奈瑟菌的分离和鉴定

附件7 脑膜炎奈瑟菌实验室检测操作规范一、脑膜炎奈瑟菌鉴定程序和标准1、 脑膜炎奈瑟菌细菌鉴定程序脑膜炎奈瑟菌的鉴定通常是通过在CAP 和BAP 上生长物通过革兰染色镜检和生化反应检测以确定是否为脑膜炎奈瑟菌，在此基础上再通过脑膜炎奈瑟菌分群诊断血清进行血清分群。

图xx 脑膜炎奈瑟菌鉴定程序2、 脑膜炎奈瑟菌感染确诊实验室检测疑似流脑病例具有以下实验室检测结果之一，即可确诊：1. 培养：自脑脊液或血液标本中分离到脑膜炎奈瑟菌。

2. 乳胶凝集检测：采用乳胶凝集检测试剂盒，脑脊液标本乳胶凝集检测结果BAP,CAP 生长物革兰氏染色为阴性双球菌氧化酶反应阳性，进行生化鉴定 阴性，非脑膜炎奈瑟生化鉴定（糖氧化）Glu Mal Lac Suc＋ ＋ － －阳性，为脑膜炎奈瑟菌进行血清分群 阴性，非脑膜炎奈瑟菌A 、B 、C 、H 、I 、K 、L 、W135、X 、Y 、Z 、Z ´(29E)不同血清群阳性，目前Bio-Rad乳胶凝集检测试剂盒能检测A群、B群、C群和W135/Y群脑膜炎奈瑟菌感染。

3.PCR检测：脑脊液标本或血液标本PCR扩增特异性脑膜炎奈瑟菌DNA 片段阳性。

通过ctrA基因扩增，鉴定脑膜炎奈瑟菌，通过扩增orf-2、sia D(B)、sia D(C)、sia D(Y)、sia D（W135）等基因片段鉴别不同的血清群，或通过Real-time PCR检测出特异性基因片段阳性。

4.血清IgG抗体滴度4倍增高：恢复期血清抗体滴度较急性期4倍增高。

二、脑膜炎奈瑟菌标本接种培养（一）脑脊液标本1．脑脊液标本预处理脑脊液标本送到实验室后，应立即离心，2000rpm，20min，用巴斯德吸管吸取上清，进行乳胶凝集实验检测抗原。

离心后的沉淀进行剧烈振荡或充分混合。

取1滴沉淀准备革兰染色，1滴划线接种原始培养基。

（注意:如果获得的脑脊液不足1mL则不进行离心，直接用其进行革兰染色和涂板培养）。

《医学微生物学》三大常规的微生物学检查从临床标本中分离细菌的目的是为疾病的病原学做诊断，或查找与疾病相关的微生物，以及对抗生素的敏感性，这对于临床诊断、治疗、预后和进行流行病学调查是很有价值的。

因此，对临床标本的处理和检测应掌握以下原则。

1．临床标本的正确采集和处理对于疾病的正确诊断关系很大。

病人标本一般应在应用抗菌药物前采集。

对血液、脑脊液或穿刺液等标本，应严格按照无菌技术进行采集；对鼻咽拭子、肛拭子、粪便等标本，虽无须严格无菌操作，但也应尽量避免杂菌混入。

2．采集容器上应贴好送检号及病人姓名的标签，连同检验单一起尽早送检验室。

若路途较远，应冷藏保存送检；对脑膜炎奈瑟菌、淋病奈瑟菌等特殊标本，送检时应35℃～37℃保温。

3．人体很多部位与外界相通，存在有正常菌群，但不致病，故在涂片检查或分离培养时，应区别标本中是常居菌群的污染还是致病菌。

另外，对某些无菌的部位，如血液、骨髓、脑脊液等，如检查出细菌应视为致病菌，但必须要排除采样及操作中的污染。

4．根据标本来源和可能存在的病原菌，选定各种分离培养基和孵育环境。

如痰标本一般选用血平板，用于化脓性链球菌、无乳链球菌、肺炎链球菌、白喉棒状杆菌等的分离。

【血液标本检查】正常人的血液是无菌的。

当细菌侵入血流并在其中生长繁殖，产生毒素等，可引起菌血症或败血症。

细菌学检验对其诊断和治疗具有极其重要的意义。

一、标本采集l．标本采集必须严格遵守无菌操作，即应去除皮肤上的细菌，又应注意空气中的细菌。

穿刺部位以碘酒、酒精棉球消毒，用干燥的灭菌注射器抽取血液，立即注入选定的液体培养基瓶内，充分混匀以防凝固。

2．采血一般应在治疗前，并在高热、寒战时作培养。

伤寒在发病一周内即菌血症期间采血；化脓性脑膜炎，鼠疫应在发热1～2d内采血；亚急性细菌性心内膜炎也宜于发热高峰采血或多次采血，且每隔1～2h采血一次，连续3～4次，可获较高的阳性率。

3．采血量应相当于培养液的1／10，通常是50ml培养液采血5ml，这样可使存在于血液中的补体、抗体、调理素、溶菌酶等抑制因子被稀释，使之减弱或失去抑制作用。

微生物检验实验室奈瑟菌属标准操作规程1. 概述奈瑟菌属是一群触酶、氧化酶试验均阳性的革兰阴性球菌，包括脑膜炎奈瑟菌、淋病奈瑟菌、解乳糖奈瑟菌、灰色奈瑟菌、粘液奈瑟菌等11个种，临床上以脑膜炎奈瑟菌和淋病奈瑟菌最为重要。

2.标本类型血液、脑脊液、分泌物、痰、穿刺液、脓液标本。

3.鉴定3.1 形态与染色革兰阴性双球菌，肾形或咖啡豆状，，常成双排列，凹面相对。

色的似露滴状菌落。

3.3生化反应：氧化酶、触酶试验阳性；分解葡萄糖和麦芽糖，不分解蔗糖、甘露醇及乳糖；尿素酶、吲哚及硝酸盐还原试验均为阴性。

3.4鉴别要点：3.4.1本菌特征：革兰阴性双球菌，氧化酶和触酶试验阳性，分解葡萄糖、硝酸盐还原试验阴性。

3.4.2奈瑟菌与相似菌的鉴别；见表5-37。

表5-37 奈瑟菌与相似菌鉴别的关键性试验注：“+”为90%以上菌株阳性，“-”为90%以上菌株阴性，“V”为11%~89%菌株阳性。

3.4..3 淋病奈瑟菌和卡他莫拉菌的鉴别淋病奈瑟菌分解葡萄糖，硝酸盐还原试验阴性，而卡他莫拉菌则相反。

两者虽可根据标本来源加以区分，但并非绝对，因为通过性行为，卡他莫拉菌也可引起尿道炎，而淋病奈瑟菌也能引起咽炎，应引起注意。

涂片不典型，作淋病奈瑟菌培养，同时作普通培养，有细菌生长可排除淋病奈瑟菌。

3.5 操作步骤3.5.1 涂片染色观察菌落特征，在血平板上挑取可以菌落，涂片染色镜检。

3.5.2氧化酶试验参见《触酶试验标准操作规程》3.5.3鉴定从血平板上挑取纯菌落，用微生物鉴定仪或传统生化反应进行细菌鉴定。

4.药敏参见《药物敏感性试验标准操作规程》及CLSI M100-S20最新版本文件.5.质量控制参见《质量控制程序》6.检验结果解释与分析脑膜炎奈瑟菌对青霉素、磺胺类、链霉素和金霉素敏感。

产酶株引起感染应考虑用头孢曲松或头孢噻肟替代。

检出B-内酰胺类酶阳性的淋病奈瑟菌则提示青霉素、氨苄西林、阿莫西林耐药。

7.临床意义脑膜炎奈瑟菌存在于携带者和脑膜炎患者的鼻咽部，通过飞沫经空气传播，冬末春初为流行高峰。

从脑脊液和皮下出血点中对奈瑟菌分离及耐药性分析(宁夏回族自治区中宁县人民医院检验科，宁夏中宁755100)标签：奈瑟茵；脑脊液；皮下出血点对2003年11月～2004年2月来我院就诊的38例头痛和昏迷患者的脑脊液和皮下出血点中的奈瑟菌进行分离鉴定和药敏试验，现将结果报告如下：1．材料与方法1．1标本来源38例患者中，多数为舟塔地区和康滩地区的农民，少部分为本地区居民，按常规留取脑脊液和皮下出血点的血样标本。

1．2材料营养琼脂与羊血制成的血平板及巧克力平板。

质控菌株、奈瑟菌ATCC 49226均购自中国药品生物制品检定所。

1．3分离培养与鉴定用无菌接种环将急送的脑脊液接种到事先预热至37℃的血平板或巧克力平板，同时做皮下出血点取材。

先用碘酒消毒出血点，用无菌针头挑破，挤出少量血液，用无菌接种环接种到血平板，两份标本同时置37℃的5％～10％CO2环境烛缸中进行分离培养，并在烛缸内加入一小块湿棉花，以保持一定的湿度。

经18～24h培养后，挑取典型形态的菌落进行生化鉴定与药敏试验。

本室采用全国临床检验操作规程和医用微生物及微生物检验技术进行鉴定，药敏试验采用卫生部生物研究所药敏试纸片按操作说明的程序进行。

2．结果38例脑脊液和皮下出血点均分离出29株奈瑟菌属细菌，分离率为76.3％，菌别分布。

经分离的菌株在血平板或巧克力平板于37℃培养18～24h，菌落为中等大小(约2mm)，中央隆起、光滑湿润、柔软透明，呈灰白色、稍粘，在血平板上无溶血现象，在血清肉汤中呈均匀混浊生长、微呈颗粒或黏稠沉淀，主要生化特性是能分解葡萄糖、麦芽糖，产酸不产气，能产生靛基酚氧化酶，在盐水中不自凝。

蔗糖、乳糖、果糖、巧克力或血琼脂22℃、多糖合成(碘试验法)DNA酶阴性，我们依照奈瑟菌新的分类法㈣确定为脑膜炎双球菌。

3．讨论脑膜炎双球菌一般寄生于正常人的鼻腔中，此菌由病人或带菌者经飞沫由呼吸道传播。

脑膜炎双球菌的主要致病因素是内毒素，致病性很强。

1. 掌握奈瑟菌的分离和纯化方法；2. 熟悉奈瑟菌的形态学和生化特性；3. 学会运用显微镜观察奈瑟菌的形态；4. 熟悉奈瑟菌的鉴定方法，提高对奈瑟菌的识别能力。

二、实验原理奈瑟菌是一类革兰氏阴性细菌，广泛存在于自然界中，具有多种生物学特性。

本实验通过对奈瑟菌的分离、纯化、形态观察和生化鉴定，实现对奈瑟菌的鉴定。

三、实验材料与仪器1. 实验材料：淋病奈瑟菌培养物、金黄色葡萄球菌标准菌株、兔鲜血琼脂平板、革兰染色液、氧化酶试剂、葡萄糖发酵试剂等；2. 实验仪器：显微镜、恒温培养箱、无菌操作台、接种环、酒精灯、镊子等。

四、实验方法1. 奈瑟菌的分离和纯化（1）将淋病奈瑟菌培养物接种于兔鲜血琼脂平板上，37℃恒温培养18-24小时；（2）用接种环挑取单个菌落，转接至新的兔鲜血琼脂平板上，37℃恒温培养18-24小时；（3）重复上述步骤，直至获得纯化后的奈瑟菌。

2. 奈瑟菌的形态学观察（1）将纯化后的奈瑟菌涂片，进行革兰染色；（2）在显微镜下观察奈瑟菌的形态、大小、排列等特征。

3. 奈瑟菌的生化鉴定（1）氧化酶试验：将纯化后的奈瑟菌接种于氧化酶试剂中，观察是否产生气泡；（2）葡萄糖发酵试验：将纯化后的奈瑟菌接种于葡萄糖发酵试剂中，观察是否产生酸碱反应。

1. 奈瑟菌的分离和纯化：通过反复划线纯化，成功获得纯化后的奈瑟菌；2. 奈瑟菌的形态学观察：在显微镜下观察到奈瑟菌为革兰氏阴性球菌，呈球形或卵圆形，成对排列；3. 奈瑟菌的生化鉴定：氧化酶试验产生气泡，葡萄糖发酵试验产生酸碱反应。

六、实验讨论1. 奈瑟菌的分离和纯化过程中，注意无菌操作，避免杂菌污染；2. 在观察奈瑟菌的形态时，注意观察其大小、形状、排列等特征，有助于鉴定；3. 奈瑟菌的生化鉴定方法较多，本实验选择了氧化酶试验和葡萄糖发酵试验，可根据实际情况选择其他生化鉴定方法；4. 本实验结果与淋病奈瑟菌的生物学特性相符，成功鉴定出淋病奈瑟菌。

七、实验结论通过本实验，我们掌握了奈瑟菌的分离、纯化、形态观察和生化鉴定方法，提高了对奈瑟菌的识别能力。

简述淋病奈瑟菌的鉴定依据淋病奈瑟菌（Neisseria gonorrhoeae）是引起淋病（性传播性感染）的主要病原体之一。

它是一种革兰氏阴性（Gram-negative）的球菌，通常呈呈带有红色或粉红色的两个球状细菌组成的对称排列。

淋病奈瑟菌的鉴定主要依据包括菌落形态、生化试验和分子生物学方法。

下面将详细介绍这些鉴定依据：1.菌落形态：淋病奈瑟菌在特定的培养基上可以生长成典型的菌落形态。

在琼脂洋菜培养基上，淋病奈瑟菌形成类似于晶体的透明或稍微有光泽的菌落，直径通常为1-2毫米。

菌落的表面光滑，边缘整齐。

这种特殊的菌落形态有助于初步鉴定淋病奈瑟菌。

2.生化试验：淋病奈瑟菌可以通过一系列生化试验进行鉴定。

其中常用的试验包括氧化酶试验、卟啉原试验、麦康凯氏氮源利用试验等。

-氧化酶试验：淋病奈瑟菌是氧化酶阳性的，添加氧化酶试剂后，菌落周围出现蓝色或紫色的颜色变化。

-卟啉原试验：淋病奈瑟菌可以产生卟啉原，即添加氯化亚砜试剂后，菌落周围出现红色或粉红色的颜色变化。

-麦康凯氏氮源利用试验：淋病奈瑟菌可以利用麦康凯氏培养基中的氮源来生长，这是淋病奈瑟菌与其他非致病的奈瑟菌的一个重要区别。

3.分子生物学方法：淋病奈瑟菌的分子生物学方法主要包括聚合酶链反应（PCR）和序列分析。

- PCR：PCR是一种可以扩增特定基因片段的技术。

对淋病奈瑟菌的鉴定来说，常用的是扩增菌体中的16S rRNA基因或ompA基因。

通过对扩增产物进行电泳分析，可以确定是否存在淋病奈瑟菌。

-序列分析：从PCR扩增产物中提取DNA，进行测序，并与已知的淋病奈瑟菌序列比对，可以进一步确认鉴定结果。

总结起来，淋病奈瑟菌的鉴定主要依据菌落形态、生化试验和分子生物学方法。

这些鉴定方法的结合使用，可以准确、快速地确定淋病奈瑟菌的存在，并为临床诊断和治疗提供重要依据。

奈瑟菌属送检原则
奈瑟菌属（Nocardia）是一类革兰氏阳性的细菌，广泛存在于
自然环境中，包括土壤和水中。

奈瑟菌属细菌可以引起人和动物的感染，尤其在免疫系统受损的个体中更容易引发疾病。

当临床怀疑病患患有奈瑟菌感染时，可考虑进行送检以确诊和确定适当的治疗方案。

以下是奈瑟菌属送检的一般原则和建议：
1. 根据临床症状和病史选择适当的标本：奈瑟菌感染可以影响不同部位，如肺部、皮肤、软组织和中枢神经系统等。

根据患者的症状和临床表现，选择适当的标本进行送检。

例如，对于肺部感染，可选择痰液或支气管肺泡灌洗液样本；对于皮肤感染，可选择皮肤刮片或分泌物样本等。

2. 采集标本时注意无菌操作：为了确保送检标本的准确性和可靠性，采集标本时应遵循无菌操作的原则，使用无菌容器和工具。

同时，应严格遵守个人防护措施，避免交叉感染。

3. 使用适当的培养基：奈瑟菌属细菌的培养需要使用特定的培养基，如L-J培养基或Thayer-Martin培养基。

这些培养基可
以提供适合奈瑟菌生长和繁殖的条件。

4. 进行适当的培养时间：奈瑟菌的生长速度较慢，通常需要培养约7-14天才能获得可靠的结果。

因此，在进行送检时，需
要进行足够长的培养时间以确保细菌的生长。

5. 进行药敏试验：奈瑟菌感染的治疗通常需要使用抗生素进行
长期治疗。

因此，在送检时还可以进行药敏试验，以确定对哪些抗生素敏感，从而指导临床治疗的选择。

总之，奈瑟菌属的送检原则包括选择适当的标本、采集标本时注意无菌操作、使用适当的培养基进行培养、进行足够长的培养时间以及进行药敏试验。

这些原则可以帮助确诊和指导奈瑟菌感染的治疗。

简述淋病奈瑟菌的鉴定依据
《淋病奈瑟菌的鉴定依据》
淋病奈瑟菌是一种引发淋病的病原体，它是人体内最常见的细菌之一。

淋病是一种通过性传播的感染性疾病，如果不及时治疗，可能会导致严重的并发症。

准确地鉴定淋病奈瑟菌对于淋病的早期检测和治疗至关重要。

以下是关于淋病奈瑟菌鉴定的一些依据。

1.微观形态学：淋病奈瑟菌是革兰氏阴性菌，以其特殊形态学特征而闻名。

在显微镜下观察，
它们呈现为短小、直杆状。

淋病奈瑟菌的尺寸通常在0.3至0.8微米之间。

2.生化特性：淋病奈瑟菌对于鉴定具有特定的生化特性。

例如，它们可以产生丝氨酸酶，它是
一种水解肽键的酶。

此外，淋病奈瑟菌还可以利用葡萄糖、麦芽糖和蔗糖等作为碳源。

3.培养特性：淋病奈瑟菌需要特定的培养条件来生长和繁殖。

它们通常在富含蛋白质的培养基
上生长良好，例如三聚胱乳精（Thayer-Martin）培养基。

此外，淋病奈瑟菌对于氧的需求是微
需氧菌，需在CO2气氛下培养。

4.分子特征：利用基因测序技术，可以对淋病奈瑟菌进行更准确的鉴定。

通过检测其特定的DNA序列，比如16S rRNA基因，可以确定菌株的物种归属。

值得注意的是，上述的鉴定依据仅适用于淋病奈瑟菌的初步鉴定。

为了进一步确认淋病的诊断，通常需要进行更多的检测，如PCR（聚合酶链反应）或培养至菌数量足够，然后进行进一步的特异性检测。

通过准确鉴定淋病奈瑟菌，可以及早诊断淋病并采取有效的治疗措施，防止疾病的传播和并发症的发生。

这对于公共卫生工作来说至关重要，因此淋病奈瑟菌的准确鉴定依据对医疗领域具有重要的指导意义。

奈瑟氏菌鉴定一、目的对某一细菌的鉴定水平，可提供以下几方面的价值：（1）决定治病方法；（2）作流行病学研究；（3）了解细菌与感染的关系；（4）进行学术交流。

二、原理根据奈瑟菌的形态染色、培养特性、生化反应、抗原构造等将奈瑟菌由属鉴定到具体种类。

二、标本不同病种及不同检查目的而定，可为脓汁、渗透液、咽拭子、血、脑脊液、食物、呕吐物、粪便等，置于无菌瓶内送检。

三、试剂及器材革兰氏染液、培养皿、培养瓶、生化鉴定管、标准血清、玻片、接种针（环）、酒精灯等。

四、鉴定程序痰液、组织液脑脊液沉淀物血液带菌者鼻咽拭子宫颈尿（阴）道浓性分泌物涂片染色镜检血琼脂平板血平板血平板（G—双球菌、肾形）巧克力琼脂平板巧克力琼脂平板巧克力琼脂平板（5—10％CO2）（5—10％CO2）CO2（5—10％）35℃CO2（5—10％）35℃初步报告可疑菌落可疑菌落可疑菌落纯培养纯培养纯培养涂片染色镜检、观察菌落涂片染色镜检涂片染色镜检特性（G—双球菌，肾型）（G—双球菌，肾型）（G—双球菌，肾型）氧化酶（+）、触酶（+）氧化酶（+）、触酶（+）氧化酶、触酶葡萄糖（+）、麦芽糖（+）硝酸盐还原（+）不分解糖类葡萄糖均（+）余糖（—）普通平板不生长NA（+），普通平板上生长余糖（—）普通平板上不生长脑膜炎奈瑟氏菌卡他布兰汉氏菌淋病奈瑟氏菌五、实验解释及临床意义a)脑膜炎奈瑟氏菌主要引起人类流行性脑脊髓膜炎。

b)淋病奈瑟氏菌引起淋病、尿道炎、前列腺炎、宫颈炎及新生儿淋病性眼结膜炎。

c)卡他布兰汉氏菌近年来致病性越来越引起关注。

七、全防护措施在操作过程中，要穿好工作衣，戴好口罩、手套，必要时戴眼罩，严格按操作规程，结束后，用次氯酸溶液（0.2%）擦拭实验台、显微镜手柄、载物台，浸泡手，然后紫外线消毒30分钟。

八、标本处理废弃标本，培养基等统一由专门人员高压消毒处理。

九、参考文献诊断细菌学，李仲兴等主编、第一版、香港、黄河文化出版社，1992。