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Brainbow：荧光点亮神经彩虹FranklinWhite发表于 2015-08-28 16:15图片来自：Tamily Weissman, Harvard University上图中的景象不是黑夜中的奇幻梦境，也不是艺术家的创作，而是神经细胞交织成的网络，这些细胞来自一只小鼠脑中的海马区域。
平时我们所见到的大脑标本都是灰白暗淡的颜色，而这种名叫“Brainbow”的技术则显得格外惊艳，神经细胞们个个分明，闪耀着五彩光芒。
另一张展示了小脑结构的“神经彩虹”。
图片来自：Tamily Weissman, Harvard University大脑是如何变成彩虹的？这要从荧光蛋白的故事开始说起。
绿色荧光蛋白：色彩的开端这些美丽的颜色都是荧光，当分子吸收能量达到激发态后，它们会在较短时间内再回到比较稳定的基态，并且通过发光的方式重新释放出能量，这个过程中产生的就是荧光。
在一般的细胞中，原本没有那么多能发出各色荧光的物质，让它们发光，靠的是人为引入的荧光标记。
而在这些荧光标记中，绿色荧光蛋白就是最为经典的一个。
绿色荧光蛋白是来自海洋的馈赠，它来自一种发光水母。
在上世纪60年代，日裔科学家下村修（Osamu Shimomura，下村脩）和美国科学家约翰森（Frank H. Johnson）首先揭开了水母发光的秘密。
一开始，他们从这些水母中提取到了水母发光蛋白（aequorin），在钙离子的作用下，这种蛋白质会发出蓝光。
然而，在水母身上，人们最终观察到的却是绿色的荧光，将蓝光转化为绿光的，就是水母体内的另外一种蛋白质——绿色荧光蛋白。
发出绿色荧光的水母。
图片来自：shiro1000.jp更多的色彩在发现之初，生物学家们就意识到了这种发光蛋白的价值，如果能在其他的细胞、生物组织中引入这样的蛋白质，那么在显微镜下，我们所看到的画面也就能变得更加清晰而且多彩了。
上世纪80年代，普鲁切（Douglas Prasher）成功地克隆出了水母中编码绿色荧光蛋白的基因，这使得荧光蛋白标记的大量应用成为了可能。
第49卷第4期Vol．49No．4山东大学学报（医学版）JOURNAL OF SHANDONG UNIVERSITY （HEALTH SCIENCES ）2011年4月Apr．2011收稿日期：2011-01-07作者简介：陈萌（1985－），女，硕士研究生，主要从事肿瘤病理学研究。
通讯作者：李劲松（1960－），男，副教授，主要从事肿瘤病理学研究。
E-mail jinsong@sdu．edu．cn 文章编号：1671－7554（2011）04－0065－05免疫荧光双标法在小鼠表皮干细胞分子标记筛选中的应用陈萌1，任宁2，刘文君1，秦晓敏1，李劲松1（1．山东大学齐鲁医院病理科，济南250012；2．济南市第一人民医院病理科，济南250011）摘要：目的用标记滞留细胞（LRCs ）及免疫荧光双标记法进行小鼠表皮干细胞可靠分子标记的筛选。
方法选择出生5d 的昆明小乳鼠进行腹腔注射5-溴，2-脱氧尿嘧啶（5-bromodeoxyuridine ，BrdU ），隔日注射，连续7d 。
于注射后第90天进行取材，在冰冻切片上分别进行BrdU 与整合素β1、P63和CD34的双重免疫荧光标记，观察这些标记物与BrdU 的符合度。
结果90d 后小鼠皮肤上皮细胞中仍有少数阳性细胞，主要存在于毛囊的隆突部位，另有少数阳性细胞散落在基底层。
免疫荧光双标的结果示，Brdu 与整合素β1双标阳性的细胞占所有整合素β1阳性细胞的81%，占所有Brdu 阳性细胞的94%；Brdu 与P63双标阳性的细胞占所有P63阳性细胞的65%，占所有Brdu 阳性细胞的86%；Brdu 与CD34双标阳性的细胞占所有CD34阳性细胞的30%，占所有Brdu 阳性细胞的62%。
结论整合素β1与BrdU 的符合率最高，P63其次。
β1和P63是这些分子标记物中筛选干细胞最好的指标。
关键词：标记滞留细胞；表皮干细胞分子标记；免疫荧光双标中图分类号：R322．99文献标志码：AScreening of molecular markers for epidermal stem cells in mice by the double immunofluorescence labeling techniqueCHEN Meng 1，REN Ning 2，LIU Wen-jun 1，QIN Xiao-min 1，LI Jin-song 1（1．Department of Pathology ，Qilu Hospital of Shandong University ，Jinan 250012，China ；2．Department of Pathology ，Jinan First People's Hospital ，Jinan 250011，China ）Abstract ：ObjectiveTo screen reliable molecular markers for epidermal stem cells （ESCs ）in mice by using the doub-le immunofluorescence labeling technique and label-retaining cells （LRCs ）．MethodsThe epidermis was labeled for 7days with 5-bromodeoxyuridine （BrdU ）in postnatal day 5（P5）mice ，followed by a trace period of up to 12weeks．The tissue of the mice was frozen and sliced in a frozen microtome after 90days．Slices were stained with polyclonal antibodies of anti-β1integrin ，P63and CD34and monoclonal antibodies of anti-Brdu ，and then observed under a fluor-oscope．ResultsAfter 90days ，few LRCs were found in a region of the outer root sheath adjacent to the insertion ofthe arrector pili muscle ，known as the bulge region．The percentage of double immunofluorescence cytochemically stained β1integrin-and BrdU-positive cells was 81%in all β1-positive cells ，and 94%in all BdrU-positive cells．The percentage of P63-and BrdU-positive cells was 65%in all P63-positive cells ，and 86%in all BdrU-positive cells．The percentage of CD34-and BrdU-positive cells was 30%in all CD34-positive cells ，and 62%in all BdrU-positive cells．ConclusionAmong these molecular markers ，β1integrin ，with highest accordance with BrdU ，is the best molecularmarker for ESCs ，and P63is the next best．Key words ：Label-retaining cells ；Molecular markers for epidermal stem cells ；Double immunofluorescence labeling technique66山东大学学报（医学版）49卷4期皮肤是人体最大的组织器官，它有很快的自我更新能力，在维持组织结构的更新和细胞内环境的稳定及创伤后创面修复的过程中起着至关重要的作用，其关键就是由于表皮干细胞（epidermal stem cells，ESCs）的存在。
55第19卷 第1期 2017 年 1 月辽宁中医药大学学报JOURNAL OF LIAONING UNIVERSITY OF TCMVol. 19 No. 1 Jan .，2017细胞衰老是指正常的细胞在通路的调控下能够不可逆的进入生长停滞期的一种状态[1]。
细胞衰老涉及DNA 的损伤与修复、线粒体的能量代谢以及相关基因的调控等方面[2]。
随着我国人口老龄化进程的加快，细胞衰老问题不仅是一个生物问题，更成为了一个重大的社会问题，所以对于延缓细胞衰老的研究更有现实意义。
五味子为木兰科植物五味子[Schisandra chinensis （Turcz.）Baill]的干燥成熟果实，其果实入药，味酸甘性温，入肺、心、肾经，有敛肺固涩、益气生津及补肾宁心的功效[3]。
现代药理学研究表明，五味子具有保肝[4]、抗缺氧、抗疲劳[5]和抗肿瘤[6]等作用。
高文荣等[7]证实五味子水提取液能够对D-半乳糖所致的衰老神经细胞具有保护作用，但是五味子水提取液对t-BHP 所造成的神经元衰老笔者还未见相关报道。
所以本研究在成功培养小鼠原代皮层神经元基础上，观察五味子水提取液对t-BHP 导致的神经元衰老的作用。
1 材料与方法1.1 动物昆明种小鼠，购自辽宁长生生物技术有限公司，合格证号：SCXK（辽）2010-001，光明∶黑暗=1∶1，室温（22±2）℃，相对湿度55%~65%。
将怀孕的母鼠单独放置在一个鼠笼中，待自然分娩后取新生小鼠用于实验。
1.2 试剂五味子水提取液（由辽宁中医药大学制剂实验室提供），用含有10% FBS（fetal calf serum，胎牛血清，Gibco 公司）和1% P/S（penicillin-strepotomycin，青-链霉素，Thermo 公司）的DMEM（Dulbecco's五味子水提取液对叔丁基过氧化氢诱导神经元衰老保护作用赵坚毅，田立东（辽宁中医药大学附属医院，辽宁 沈阳 110032）摘 要：目的：探讨五味子水提取液（SWE）对叔丁基过氧化氢诱导的神经元衰老的保护作用并探讨其机制。
免疫荧光实验——iPSC-derive神经元的体外神经毒性检测如今神经毒性检测主要是依赖活体动物实验，不仅有伦理问题，而且通常非常昂贵并且十分耗时。
当需要大规模的测试化合物的时候就不太合适了。
因此，高通量的体外的神经毒性测试就显得十分必要了，而且可以使用人源的细胞直接进行试验，试验结果的实用性也更佳。
但是，到目前为止，人源干细胞诱导的神经元并没有适合进行这类试验的特质，试验时间较长，批次间差异大，并且有收到伦理和一些法律的制约，使得这种细胞都不太适用于做大规模的体外测试试验。
最近，市面上出现了商用的人源iPSC-derive神经元细胞，重复性好，可以用来做这类的体外神经毒性试验。
荷兰的科学家使用人源iPSC-derive神经元细胞做了免疫荧光染色试验，作为高通量进行体外的神经细胞毒性检测的预试验。
由不同供应商提供的人源iPSC-derive神经元细胞混合培养能够形成不同（激活型或抑制型）神经元共培养的样本。
ALTEX. 2016 Mar 24. doi: 10.14573/altex.1510091Is the time right for in vitro neurotoxicity testing using human iPSC-derived neurons?Tukker AM1, de Groot MW1, Wijnolts FM1, Kasteel EE1, Hondebrink L2, Westerink RH1.一、实验材料1）细胞：iCell® Neurons（NRC-100-010-001，Cellular Dynamics international）CDI iCell® Astrocytes（Cellular Dynamics international）HIP neurons (GSC-4312, MTI-GlobalStem)DOPA.4U® neurons (Axiogenesis, Cologne, Germany)2）培养基：Complete iCell Neurons Maintenance Medium (with 2% iCell Neurons Medium Supplement) supplemented with laminin (10 μg/mL)3）试剂：Poly-L-Ornithine （[PLO] 0.01%）4）培养耗材：µ-Slide 8孔腔室载玻片，ibiTreat底部处理（ibidi，Germany，80826）二、实验方法一）载玻片包被①每孔加入300μl 的0.01%的Poly-L-Ornithine 溶液②室温孵育60分钟③吸除所有液体并小心用PBS冲洗5-10分钟，即可开始使用二）免疫荧光实验1）铺细胞：iCell® Neurons 每孔铺100000个细胞iCell® Neurons/CDI iCell® Astrocytes共培养，每孔铺66000个细胞HIP neurons每孔铺100000个细胞DOPA.4U® neurons每孔铺52000个细胞DOPA.4U® neurons/iCell® Astrocytes共培养，每孔铺48000个细胞2）加入约300μl/孔的4%多聚甲醛的PBS溶液，静置15分钟3）加入300μl 1% Triton® X-100 的PBS 溶液通透3-5分钟4）加入300μl 2% BSA的PBS溶液封闭20分钟5）依次加入一抗，二抗进行免疫荧光染色后，冲洗小室并加入封片液进行显微镜观察（图二）。
神经细胞在不同的显微术镜下的图像昨天大家看了神经细胞在相差+共聚焦镜下的视频，今天带大家看看同一种细胞或者说是同一种物体在不同显微术镜下的图像差异。
以下图片都是小鼠神经细胞，但不同的显微术镜下所表现出来的效果或者说镜下图像的清晰度会有很大的区别。
暗场镜下图像相差镜下图像DIC镜下图像
通过以上三种显微术镜下图像对比可以看出：
a)暗场镜下图像效果：只能看清神经细胞的轮廓和他的存在，相对
神经细胞的内部细节就很难看清晰，这也是暗场显微术的特征；
b)相差镜下图像效果：神经细胞镜下图像相对来说比之前的暗场效
果有明显的提升，缺点是在细胞的边缘有光晕，干扰图像效果；
c)DIC镜下图像效果：整个镜下图像感觉很柔和，细节部分看的非
常清晰，阴影部分衬托了整个图像的立体感，DIC的技术是其它显微术无法与之相比；
有人会问：既然DIC效果如此神奇，是不是我们在观察诸如
此
类切片时都应该用DIC来观察？是可以，但成本太高、价格昂贵。
对显微术的原理大家不必完全弄懂，但知道各种显微术镜下图像所表现的不同效果和差异，看到图片应当能知道是那一种显微
术镜下图像。
实验方案小鼠皮肤组织HE染色和免疫荧光染色HE染色一试剂及耗材小鼠皮肤细胞，固定液（4%多聚甲醛），PBS,不同浓度乙醇，透明剂（二甲苯），石蜡，包埋盒，苏木精伊红染色液，中性树胶等二实验步骤1.取小鼠皮肤组织去毛处理成合适的大小并置PBS或生理盐水中充分漂洗残余血液2.将漂洗干净的组织放入4%多聚甲醛中（1:5的比例浸泡）固定过夜3.将固定好的组织用PBS清洗两遍，每次30min4.组织脱水：30%乙醇→50%乙醇→75%乙醇（可4℃过夜）→85%乙醇→95%乙醇→100%乙醇（各30min）5.透明：二甲苯透明3×20min（具体时间根据透明程度来设定，小鼠皮肤10min即透明，透明时如发现组织有部分白雾状，则可能是脱水未脱净）6.浸蜡：4×30min（每30min换一次蜡，换四次以使石蜡浸入组织起支持作用）7.包埋（注意组织摆放及横切，纵切，记录标签），待石蜡充分凝固即可修片(刚包埋好的热蜡块不能立即冷冻)8.切片（5-7um），摊片（40-45℃），烘片（62℃左右，充分烘干）9.HE染色：二甲苯Ⅰ(10min) →二甲苯Ⅱ(5min) →二甲苯:乙醇=1:1(2min)→100%乙醇→95%乙醇(2min)→85%乙醇(1min)→70%乙醇(1min)→50%乙醇(1min)→水(1min)→苏木精染液(1min)→流动自来水(3min)→50%乙醇(1min)→70%乙醇(1min)→85%乙醇(1min)→95%乙醇(1min)→伊红染液(1min)→95%乙醇(1min)→100%乙醇(1min)→100%乙醇(1min)→二甲苯Ⅰ(2min)→二甲苯Ⅱ(2min)10.中性树胶封片(注意材料上的二甲苯不能干，尽量避免出现气泡)11.显微镜观察三实验样品四实验结果免疫荧光染色一试剂及耗材小鼠皮肤细胞石蜡切片，山羊血清，一抗，二抗，0.3%Triton x100，PBS等二实验步骤1.石蜡切片60℃烘片1小时2.脱蜡到水:二甲苯Ⅰ(10min) →二甲苯Ⅱ(5min) →二甲苯:乙醇=1:1(2min)→100%乙醇→95%乙醇(2min)→85%乙醇(1min)→70%乙醇(1min)→50%乙醇(1min)→水(1min)3.蒸馏水洗1min4.抗原修复：切片置于0.1mol/L且ph=6.0的柠檬酸钠修复液中，在水浴锅内（99℃）持续放10-15min，自然冷却20-30分钟（不能将切片拿出冷却）5.去除内源性酶：3%H2O2室温孵育5-10min6.PBS洗2-3次，每次5min7. 0.3%Triton x100室温孵育20min（增加细胞膜通透性）8.于室温湿盒内非特异血清封闭1h,(用DPBS稀释含10% goat FBS)9.孵育一抗(ITGB1)4℃过夜或37℃1h（一抗：DPBS(10% goat FBS)=1:200）,注意做空白对照（不加一抗，用DPBS(10% goat FBS)孵育）10. 孵育完成后PBS洗3次，每次5min11.滴加荧光二抗（IgG-FITC：DPBS(10% goat FBS)=1:200）室温置湿盒中避光孵育2小时或37℃30min，用PBS 3分钟×3次洗去二抗，用滤纸擦去标本外的PBS12.滴加DAPI 避光孵育2分钟（染核）。
胎鼠、新生大鼠原代海马神经元培养及鉴定熊丽娇;郭阗廷;曾治平;黄志华;曾靖【摘要】目的:建立胎鼠、新生鼠海马神经元体外培养方法.方法:分别取胎鼠、新生鼠海马,消化后种植,用含有2%B27的neurobasal培养液培养,第3天加入5 μmol·L-1的阿糖胞苷,换液后继续培养,以获得纯度较高的海马神经元.培养第3、7天观察细胞生长及突起情况,用neurofilament抗体以免疫荧光方法鉴定神经元细胞.结果:海马神经元种植24 h后贴壁,7天时神经元突起相互连接成网络.经neurofilament染色,培养细胞阳性率高,新生鼠原代培养海马神经元阳性率达(89±3.4)%,胎鼠海马神经元阳性率达(98±1.5)%.结论: 本方法培养出的胎鼠、新生大鼠海马神经元纯度较高,可作为海马神经元模型用于进一步研究.【期刊名称】《赣南医学院学报》【年(卷),期】2017(037)003【总页数】3页(P354-356)【关键词】海马神经元;细胞培养;胎鼠;新生鼠【作者】熊丽娇;郭阗廷;曾治平;黄志华;曾靖【作者单位】赣南医学院第一附属医院全科医学VIP科;赣南卫生健康职业教育学院外科教研室,江西赣州 341000;赣南医学院第一附属医院全科医学VIP科;赣南医学院;赣南医学院【正文语种】中文【中图分类】R285.5海马是大脑边缘系统重要部分，神经元分布高度集中，在认知、记忆、情绪、植物神经系统方面起着不可替代的作用[1-3]。
海马神经元体外培养模型已经成为研究神经元发育分化、神经疾病的发生机制的重要技术手段[4-6]。
海马神经元体外培养文献报道方法多样，动物来源主要有胎鼠和新生鼠，根据实验条件，我们摸索出了原代胎鼠、新生大鼠的海马神经元培养方法，并进行了细胞鉴定，获得了高纯度的胎鼠、新生大鼠海马神经元。
1.1 材料1.1.1 实验动物孕17天SD大鼠及出生24 h内的SD大鼠。
1.1.2 主要试剂 DMEM培养基、neurobasal培养基、胎牛血清(FBS)和B27培养基添加剂(Gibco公司)、青链霉素、胰酶、多聚L赖氨酸(sigma公司)。
胶质细胞是神经系统内数量众多的一大类细胞群体，约占中枢神经系统（central nervous system，CNS）细胞总数的90%，星型胶质细胞（astrocyte）是其中主要的组成成分。
传统观念一直认为，胶质细胞在神经系统中仅起辅助作用，是支持神经元的骨架，为神经元提供营养以及清除突触间隙中过多的离子和（或）神经递质。
胶质细胞英文名Glia来自希腊语Glu，意为胶质。
自1997年Pfrieger和Barres[1]发现胶质细胞能促进神经元间的突触联系后，对胶质细胞的认识进入了一个崭新的阶段。
现已发现星型胶质细胞不仅参与维持中枢神经系统的正常结构和功能[2-4]，而且具有神经营养和神经生长抑制作用[5-6]。
此外，星型胶质细胞在脑损伤、神经退行性疾病和神经再生过程中均发挥着作用[7-8]。
本实验通过大鼠视皮质星型胶质细胞的原代和传代培养，采用免疫荧光化学方法进行鉴定，以期建立星型胶质细胞体外培养体系，为体外研究星型胶质细胞的功能和机制奠定基础。
1材料与方法1.1材料1.1.1实验动物动物采用出生1d的清洁级Long Evans（LE）新生鼠，雌雄不限，体质量3~5g，购于第三军医大学大坪医院野战外科研究所实验动物中心，动检证字SCXK（渝）20020003。
1.1.2主要试剂DMEM/F12培养液（Gibco，USA）；胰蛋白酶（Sig-ma，USA）；胎牛血清（Gibco，USA）；D-Hanks（天津百浩生物科技有限公司，中国）；小鼠抗胶质纤维酸性蛋白（GFAP）单克隆抗体（Sigma，USA）；小鼠抗硫酸软骨素（CS-56）单克隆抗体（Abcam，UK）；FITC标记的兔抗小鼠IgG（Sigma，USA）。
1.2方法1.2.1视皮层星型胶质细胞的培养新生LE大鼠经75%乙醇消毒5min后迅速断头处死，沿矢状线剪开，剥除头皮及颅骨，用解剖镊将大脑及小脑完整取出，置入一盛有4℃无菌解剖液的培养皿中，体视显微镜下剥离软脑膜。
小鼠大脑皮层和海马神经元的分离与培养一、玻片的准备A．玻片的清洗1. 第一天，将玻片(12mm，633009，Carolina) 逐片置于装有浓硝酸(HNO3) 或者洗液的平皿中，混匀，然后浸泡过夜。
2. 第二天，将玻片放在有单蒸水的陶瓷盘中，搁在摇床上晃动，速度为200rpm，将玻片上的硝酸残液清洗干净。
每10min换水一次，要换20次以上。
晚上置于双蒸水中浸泡过夜。
3. 第三天，换双蒸水，重洗两次，每次速度为200rpm ，时间为60min，去除玻片上的离子和其它杂质，最后再换用无水乙醇，清洗三次以上。
洗完后置于小烧杯中，拿到细胞房超净台将玻片浸泡在无水乙醇中室温保存。
4. 解剖小鼠取细胞前两天将玻片从无水乙醇中取出，在酒精灯焰上烘干，稍微在空气中停一下，再放到灭菌的parafilm膜上。
玻片高温易碎，速度要快。
完成后在紫外下照射1h。
B. 玻片的包被（PDL包被）用0.1M的硼酸钠溶液将PDL配成0.01mg/ml PDL的溶液(pH 8.4)。
1.准备500ml 0.1M的硼酸钠（Na2B4O7·10H2O, B3545-500G，Sigma）溶液。
2.在超净台中，往一整瓶Poly-D-Lysine（PDL，5mg/ml，Sigma, P6407-5MG）中加入25ml的该硼酸钠溶液。
盖上瓶盖，溶解5min，可以轻轻晃动。
然后将该溶液加到剩下的硼酸钠溶液中。
即为所配溶液，0.22μm过滤，用锡纸包好，4℃避光保存。
3.使用的时候，6/12/24孔板每孔加1ml/500μl/250ul的PDL溶液，12mm盖玻片每片加50μl的PDL溶液，放在超净台中，室温包被4hrs或者过夜。
4.第二天，紫外照射超净台1-2hrs，再将PDL吸干。
将板和玻片盖揭开，室温晾过夜。
5.第三天，将每个孔/玻片用灭菌水洗两遍，吸干，盖上盖，避光待用。
二. 大脑皮层与海马的解剖A. 解剖前的准备1.解剖器械的灭菌解剖前将器械放在铝饭盒中，倒入75%乙醇，并在超净台中放入适量卷纸，打开紫外杀菌1-2hrs。
