大鼠皮层神经元细胞原代培养

大鼠视网膜神经细胞的原代培养摘要目的:在前人建立的方法上优化SD 大鼠视网膜神经细胞体外培养的技术和方法，为后续研究提供实验基础。

方法:使用胰酶消化法分离新生1 ～ 3d SD 大鼠视网膜神经细胞，以DMEM/F12 为培养基体外培养，免疫组织化学染色的方法进行鉴定。

结果:观察光镜下培养的细胞贴壁生长，部分细胞伸出突起，且有些突起相互连接。

免疫细胞化学染色显示，培养的细胞大多数抗神经元特异性烯醇化酶(NSE) 抗体反应阳性。

结论:视网膜神经细胞体外培养成功为进一步进行视网膜疾病的研究创造了条件。

关键词:细胞培养; 视网膜神经元; 胰蛋白酶消化法; 神经元特异性烯醇化酶引言一个世纪前，从青蛙身上剥离的神经管片段仍能在生理液中维持几天的活性，使得越来越多的神经纤维得到的实时观测以来，体外培养技术已经广泛的应用于生物技术领域。

【1】在没有了完整动物的复杂性，体外培养的方法可以大大提高对视网膜的基本属性和环境的适应性的了解。

在体外系统中，这个界定的实验条件可以很容易设定和维持。

这提供了一个稳定的辅助药理学和分子操纵的平衡，同时保持了完整的组织复杂表型特征。

在这里我们根据一些成功方法报告探讨一下大鼠视网膜神经细胞的原代培养技术。

【2-3】材料与方法动物：实验中使用的所有SD大鼠幼崽均是从青岛实验动物中心根据眼科和视觉研究中动物的ARVO声明，同时保留了出生后1-3SD大鼠的相对温度和湿度条件下获得的SD大鼠幼崽材料：DMEM/F12培养液和胎牛血清购自Gibco公司（美国），兔抗大鼠神经元特异性烯醇化酶（NSE）单克隆抗体，兔抗大鼠神经胶质纤维酸性蛋白（GFAP）多克隆抗体，羊抗兔IgG 和HRP-链霉亲和素购自中山Goldbridge生物技术有限公司（北京，中国）。

所有其他试剂均为Sigma公司（圣路易斯，密苏里州，美国）。

方法：预涂层的聚-D-赖氨酸组织培养皿为了使视网膜神经细胞，紧贴组织培养皿，聚-D-赖氨酸添加到被预先放置盖玻片的24孔板的孔中。

神经细胞原代培养从动物（大鼠或小鼠等）的胚胎或新生动物的脑组织取下某一局部区域，分离细胞，培养在培养容器后不再移植，常称为原代神经细胞培养。

一、培养前准备1. 器械和器皿器械：外科剪、镊子、虹膜剪等、小剪刀、细镊子和虹膜小刀等各种金属器械如解剖器械，使用后及时刷洗干净，用酒精棉球擦拭后晾干，或经60℃烘干，以防生锈。

由于湿热消毒对手术器械容易可用70－80％酒精浸泡1小时以上消毒。

器皿：1)玻璃瓶及相应的胶塞或胶木螺旋盖，2)用于分装血清、多聚赖氨酸、解剖液、各种盐溶液和培养液等。

3)培养瓶、盖玻片4)培养用的盖玻片必须不含铅、不发霉，可用0.2N盐酸浸泡10分钟，用蒸馏水洗2次，每次10分钟，然后移入丙酮或乙醇浸泡10分钟，再用双蒸水洗2次，每次10分钟，烘干待消毒。

凡组织学用过的旧盖玻片一般不用。

5)移液管、吸管、烧杯、离心管和培养皿。

6)塑料培养皿（35mm）、塑料培养板（6、24、96孔）。

辅助工具：放置试管、吸管和玻璃瓶等的架子。

2. 培养基和培养用液的配制1) 培养基质：有多聚赖氨酸、牛皮胶原和鼠尾胶原。

本室目前常用分子量为7-140000多聚赖氨酸（Poly-L-lysine，浓度为0.1mg/ml。

2) 平衡盐溶液：主要以无机盐和葡萄糖配制而成。

各种平衡盐溶液主要的不同点在于NaCl的浓度、离子浓度及缓冲系统的不同，可根据实际需要选用适当的平衡盐溶液。

3) 培养液：目前已有现成的干粉出售，按说明书进行配制即可。

神经细胞培养需高糖，培养液应含有或加葡萄糖至6g/L。

目前培养海马神经元可选用B27无血清培养液。

4) 血清：有胎牛血清、小牛血清和马血清等。

分装成小瓶，4℃保存备用（分装前需56℃灭活30分钟）。

5) 胰蛋白酶溶液：用于分离细胞。

先用少量灭菌三蒸水将胰蛋白酶粉末溶成糊状，然后补水至2.5%浓度，振荡摇匀，4℃过夜，待完全溶解后用滤器过滤灭菌，并分装成1-2ml冻存。

用前以D-Hanks平衡盐水或其他无钙镁离子溶液溶解稀释至0.25%或0.125%。

大鼠大脑皮层星形胶质细胞原代培养及传代、试剂Poly-L-lysine (Sigma,P2636)DMEM (Invitrogen,11995-065)二、器械手术器械：眼科剪x2、眼科镊直、弯各x2、显微镊x2 （金钟，WA3050）、显微剪x13ml 移液管( Biologix, 30-0138A1)南京军区总院神经内科实验室 许丽丽 2012-12-011) 2) 3) FBS (Invitroge,10099-141)4) HBSS, no Calcium, no Magnesium (Invitrogen, 14170-112)5) 0.25% Trypsin-EDTA ( Invitrogen, 25200-056)6) DPBS (HyClone ，SH30028.01B )7) dd H 2O8) 75％酒精1) 2) 100 ml 小烧杯3) 200 目不锈钢筛4) 细胞计数器（求精）5) 50ml 离心管( Corning ， 430828)、 15ml 离心管( Corning ， 430790)6) 25ml 培养瓶( Corning ， 430639)或 75ml 培养瓶( Corning ， 430641)7) 100ml 玻璃瓶（蜀牛）8) 直径为 60mm 的培养皿 LabServ,310109010)9)10) 过滤器( Millex-GP, SLGP033R)B11) 注射器：50ml、5ml 各112) Pipette and pipette tips13) 冰袋、手套、口罩Day 11、消毒1.1 将解剖器械、枪头高温高压消毒15 分钟，消毒结束后放入烘箱中烘干待第二天使用。

1.2 打开操作台紫外线灯消毒30 分钟。

2、包被培养板2.1 戴手套，用酒精棉球擦拭操作台、移液枪，点燃酒精灯。

2.2取PLL用DPBS将其稀释至100 pg/ml 。

2.3以PLL包被培养瓶，量以覆盖培养瓶底面为宜。

原代细胞培养步骤(1)、取新生SD大鼠3只，入75%酒精消毒2分钟，断颈取脑。

(2)、将新生鼠脑放入盛有冷的D’Hanks平衡盐溶液的玻璃培养皿内，置冰盘上，于解剖显微镜下仔细剥除脑膜(3)、将分离的海马组织放入另一个盛有冷的D’Hanks溶液的玻璃培养皿内，用眼科剪剪成小碎片，并移入15(4)、向离心管中加入37℃ 0.25%胰酶溶液，每6个海马组织加1ml胰酶消化液，放入37℃培养箱中孵育10-1即可。

900rpm离心2min。

(5)、吸除胰酶消化液，加入等量的37℃种植液以终止消化，置室温10min。

、加入2ml种植液，以抛光的滴管吹打约15次，分散细胞，静置10min（如仍有组织块，应用200目筛网(7)、调整细胞密度，以90-320/mm2的密度种于六孔板内。

置37℃ 5%CO2培养箱中培养。

、24h后全部吸除种植液，更换成Neurobasal + 2% B27培养液培养。

此后每周以此液半量换液2次。

培养8-10天进行下一步实验。

投票1收藏1实验已经开始了，遇到了其他一些新的问题，但在此我想说说我取新生大鼠海马的体会：象有战友说的那样，我刚开始也是成年大鼠上练习的，一切都还比较顺利，但是要取新生1天的大鼠海马是否要困难的多，主要是由于脑组织太嫩了，稍不注意就化成泥了。

1.冻僵老鼠后，用酒精浸泡消毒，然后用PBS液清洗一下，剪下鼠脑。

2.游离脑部皮肤，用眼科剪经枕骨大孔沿矢状缝剪开颅骨，轻轻游离颅骨和脑组织后，在顶骨和顶间骨之间向左右剪开，然后剪掉颅骨，尽可能往两侧剪，使脑组织充分暴露，以便下一步剥离脑皮质和游离海马。

3.用眼科剪分别两侧在大脑皮质中间横向剪开，深约1mm，然后将整个脑置于装有PBS液的培养皿中，要使液体没过脑组织。

用刮针（用缝衣服的针插在一次性筷子里自制的，用针鼻儿那头）沿着刚才的切口轻轻的向后刮除皮质，切忌过深，完全显露出海马后，从两侧游离，使其漂浮于液体中，然后用牙刮匙从连接处将整个海马从脑中分离出来。

·技术方法·一种改进的大鼠皮层神经元原代培养方法及其性质鉴定姜　茜,姜玉武■,王静敏,秦　炯,吴希如(北京大学第一医院儿科,北京　100034)[摘　要]目的:对原有大鼠皮层神经元原代培养方法进行改进,以获得数量更多、纯度更高、体外生长时间更长的神经细胞进行相关实验研究。

方法:使用3种不同成分的液体对培养器皿进行序贯预处理,分离16～17d 胎龄的Wi s t a r 大鼠胎鼠皮层,采用木瓜蛋白酶化学消化与机械吹打相结合的方法制备单细胞悬液,经细胞计数后按照不同实验目的进行梯度密度接种。

细胞接种当日4～6h 将含有血清的接种培养液换为添加B 27的N e u r o b a s a l 无血清培养基,培养第3天(D I V 3)用终浓度10μm o l /L 的阿糖胞苷(c y t o s i n e a r a b i n o s i d e ,A r a -C )处理24h 抑制胶质细胞增殖,以后每周半量换液1次。

用倒置相差显微镜观察细胞形态,利用神经元特异性标志物微管相关蛋白2(m i c r o t u b u l e -a s s o c i a t e dp r o t e i n 2,M A P 2)与细胞核双标记法鉴定培养神经细胞的纯度,并以免疫荧光法检测突触前、后标记物以评估突触形成情况。

结果:与单纯多聚赖氨酸预处理培养器皿,胰蛋白酶化学消化法分离细胞及含血清培养基培养的原方法相比,方法改进以后收获的细胞产量明显增加,且消化过程对细胞损伤小,接种后细胞分散均匀,杂质少,纯度高,树突、突触发育正常,可长期存活。

结论:该方法简便可行,结果稳定,用该方法培养的大鼠皮层神经元可作为神经元体外培养的良好实验模型。

[关键词]大脑皮质;神经元;细胞,培养的;木瓜蛋白酶;免疫组织化学[中图分类号]R 329.2 [文献标识码]A [文章编号]1671-167X (2009)02-0212-05d o i :10.3969/j .i s s n .1671-167X .2009.02.019A ni m p r o v e dm e t h o df o r p r i m a r y c u l t u r e o f r a t c o r t i c a l n e u r o n a n d c e l l i d e n t i f i c a t i o nJ I A N GQ i a n ,J I A N GY u -w u ■,WA N GJ i n g -m i n ,Q I NJ i o n g ,WUX i -r u (D e p a r t m e n t o f P e d i a t r i c s ,P e k i n g U n i v e r s i t y F i r s t H o s p i t a l ,B e i j i n g 100034,C h i n a )A B S T R A C T O b j e c t i v e :T o i m p r o v e p r e v i o u s m e t h o d o f p r i m a r y r a t c o r t i c a l n e u r o nc u l t u r e t o g e t p u r e ra n d m o r e l o n g -l a s t i n g c e l l s f o r s t u d y .Me t h o d s :T i m e d -p r e g n a n t W i s t a r r a t s a t a g e s t a t i o n a l a g e o f 16o r 17d a y s (16-17d )w e r e u s e d .F e t a lb r a i n s w e r e r e m o v e d a n d t h ec e r e b r a l c o r t i c e s w e r ed i s se c t e d o u t .P a p a i n d i g e s t i o na n dm e c h a n i c a l d i s s o c i a t i o nw e r ec o m b i n e dt oc o n d u c t m o n o -c e l l s u s p e n d i n g m e d i a .F o u r t o s i x h o u r s (4-6h )p o s t -p l a t i n g ,a l l p l a t i n g m e d i a w e r e r e m o v e df r o mc u l t u r e s a n d r e p l a c e d w i t h N e u r o b a s a l m e d i u ms u p p l e m e n t e d w i t h B 27.O n t h e t h i r d d a y ,10μm o l /L c y t o s i n e a r a b i n o s i d e (A r a -C )w a s a d d e d t o t h e c u l t u r e f o r 24h t o i n h i b i t t h e o u tg r o w t ho f g l i a l c e l l s .H a l f o f th e c u l t u r e m e di u mw a s c h a n g e d e v e r yw e e k .T h e m o r p h o l o g i c a l c h a n g e s o f n e u r o nc e l l s w e r eo b s e r v e db yl i g h t m i c r o s c o p e .D o u b l e i m m u n o -s t a i n i n g o f m i c r o t u b u l e -a s s o c i a t e d p r o t e i n 2(M A P 2)a n d k a r y o n w e r e a p p l i e d t o a s s e s s t h e c u l t u r e p u r i t y .E v a l u a t i o n o f s y n a p s e f o r m a t i o n w a s p r o c e s s e d b y i m m u n o c y t o c h e m i c a l a n a l y s i s u s i n g a n t i b o d i e s a g a i n s t b o t h p r e -a n d p o s t s y n a p t i c p r o t e i n m a r k e r s .R e s u l t s :T h e i m p r o v e d m e t h o d c o u l dr e -m a r k a b l y i n c r e a s e t h e c e l l n u m b e r a n d r e d u c e n e u r o n a l d a m n i f i c a t i o n .T h e p r i m a r y c u l t u r e w a s c h a r a c t e -r i z e d b y h i g h u n i f o r m i t y ,p u r i t y ,n o r m a l s y n a p s e f o r m a t i o n a n d l o n g t i m e l i v a b i l i t y .C o n c l u s i o n :T h i s i s a s i m p l e a n d r e l i a b l e t e c h n i q u e f o r t h e i n v i t r o p r i m a r y c u l t u r e o f r a t c o r t i c a l n e u r o n s .K E Y WO R D S C e r e b r a l c o r t e x ;N e u r o n s ;C e l l ,c u l t u r e d ;P a p a i n ;I m m u n o h i s t o c h e m i s t r y 基金项目:国家自然科学基金资助项目(30270448、30470555、30870865)S u p p o r t e db yN a t i o n a lN a t u r a lS c i e n c eF o u n d a t i o no fC h i n a (30270448,30470555,30870865)■C o r r e s p o n d i n ga u t h o r 's e -m a i l ,j i a n g y w @263.n e t 神经细胞是构成神经系统的基本结构和功能单位。

新生大鼠视皮层神经元的原代培养及鉴定宋海岩;邓晓慧;赵超;连辉【摘要】目的探讨新生大鼠视皮层神经元的原代培养方法,以获取数量多、纯度高的视皮层神经元.方法取新生1d内的SD大鼠视皮层,通过胰酶消化法获取单细胞悬液,倒置相差显微镜下计数后种植于6孔培养板内培养.培养24 h后用终浓度10μmol·L-1阿糖胞苷处理,抑制非神经元的生长,作用24h后半量换液,以后每隔1d半量换液1次.每天倒置相差显微镜下观察细胞的生长状况和形态变化,Nissl染色法进行视皮层神经元鉴定,免疫荧光显示神经元特异性烯醇化酶鉴定培养视皮层神经元的纯度.结果接种4h后,大部分细胞已贴壁,细胞立体感较强；接种后24h,大部分细胞长出短的突起,细胞形态发生变化,胞体呈多边形或三角形,细胞周围有或多或少的光晕；培养4d后,细胞突起伸长、增粗；培养6～8d后,细胞状态较佳,细胞胞体饱满,光晕明显,突起进一步伸长、增粗,且分支多,突起交织成网状,非神经元细胞减少,为实验的最佳时间；培养14 d后,细胞开始退化.培养6d行焦油紫染后,倒置相差显微镜下观察,可见细胞内的尼氏体呈蓝紫色的颗粒或斑块.免疫荧光染色结果显示,原代培养的细胞中,大部分细胞为绿染细胞,形态良好,核大而清晰,神经元所占比例高.结论本研究获得视皮层神经元的方法简单经济,通过形态学观察、Nissl 染色及免疫荧光染色可以对体外培养的视皮层神经元细胞进行准确鉴定.【期刊名称】《眼科新进展》【年(卷),期】2013(033)008【总页数】3页(P733-735)【关键词】视皮层;神经元;原代培养;大鼠【作者】宋海岩;邓晓慧;赵超;连辉【作者单位】453003 河南省新乡市,新乡医学院基础医学院解剖学教研室;453003 河南省新乡市,新乡医学院基础医学院解剖学教研室;453000 河南省新乡市,解放军371医院;453003 河南省新乡市,新乡医学院基础医学院解剖学教研室【正文语种】中文视皮层是视觉系统的高级中枢，培养观察视皮层神经元对弱视等与视皮层相关性眼科疾病的基础研究具有重要的意义。

新生鼠海马、皮层神经元原代培养实验材料1. 实验动物新生Wistar大鼠，当天出生（<12 h）的乳鼠，SPF级。

2. 试剂Hibernate ANeurobasal AB27 serum-free supplementsPapin （木瓜蛋白酶）DNAase IOptiPrep Density Gradient MediumPoly-L-lysine （多聚赖氨酸）L-glutamine （L-谷氨酰胺）Penicillin （青霉素）Streptomycin （链霉素）D-Hank’s solutiondd H2O3. 溶液配制1. 多聚赖氨酸：取多聚赖氨酸25 mg，用双蒸水溶解并稀释浓度为50μg/ml，用0.2 μm的微孔滤膜过滤，4 °C保存备用。

（可配成25×）2. 解剖液：HA：含0.5mM L-谷氨酰胺的Hibernate A，0.22μm微孔滤膜过滤，4°C保存备用。

3．Papin：用HA配制含Papin 2mg/mL的消化液，37°C孵育20~30min，0.22μm 微孔滤膜过滤，冰上保存至实验。

在使用前3h内配制。

4．DNAase I：取DNAase I粉末用D-Hank’s液配制成50μg/mL，0.22μm微孔滤膜过滤。

可一次配好，-20°C保存，每次取用。

4．终止消化液：HABG：含2% B27的HA。

现用现配，37°C保存备用。

5．Optiprep离心介质：Optiprep medium∶HABG为124∶876，每离心管1~1.5mL。

5．种植液和培养液：Neurobasal-A/B27：含2% B27，0.5mM L-谷氨酰胺的Neurobasal-A。

现用现配，37°C保存备用。

4．实验方法1. 包被培养皿使用前2 d，在无菌条件下取6孔培养板，加多聚赖氨酸1 mL/孔，放置2 h，吸去多余多聚赖氨酸，自然干燥，灭菌水洗板2次，干燥备用。

·５３０··实验研究·激光共聚焦扫描显微镜技术在大鼠皮层神经元细胞内钙离子浓度动态测定中的应用武美娜李新毅白玮郭芬祁金顺【摘要】目的探讨激光共聚焦扫描显微镜（ＬＣＳＭ）技术在动态测定神经元细胞内钙离子浓度中的应用。

方法采用原代培养大鼠皮层神经元，用ＬＣＳＭ测定给ＫＣＩ前后细胞内钙离子浓度的动态变化。

结果培养神经元状态良好。

用ＬＣＳＭ准确、稳定、可靠地测出细胞内钙离子浓度的动态变化。

结论ＬＣＳＭ在动态测定神经元细胞内钙离子浓度中具有明显优势。

【关键词】显微镜检查，共焦；细胞内钙离子浓度；皮层神经元ＵｓｅｏｆＩａｓｅｒｅｏｎｆｏｃａｌｓｃａｎｎｉｎｇｍｉｃｒｏｓｃｏｐｙｆｏｒｄｙｎａｍｉｃｓｔｕｄｙｏｆｉｎｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒｃａｌｃｉｕｍｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｉｏｎｉｎｒａｔｃｏｒ－ｔｉｃａｌｎｅｕｒｏｎｓＷＵＭｅｉ－ｎａ＇，ＬＩＸｉｎ一蚋，ＢＡｌＷｅｉ，ＧＵＯＦｅｎ，ＱＩＪｉｎ－ｓｈｕｎ．ＤｅｐａｒｔｍｅｎｔｏｆＰｈｙｓｉｏｌｏｇｙ，ＳｈａｎｘｉＭｅｄｉｃａｌＵｎｉｖｅｒｓｉｔ）＇，Ｔａｉｙｕａｎ０３０００１．Ｃｈｉｎａ【Ａｂｓｔｒａｃｔ】ＯｂｊｅｃｔｉｖｅＴｏｄｏｃｕｍｅｎｔｔｈｅｐｒｏｍｉｓｅｓｏｆｌａｓｅｒｃｏｎｆｏｃａｌｓｃａｎｎｉｎｇｍｉｃｒｏｓｃｏｐｙ（ＬＣＳＭ）ｉｎｄｙｎａｍｉｃｓｔｕｄｙｏｆｉｎｔｒａｅｅｌｌｕｌａｆｃａｌｃｉｕｍｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｉｏｎ（『Ｃａ邳）ｊｎｓｕｂｊｅｅｔｅｄｔｏｄｉｆｆｅｒｅｎｔｄｒｕｇａｄｍｉｎｉｓｔｒａｔｉｏｎ．ＭｅｔｈｏｄｓＬＣＳＭｗａｓｕｓｅ（１ｔｏｉｎｖｅｓｔｉｇａｔｅｔｈｅｄｙｎａｍｉｃｃｈａｎｇｅｏｆｆＣａ２ｑｉｉｎｐｒｉｍａｒｙｃｕｌｔｕｒｅｄｃｏｒｔｉｃａｌｂｅｆｏｒｅａｎｄａｆｔｅｒＫＣＩｔｒｅａｔｍｅｎｔ．ＲｅｓｕｌｔｓＴｈｅｃｕｌｔｕｒｅｄｓｈｏｗｅｄｇｏｏｄｍｏｒｐｈｏｌｏｇｙａｎｄｇｒｏｗｔｈｓｔａｔｕｓ．Ａｃｃｕｒａｔｅ，ｓｔａｂｌｅａｎｄｒｅｌｉａｂｌｅｍｅａｓｕｒｅｍｅｎｔｓｏｆｄｙｎａｍｉｃ『Ｃａ２＋］ｉｗｅｒｅｐｅｒｆｏｒｍｅｄｕｓｉｎｇＩ￡ＳＭ．ＣｏｎｃｌｕｓｉｏｎＬＣＳＭｔｅｃｈｎｉｑｕｅｍａｙｓｈｏｗｐｒｏｍｉｓｅｓｆｏｒｍｅａｓｕｒｅｍｅｎｔｏｆｄｙｎａｍｉｃｃｈａｎｇｅｉｎｆＣａ２＋］ｉ．【Ｋｅｙｗｏｒｄｓ】Ｍｉｃｒｏｓｃｏｐｙ，ＣＯｌｌｆｏｃａｌ；ＩｎｔｒａｃｅＵｕｌａｒｃａｌｃｉｕｍｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｉｏｎ；ＣｏｒｔｉｅａｌＣａ２＋是细胞内最为重要的阳离子和第二信使之一。