测定,发现该菌为假单胞菌(Pseudomonas sp.).通过对正常的锦鲤进行人工感染试验,7d后锦鲤全部死亡,症状与自然发病症状相似,表明该菌对锦鲤有致病性;用含有抗生素的20种药敏纸片进行药敏实验,发现该假单胞菌对庆大霉素、卡那零素、妥布霉素高敏,对诺氯沙星、环丙沙星、阿米卡星中敏,对其他14种抗生素有耐药性.本研究旨在为锦鲤致病性病原的确定和防治提供参考依据.【期刊名称】《西南农业学报》【年(卷),期】2015(028)004【总页数】4页(P1830-1833)【关键词】锦鲤(Cyprinus carpio koi);假单胞菌(Pseudomonas sp.);16S rDNA;药敏试验【作者】周阳;庄国庆;林锋;蒋廷亚;袁少飞;高力;施海峰【作者单位】江苏大学生命科学研究院,江苏镇江212013;四川省林业科学研究院,四川成都610081;浙江省淡水水产研究所农业部淡水健康养殖重点实验室,浙江湖州313001;江苏大学生命科学研究院,江苏镇江212013;江苏大学生命科学研究院,江苏镇江212013;江苏大学生命科学研究院,江苏镇江212013;江苏大学生命科学研究院,江苏镇江212013【正文语种】中文【中图分类】S941.4锦鲤(Cyprinus carpio kio)在生物学上属于鲤科(Cyprinidae)，是一种风靡全球的亚热带、温带观赏鱼类，近年来在世界各地得到广泛地养殖，在中国养殖面积也是逐年扩大。
但是由于整体水环境的恶化，养殖的高密度性以及养殖方式的粗放，导致锦鲤病害频发，死亡率较高。
常见的病害主要分为病毒性、细菌性和寄生虫3种，其中又以病毒和细菌性的为重，已报道的病毒病主要由鲤春病毒引起的鲤春病毒血症[1～2]、锦鲤疱疹病毒引起的锦鲤疱疹病毒病[3～5]，一旦发生，很难进行有效控制;常见报道的细菌病主要致病性嗜水气单胞菌[6]、维氏气单胞菌[7]、摩根氏菌[8]等，由于细菌种类的复杂性、多样性，在一定条件下给锦鲤养殖业造成极大的损失。
鲫鱼细菌性出血病致病菌的分离鉴定及药敏研究作者：暂无来源：《渔业致富指南》 2019年第12期鲫鱼出血病,一般认为由嗜水气单胞菌引起,嗜水气单胞菌感染鲫鱼后,在鱼体质变差和水质恶化时,在鱼体内快速增殖,引起全身出血的症状。
目前治疗出血病主要还是依靠投喂抗生素,但生产中多数养殖户根据以往经验使用抗生素,往往效果较差,疾病难以快速治愈,不仅造成养殖户的损失,还导致鲫鱼抗生素超标,影响食品安全。
江苏大丰某鲫鱼精养塘口2018年8月初开始发病,我们取样分离病原菌并鉴定,对分离的病原菌进行药敏试验,以指导养殖户科学用药,得到良好的治疗效果。
1 材料与方法1.1 材料发病鲫鱼2018年8月取自大丰鲫鱼精养塘口,200g左右,发病期间出现鲫鱼持续死亡,死亡鲫鱼体表充血,腹腔内有腹水,初步诊断为鲫鱼出血病。
试验用药敏纸片采购自杭州微生物试剂有限公司;PCRMix、溴化乙锭(EB)、Marker 2000、细菌基因组提取试剂盒采购自北京艾德莱;用于扩增嗜水气单胞菌的引物由上海生工合成;微生物培养基为脑心浸液培养基(BHI),pH7.4±0.2,采购自OXOID。
1.2 致病菌的分离在超净工作台中,用酒精灯灼烧后的接种环从患病鱼肝、肾、脑等组织处取样,涂布在培养基平皿上,30℃培养24小时。
挑选优势菌落接种于斜面培养基,30℃培养24 小时,4℃冰箱保存备用。
1.3 回归攻毒实验将分离到的致病菌接种到BHI液体培养基中,30℃培养24小时,用生理盐水将菌液稀释至108cfu/mL备用。
取健康鲫鱼60尾,随机分为两组,每组30尾。
试验组每尾注射0.2mL菌液,对照组每尾注射0.2mL生理盐水,饲养10天,每天捞出死亡鲫鱼,记录死亡数量,并对死亡鱼进行细菌分离。
1.4 致病菌鉴定按照细菌基因组提取试剂盒说明书,提取从患病鲫鱼和攻毒死亡鲫鱼上分离到的致病菌DNA,使用嗜水气单胞菌16S rDNA引物扩增致病菌DNA,正向引物F:GCGGGTACGACGCACCTTGC、逆向引物R:CAGCGTCCAATACCTGGTGTTA,目的片段长度为1091bp,扩增条件为: 94 ℃预变性4 min, 94 ℃变性50 s,59 ℃退火30 s,72 ℃延伸60 s, 30 个循环,最后72 ℃延伸10 min。
浦口区草鱼、鲫鱼致病菌的分离鉴定和耐药性分析张仁展; 蔡德森; 江青松【期刊名称】《《水产养殖》》【年(卷),期】2019(040)010【总页数】4页(P44-47)【关键词】细菌; 分离; 鉴定; 药敏; 耐药性【作者】张仁展; 蔡德森; 江青松【作者单位】南京市浦口区水产技术指导站江苏南京211800【正文语种】中文【中图分类】S943浦口区共有水产养殖面积2 400 hm2，其中常规鱼养殖分布在永宁、汤泉和星甸街道，以草鱼、鲫鱼为主，面积约680 hm2。
每年细菌性病害对浦口区草鱼和鲫鱼的养殖都会造成一定损失，为了解致病菌的耐药情况，从不同养殖地点采集草鱼和鲫鱼，分离体内致病菌，同时进行体外药敏试验，为全区水生动物细菌性疾病的科学用药提供理论基础。
1 材料与方法1.1 样品采集2017年6月—2018年10月，在各养殖集中区池塘共采集草鱼发病样品9个、鲫鱼发病样品26个。
分别取肝、肾或脾进行细菌培养分离。
1.2 主要试剂非苛养非肠道革兰氏阴性杆菌鉴定试剂盒（API 20NE）购自上海嘉合生物科技有限公司。
药敏板购自南京菲恩医疗科技有限公司，营养琼脂、RS琼脂、脱脂奶蔗糖胰蛋白胨琼脂培养基购自北京陆桥生物技术有限责任公司。
1.3 菌株分离与纯化使用灭菌棉签蘸取发病样品肝脏、肾脏或脾脏，均匀涂布于营养琼脂培养基，28℃培养18～24 h，分离出单个菌落，并用接种环挑取单菌落，继续划线接种于营养琼脂培养基，28℃培养18～24 h，进一步纯化。
1.4 菌株致病性判断经2次分离纯化后的菌落，接种于脱脂奶蔗糖胰蛋白胨琼脂培养基，28℃培养18～24 h，若菌落周围出现清晰、透明的溶蛋白圈，则判定为具有致病性。
1.5 菌株鉴定用接种环挑取纯化后的单菌落于生理盐水中，制成0.5 MCF的菌悬液，按操作要求将菌悬液分别接种到细菌鉴定试剂条（API 20NE）小管中，于30℃培养18～24 h。
取试剂条与结果读取表比对得出反应结果数据，通过API 20NE菌谱检索手册得到鉴定结果。
假单胞菌的分离鉴定方法我折腾了好久假单胞菌的分离鉴定方法，总算找到点门道。
咱先说分离吧。
我最开始就是到处找可能有假单胞菌的样本，就像在大海捞针一样。
我试过土壤样本，那采集土壤就有不少讲究。
你不能只取表面的土，得挖深一点，好比你要找藏在深处的宝藏似的。
取回来的土样要放到合适的培养基里。
我在这就犯过错，最开始随便找了个培养基，结果啥都没长出来。
后来才知道假单胞菌喜欢那种有特殊营养成分的培养基，像那种有特定氮源、碳源的。
假单胞菌在培养基上生长的时候，那感觉就像种子发芽一样，慢慢会出现一些菌落。
但是这里面可能有别的杂菌一起长，要把假单胞菌单独挑出来又是个麻烦事儿。
我有时候就看错了，以为某个菌落就是假单胞菌，结果不是。
我后来就用个笨方法，多观察那些菌落的形态，假单胞菌的菌落形态有些特点的，比如说边缘比较光滑之类的，我就这样一个一个去比对，就像大海里挑鱼儿一样挑出来疑似的再去进一步鉴定。
再说到鉴定，这可就更难了。
我试过一些生化鉴定的方法。
有那种测各种酶活性的试验，我当时做的时候晕头转向的。
因为要加好多试剂，一个步骤错了，结果就完全不一样了。
比如说测某种氧化酶的时候，那个试剂添加的量得很精确，就像厨师做菜放盐一样，多一点少一点都不行。
还有就是用分子生物学方法来鉴定，像16S rRNA测序这种。
这听起来就很高级很复杂。
我在准备样本的时候就总是搞不清最恰当的浓度，有时候浓度太高了，测序结果一团糟。
其实这就跟配药一样，要按照准确的比例把样本准备好。
其实我现在也不敢说完全掌握了假单胞菌的分离鉴定方法。
但是我觉得多做试验，多记笔记，把每次失败的原因都写下来很重要。
就像你走路，走一次错的路，下次就知道别踩这个坑了。
要是你刚开始做假单胞菌的分离鉴定，别怕犯错，胆子大一点，多去试试不同的方法，说不定运气好就搞成了呢。
还有啊，遇到复杂的步骤多去看看书或者问问有经验的人，这就跟你迷路了问路一样，总能得到点有用的东西。
鲫鱼恶臭假单胞菌的分离鉴定及药敏分析陈诗宇; 王利【期刊名称】《《水产养殖》》【年(卷),期】2019(040)010【总页数】4页(P25-28)【关键词】恶臭假单胞菌; 16S rDNA基因; 系统进化; 药敏分析【作者】陈诗宇; 王利【作者单位】西南民族大学生命科学与技术学院四川成都610041【正文语种】中文【中图分类】S947恶臭假单胞菌（Pseudomonas putida）是一种革兰氏阴性、需氧短杆菌，属于假单胞菌科（Pseudomonadaceae）、假单胞菌属（Pseudomonas）[1]。
恶臭假单胞菌是一种具有腐化作用的细菌，广泛分布于土壤及自然水体中[7]。
恶臭假单胞菌为淡水鱼的一种致病菌，常从腐败的鱼中检出[2]，严重影响了水产养殖业的健康可持续发展[3]。
恶臭假单胞菌可引起中华绒螯蟹爪无力[4]、杂交鲇皮肤褪色、溃烂[5]、大鲵死亡[6]、杂交鲟肠炎[7]及黑鲷腹水病[8]。
恶臭假单胞菌也是一种人-禽-鱼共患的病原菌[7]，能够引起鸭[9]等禽类发病并且导致人食物中毒[10]。
1998年，李庆山[10]等首次发现恶臭假单胞菌引起的食物中毒。
鲫鱼（Carassius auratus）为常见淡水鱼，随着水产养殖的发展，鲫鱼逐渐受到许多病原菌的感染，其中恶臭假单胞菌的感染日趋严重。
该试验从鲫鱼中分离得到菌株SY4，并进行了形态学观察、生理生化鉴定、16SrDNA基因分析以及药敏试验等研究。
这为进一步研究恶臭假单胞菌特性提供参考。
1 材料与方法1.1 试验鱼样品鲫鱼取自四川省成都市某养殖场，体长18 cm，体质量164 g。
1.2 主要仪器及试剂显微镜购买自LEICA BME公司，恒温培养箱购买自上海齐欣科学仪器科技有限公司，PCR仪购买自Eppendorf Germany公司，生化鉴定药品、抗菌药物纸片均购买自杭州微生物试剂有限责任公司，电泳仪、凝胶成像系统均购买自BioRAD公司，TaqMix、DL2000 DNA Marker均购买自北京天根生化科技有限公司。
