小鼠大脑皮层神经元原代培养步骤(engreen)

小鼠表皮细胞的原代培养---细胞生物学综合设计性实验报告学院課程实验项目实验题目专业年级、班别姓名学号任课教师完成日期实验六细胞培养——小鼠表皮细胞的原代培养摘要目的探讨体外分离和培养小鼠表皮细胞的方法。

方法采用脱臼法处死新生小鼠，结合酶消化法和组织块法对新生小鼠表皮细胞进行了体外分离、培养。

（用眼科剪把新生小鼠表皮细胞组织剪成小于1mm³大小的植块，然后用胰蛋白酶消化5~10min，最后将组织块接种于培养瓶中进行体外培养。

）结果新生小鼠表皮细胞克隆2~3d后开始形成［1］，细胞呈梭形，体外培养一个星期后仍能够保持良好的生长状态。

结论采用该方法能够实现对小鼠表皮细胞的体外原代培养，并且细胞贴壁生长的速度比单纯采用酶消化法和组织块法大大提高。

关键词原代培养小鼠表皮细胞酶消化法组织块法1前言目的：初步了解动物细胞原代培养的基本方法、原理和基本操作过程，初步掌握无菌操作方法。

意义：细胞培养技术目前已经广泛地被应用于生物学的各个领域。

如分子生物学、细胞生物学、遗传学、免疫学、肿瘤学、病毒学等领域，已发展成为一种重要的生物技术。

为此有必要使学生在细胞培养方面得到一些初步的感性知识，了解动物细胞培养的技术的基本操作过程，观察体外培养细胞的生长特征，并对原代培养有一个基本概念。

［2］方法：结合酶消化法和组织块法通过无菌操作培养新生小鼠细胞。

结果：运用这种方法成功并比较快速地培养出原代表皮细胞。

结论：这种方法为广泛开展表皮细胞原代培养奠定了基础。

2实验原理原代细胞培养是指直接从动物体内获取的细胞、组织或器官，经体外培养后，直到第一次传代为止。

这种培养，首先用无菌操作的方法，从动物体内取出所需的组织（或器官），用组织块培养法，在人工培养下，使其不断地生长及繁殖。

3实验用品3.1器材每小组：解剖剪、镊1套；眼科剪7把、眼科镊6把；吸管（如有条件，吸管最好由可消毒移液器及其Tip取代）：直、弯头各7支，2 ml刻度吸管5支；吸管胶头：小18个、大6个；细胞培养瓶（或细胞培养皿）：小组人数+1个；青霉素瓶及瓶塞：小组人数+2个（其中一个用于分装胰酶液）；血细胞计数板1块, 盖玻片; 2～5ml注射器及注射针头1套；培养皿(用于解剖取材)：大、小各1套。

精品文档神经细胞原代培养的胚胎或新生动物的脑组织取下某一局部区域，分离细胞，培养在从动物（大鼠或小鼠等）培养容器后不再移植，常称为原代神经细胞培养。

一、培养前准备1. 器械和器皿器械：外科剪、镊子、虹膜剪等、小剪刀、细镊子和虹膜小刀等℃烘干，各种金属器械如解剖器械，使用后及时刷洗干净，60用酒精棉球擦拭后晾干，或经以防生锈。

由于湿热消毒对手术器械容易可用70－小时以上消毒。

80％酒精浸泡1 器皿：1) 2) 3)玻璃瓶及相应的胶塞或胶木螺旋盖，用于分装血清、多聚赖氨酸、解剖液、各种盐溶液和培养液等。

5)培养瓶、盖玻片次，盐酸浸泡可用0.2N10分钟，用蒸馏水洗2培养用的盖玻片必须不含铅、不发霉，分钟，10分钟，再用双蒸水洗2次，每次1010每次分钟，然后移入丙酮或乙醇浸泡烘干待消毒。

凡组织学用过的旧盖玻片一般不用。

6)7)移液管、吸管、烧杯、离心管和培养皿。

8)。

孔）、、、塑料培养板（35mm9)塑料培养皿（）62496精品文档．精品文档辅助工具：放置试管、吸管和玻璃瓶等的架子。

2. 培养基和培养用液的配制多7-1400001) 培养基质：有多聚赖氨酸、牛皮胶原和鼠尾胶原。

本室目前常用分子量为0.1mg/ml，浓度为。

聚赖氨酸（Poly-L-lysineNaCl主要以无机盐和葡萄糖配制而成。

各种平衡盐溶液主要的不同点在于2) 平衡盐溶液：的浓度、离子浓度及缓冲系统的不同，可根据实际需要选用适当的平衡盐溶液。

培养液：目前已有现成的干粉出售，按说明书进行配制即可。

神经细胞培养需高糖，培3)无血清培养液。

养液应含有或加葡萄糖至6g/L。

目前培养海马神经元可选用B27℃564) 血清：有胎牛血清、小牛血清和马血清等。

分装成小瓶，4℃保存备用（分装前需。

灭活30分钟）胰蛋白酶溶液：用于分离细胞。

先用少量灭菌三蒸水将胰蛋白酶粉末溶成糊状，然后补5) 冻℃过夜，待完全溶解后用滤器过滤灭菌，并分装成1-2ml水至2.5%浓度，振荡摇匀，4。

胚鼠大脑皮质神经元的最佳分离和培养方法的探讨
李胜富;毛萌;周晖;李幼平;孙明菡
【期刊名称】《生物医学工程学杂志》
【年(卷),期】2001(18)3
【摘要】用不同类型酶消化法及单纯机械法分离胚鼠大脑皮质 ,并分别采用两种不同的培养基进行神经元的体外培养以建立胚鼠脑皮质神经元的最佳分离和培养方法。

结果表明 :采用 0 .0 5 %胰蛋白酶 +0 .0 5 % II型胶原酶消化 ,以神经元完全培养
基作为培养基质可获得高纯度。

【总页数】5页(P422-424)
【关键词】胚鼠;皮质神经元;分离;原代培养
【作者】李胜富;毛萌;周晖;李幼平;孙明菡
【作者单位】四川大学华西医院移植工程和移植免疫实验室;四川大学华西第二医
院儿科
【正文语种】中文
【中图分类】R338
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1.胎鼠大脑皮质神经元的分离培养和鉴定 [J], 周竹娟;郑健
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3.胚鼠大脑皮质神经元原代培养中NMDA诱导c—fos mRNA表达 [J], 单巍松;
梁卫兰
4.胚鼠大脑皮质一氧化氮合酶阳性神经元的体外生长发育研究 [J], 邱梅红;凌树才;田美玲
5.胚鼠大脑皮质神经元原代培养中NMDA诱导c－fosmRNA表达 [J], 单巍松;梁卫兰;吴希如
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新生鼠海马、皮层神经元原代培养实验材料1. 实验动物新生Wistar大鼠，当天出生（<12 h）的乳鼠，SPF级。

2. 试剂Hibernate ANeurobasal AB27 serum-free supplementsPapin （木瓜蛋白酶）DNAase IOptiPrep Density Gradient MediumPoly-L-lysine （多聚赖氨酸）L-glutamine （L-谷氨酰胺）Penicillin （青霉素）Streptomycin （链霉素）D-Hank’s solutiondd H2O3. 溶液配制1. 多聚赖氨酸：取多聚赖氨酸25 mg，用双蒸水溶解并稀释浓度为50μg/ml，用0.2 μm的微孔滤膜过滤，4 °C保存备用。

（可配成25×）2. 解剖液：HA：含0.5mM L-谷氨酰胺的Hibernate A，0.22μm微孔滤膜过滤，4°C保存备用。

3．Papin：用HA配制含Papin 2mg/mL的消化液，37°C孵育20~30min，0.22μm 微孔滤膜过滤，冰上保存至实验。

在使用前3h内配制。

4．DNAase I：取DNAase I粉末用D-Hank’s液配制成50μg/mL，0.22μm微孔滤膜过滤。

可一次配好，-20°C保存，每次取用。

4．终止消化液：HABG：含2% B27的HA。

现用现配，37°C保存备用。

5．Optiprep离心介质：Optiprep medium∶HABG为124∶876，每离心管1~1.5mL。

5．种植液和培养液：Neurobasal-A/B27：含2% B27，0.5mM L-谷氨酰胺的Neurobasal-A。

现用现配，37°C保存备用。

4．实验方法1. 包被培养皿使用前2 d，在无菌条件下取6孔培养板，加多聚赖氨酸1 mL/孔，放置2 h，吸去多余多聚赖氨酸，自然干燥，灭菌水洗板2次，干燥备用。

小鼠海马区神经元的培养实验材料：1、所有用于细胞培养的器械、器皿剂溶液必须灭菌消毒。

2、多聚赖氨酸铺板以磷酸盐缓冲液(PBS)或蒸馏水荣分解多聚赖氨酸（分子量为30-70KD）至1mg/ml。

分装储存。

临用前稀释至终浓度为20-60mg/ml过滤备用。

在培养板或皿中加少量多聚赖氨酸溶液，以覆盖底部为宜，在37℃、CO2孵箱中过夜。

次日，用移液管吸取多聚赖氨酸，并用水洗2-3遍，晾干备用，如果培养目的适用于电生理的单细胞记录或者免疫组化和荧光染色，则在培养皿的底部加上盖玻片，多聚赖氨酸铺于盖玻片上，则更易得到强烈的荧光信号。

3解剖液（HEPES平衡盐溶液）取100ml 10x 平衡盐溶液（Hank’s balance salt solution,HBSS）HEPES 3.9g,NaHCO3 0.84g，青霉素104 U,链霉素100mg，H2O 800ml。

以1mol/LHCl调节PH至7.2，再加H2O之后总体积为1L，以0.2μm直径的滤菌器过滤，4℃保存。

4、DMEM 培养基（Dulbecco’s modified Eagle’s medium）DMEM 培养基500ml，加小牛血清和或马血清各10%（血清需经56℃，30min 灭活）1% 的青/链霉素.5、无血清培养基最常用的一种无血清培养基为，Neurobasal+2%的b27+1%抗生素6、2.5%胰蛋白酶（typsin）溶液临用前以解剖液稀释至终浓度0.125%。

7、台盼蓝(typan blue )溶液终浓度为0.2%-0.4%。

8、阿糖胞苷终浓度为8-10 μmol/L。

9、动物妊娠天数的选择通常选择出生24h之内的乳鼠。

实验步骤：1、脱臼处死乳鼠，75%的酒精浸泡3-5min，将清洗完的乳鼠放入含预冷解剖液的培养皿中。

2、用两把尖镊逐个去除鼠的头部皮肤和颅骨，取出全脑，置于另一含预冷解剖液的（PBS？）培养皿中，小心剥离并去除脑膜及脉络丛。

原代神经细胞培养新生鼠神经元细胞的培养准备工作：1、解剖器械一套（实验室有专门用于细胞间取材用的成套器械），需提前一天灭菌，过夜烤干。

2、试剂、溶液：Neuralbasal培养基（2mM glutamine）；D-PBS缓冲液；0.25%trypsin/0.02%EDTA消化液；0.05%poly-lysin。

3、包被玻片：干烤灭菌12 x 12mm2玻片，12孔板。

包被过程：0.05%poly-lysin滴于置培养板中的盖玻片上（注意勿溢出玻片），37℃放置12hr后纯水洗3遍，晾干。

4、操作中所用枪头均用剪刀剪去枪头尖，然后在酒精灯上迅速过一下抛光。

取材：1、从-200C取出三个冰袋，预冷若干皿D-PBS，一大皿用于冷却剥出的脑子，另外的35mm的皿用于冷却分离出的脑组织，如：海马，皮层，下丘脑等，分离几个部位就预冷几小皿D-PBS，小皿盖子上做好标记，第三个冰袋上放一皿盖，上面放灭过菌的滤纸，用于剥离脑子的操作。

2、取1-3天鼠，75％酒精浸泡片刻后，用大剪子断头处死。

3、弯头眼科剪剪开颅骨，取出完整脑至盛有预冷D-PBS的培养皿中，在体式镜下分离相应部位的组织,分别放在相应的皿中。

4、将组织块用弯头眼科剪剪碎，每小块约2mm3左右，用枪移入5mlEP中，稍为沉淀1分钟，吸弃上清，加入0.25%trypsin/0.02%EDTA，37℃消化10-15分钟左右，期间每3分钟颠倒几下。

注：每四个海马用胰酶1ml，每个皮层用胰酶2ml。

5、消化完毕，每毫升胰酶加入100ul血清以终止胰酶，颠倒混匀；1000rpm，4分钟，离心沉淀。

6、吸弃上清，注意不要将组织吸出。

7、加入37℃预热的1-2ml DMEM／10%FBS，用枪头吹打20下左右，此时液体浑浊，组织块明显变小。

8、放置沉淀3分钟左右，可见组织块沉底，吸取上清，其中包含所要的细胞。

9、计数，将细胞密度调整至2－4 x 10 5 /ml后接种于预先用poly-lysine包被过的盖玻片或皿上，100ul每玻片（12 x 12mm玻片）。

神经细胞原代培养从动物（大鼠或小鼠等）的胚胎或新生动物的脑组织取下某一局部区域，分离细胞，培养在培养容器后不再移植，常称为原代神经细胞培养。

一、培养前准备1. 器械和器皿器械：外科剪、镊子、虹膜剪等、小剪刀、细镊子和虹膜小刀等各种金属器械如解剖器械，使用后及时刷洗干净，用酒精棉球擦拭后晾干，或经60℃烘干，以防生锈。

由于湿热消毒对手术器械容易可用70－80％酒精浸泡1小时以上消毒。

器皿：1)玻璃瓶及相应的胶塞或胶木螺旋盖，2)用于分装血清、多聚赖氨酸、解剖液、各种盐溶液和培养液等。

3)培养瓶、盖玻片4)培养用的盖玻片必须不含铅、不发霉，可用0.2N盐酸浸泡10分钟，用蒸馏水洗2次，每次10分钟，然后移入丙酮或乙醇浸泡10分钟，再用双蒸水洗2次，每次10分钟，烘干待消毒。

凡组织学用过的旧盖玻片一般不用。

5)移液管、吸管、烧杯、离心管和培养皿。

6)塑料培养皿（35mm）、塑料培养板（6、24、96孔）。

辅助工具：放置试管、吸管和玻璃瓶等的架子。

2. 培养基和培养用液的配制1) 培养基质：有多聚赖氨酸、牛皮胶原和鼠尾胶原。

本室目前常用分子量为7-140000多聚赖氨酸（Poly-L-lysine，浓度为0.1mg/ml。

2) 平衡盐溶液：主要以无机盐和葡萄糖配制而成。

各种平衡盐溶液主要的不同点在于NaCl的浓度、离子浓度及缓冲系统的不同，可根据实际需要选用适当的平衡盐溶液。

3) 培养液：目前已有现成的干粉出售，按说明书进行配制即可。

神经细胞培养需高糖，培养液应含有或加葡萄糖至6g/L。

目前培养海马神经元可选用B27无血清培养液。

4) 血清：有胎牛血清、小牛血清和马血清等。

分装成小瓶，4℃保存备用（分装前需56℃灭活30分钟）。

5) 胰蛋白酶溶液：用于分离细胞。

先用少量灭菌三蒸水将胰蛋白酶粉末溶成糊状，然后补水至2.5%浓度，振荡摇匀，4℃过夜，待完全溶解后用滤器过滤灭菌，并分装成1-2ml冻存。

用前以D-Hanks平衡盐水或其他无钙镁离子溶液溶解稀释至0.25%或0.125%。

小鼠大脑皮层神经元原代培养步骤1.确定实验目的：在进行任何实验之前，首先需要明确实验的目的和研究问题，以确定所需的实验材料和方法。

2.准备实验材料：准备所需的实验材料，包括培养基、细胞培养试剂和培养器具等。

3.小鼠胚胎的取材：通过异交法得到小鼠胚胎，通常在胚胎发育第15-17天时取材。

使用无菌饲料给小鼠提供丰富的营养，使其胚胎发育良好。

4.分离大脑皮层组织：将小鼠胚胎处死后，将其大脑取出并置于无菌的PBS缓冲液中。

然后用剪刀将大脑的外围组织移除，只保留皮层组织。

5. 组织的化学消化：将取出的大脑皮层组织放入含有无菌PBS缓冲液的培养皿中，用Pipettor将组织切碎成较小的块状，并加入含有0.05%胰蛋白酶和0.1%DNA酶的消化液，室温下消化15-20分钟。

6.组织的离心：将消化液中的细胞悬液经过离心处理，用PBS缓冲液洗涤1-2次，去除消化液中的酶和杂质。

7.细胞计数和分装：用显微镜和细胞计数板对细胞悬液进行计数，通过稀释和分装的方法，得到所需的细胞浓度。

8.细胞接种：将细胞悬液均匀地滴加到含有预先涂覆了聚-L-赖氨酸的培养皿中，使细胞均匀附着在培养皿的表面上。

9.培养基的添加：在细胞接种后，将预先配制好的培养基加入培养皿中，以提供细胞所需的营养和生长因子。

10.培养条件的控制：将培养皿放置于恒温培养箱中，温度为37°C，湿度为95%，CO2浓度控制在5%左右。

每隔一段时间，检查培养皿中细胞的生长情况，确保细胞的健康生长。

11.细胞形态观察：使用倒置显微镜观察细胞的形态变化，观察细胞的神经突起、细胞形态和相互作用等。

12.细胞维持和传代：根据实验需要，定期更换培养基以提供细胞所需的营养和生长因子。

当细胞达到80-90%的密度时，可以进行细胞传代，使细胞继续生长。

小鼠大脑皮层神经元原代培养是一项复杂的实验技术，在操作过程中需要注意无菌操作、细胞的取材和处理、培养条件的控制等方面的细节。

小鼠大脑皮层神经元原代培养步骤:1、于无菌条件下切取鼠头并以75%酒精浸泡1min，解剖出完整鼠脑；2、预冷解剖液中分离去除软膜、血管、取大脑皮质漂洗，用眼科剪将皮质反复剪切成碎块；3、移入培养皿中，吸除解剖液加入0.25%胰蛋白酶2m1，37℃培养箱中消化30min；4、将皮层组织碎块移入离心管，弃去剩余消化液，用接种液洗3次，每次洗涤后使组织块充分沉降到试管底，弃去上清液；5、最后再用接种液1ml混悬，反复吹打（巴氏吸管）混悬液中组织块，力度适中，至浑浊后将上清液移入培养瓶待用；6、加入1ml接种液后再次吹打，如此反复3-4次，组织块逐渐消化后，弃去最终残块；7、收集含单细胞悬液的上清液约4-5ml于培养瓶中，以接种液重新悬浮细胞，细胞记数；接种1x107个细胞于6孔培养板中；8、培养24h至细胞贴壁后，换全培养液（DMEM/F12+2%B27）培养3d，观察神经元生长状况；9、换用阿糖胞苷培养液(终浓度2.5ug/ml，换半液)培养3d以抑制神经胶质细胞及杂细胞生长，获得单纯培养的原代神经细胞；10、每隔3d换全培养液1次，每次换半液。

神经元免疫化学鉴定:1、4%多聚甲醛固定细胞30min，PBS洗涤3次；2、加入无水甲醇:30%双氧水（5:1）处理30min，PBS洗涤3次；3、加入5%羊血清封闭20min，弃去多余液体；4、加入Rabbit Anti-NSE（1:100）（神经元特异性烯醇化酶），培养箱中孵育2-4h，PBS洗涤3次；5、加入Cy3-羊抗兔IgG（1:50）和20µl抗荧光衰减封片剂，室温放置1h；6、加入DAPI染液（1:40），室温放置5-10min；PBS洗涤3次。

7、荧光显微镜观察；。

神经元原代培养一、准备1. 试剂1）胎牛血清灭活：血清室温自然融解，摇匀。

选用与血清瓶同规格的对照瓶一个，并加入与血清等体积的水。

对照瓶内插入1～2支温度计(保证测试温度的准确性)。

将血清瓶与对照瓶同时放入恒温水浴箱，待温度计所示温度上升至56℃时，定时30分钟。

灭活后分装，10ml/瓶，一瓶放在培养箱做无菌实验，其余-20～-70℃保存。

2）D-Hank’s液(g/L)：NaCl: 8, KCl: 0.4, KH2PO4: 0.06, Na2HPO42H2O: 0.06, NaHCO3: 0.35; 酚红：0.02，超纯水溶解，调节PH至7.2，高压灭菌（购自南方医院临床试验中心）。

3）多聚赖氨酸：避光，用超纯水配制好后过滤，200µl或400µl/tube分装, -20度储存。

母液浓度为5mg/ml，工作液浓度为0.1mg/ml（购自Sigma，P2636，100mg）。

配置方法：20ml超纯水溶解，分装为1ml/管。

用时加入49ml超纯水稀释为0.1mg/ml的工作液。

4）50mM谷氨酸：超纯水溶解，滤过除菌，分装50µl/tube，-20℃保存。

使用时需将终浓度调整为25µM（购自Sigma，G8415，100g，分子量：147.13）。

配制方法：电子天平称量谷氨酸1.4713g，即0.01mol=10mmol，溶于200ml超纯水中，配制为50mM的谷氨酸母液。

例：500ml的Neurobasal Medium中加入Glutamate母液（50mM）250μl，此时终浓度约为25μM。

5）胰蛋白酶：0.25%（购自Hyclone，SH30042.01，100ml）。

6）阿糖胞苷（AraC）母液：10mM，(阿糖胞苷，1：1000稀释用)（购自Sigma，C1768，100mg，分子量：243.22）；配制方法：100mg/243.22≈0.41mM，加入41ml超纯水溶解，配制成10mM的AraC母液。