新生鼠海马、皮层神经元原代培养

胎鼠海马神经元体外原代培养与鉴定【关键词】胎鼠海马神经元；体外原代培养；鉴定doi：10.3969/j.issn.1004-7484（x）.2013.06.568 文章编号：1004-7484（2013）-06-3323-02在神经生物学及相关学科领域中，原代培养的神经元因其排除机体生理病理状态干扰的影响而成为较为理想的实验模型，是研究神经元形态、物质代谢、分子机制及电活动的主要前提。

海马是大脑边缘系统重要的组成部分，在学习、记忆、情绪反应及中枢神经系统疾病的病理生理变化方面发挥着重要作用。

对于原代海马神经元的培养，主要供体主要有胎鼠与新生鼠两种，培养方法有含血清培养和不含血清培养两种。

我们通过实验摸索，取得一种较稳定且简便实用的方法，能获得较高存活率的海马神经元。

1 材料与方法1.1 实验动物来源清洁级孕17-19天sd大鼠上海斯莱克实验动物有限责任公司提供，生产许可证号：scxk（沪）2012-0002。

1.2 主要仪器与试剂 co2培养箱（thermo公司），倒置相差显微镜为（olympus公司），激光共聚焦显微镜型号为zeiss lsm710，小鼠抗大鼠classⅲβ-tubulin单抗（beyotime公司），nse免疫组化染色试剂盒、dab显色试剂盒（武汉博士德生物工程有限公司），b27添加剂、neuralbasal、hoechst 33342sigma公司），dmem（高糖型）培养基、胎牛血清（gibco公司）。

1.3 培养方法与鉴定取孕17-19天大鼠，水合氯醛麻醉后70%酒精浸泡20min，颈椎脱臼法处死孕鼠，将子宫立即放入冰浴含dmem 的大平皿中，在解剖显微镜下取下海马组织，剪成约1mm×1mm×1mm 大小，用0.125%胰蛋白酶于37℃、5%co2培养箱中消化15min，中间每隔5min振荡一次，加入含10%fbs的dmem液终止消化，巴氏管轻柔吹打，200目筛网过滤。

海马神经元的培养总结1.新生大鼠海马常规取法：断头，线剪剪去皮肤，组织剪从椎管纵向剪开颅骨，再颅顶横向剪一刀。

暴露两侧大脑半球，用小弯镊翻出大脑，延纵裂分别向两侧翻开大脑半球，在底部可见新月形的海马，用眼科镊取出置于冰浴的盐溶液中，在解剖镜下剥离周围组织和血管膜。

2.培养基：我用的接种培养基是DMEM/F12+10的胎牛血清＋胰岛素＋葡萄糖＋谷胺酰胺，维持培养基里就是多加了5uM的阿糖胞苷。

培养液的pH调至6.8—7.4可，最好不要调至7.4或高。

一般在培养液放置两周后，加入终浓度为2mM的谷氨酰胺3.胰酶：酶用0.125的。

其实一次性消化比较简单，关键是消化时间不要太长，不知你用多长时间，一般是15-20分。

4.多聚赖氨酸的配置：可以用去离子水配, 也可以用D-HANKS也配(我用的配方),或者PBS 效果都差不多. 一般先配成1mg/ml的母液, 用高压过的滤器过滤,最好分装以后放在-20度, 用的时候再稀释至0.01mg/ml.5.铺板：我的办法是将盖玻片直接经泡酸后要反复的洗干净，用单蒸后用双蒸水。

后放在75％的酒精中浸泡半个小时以上，在超净台中取出后用酒精灯烧一下，注意不要太久，以防破碎，后放在24或6孔板中，加入稀释好的多聚赖氨酸，室温放置3小时以上或过夜，切记不要照紫外，可以在上面覆盖东西。

结束后回收多聚赖氨酸，并用灭菌水或PBS等清洗三遍以上即可使用，我用的效果非常好。

6. 1. 盖玻片洗净之后, 需要泡酸过夜处理, 这样玻片会比较干净, 养原代背景会干净的多. 就算是新的也要洗(曾经有过教训).2.包被多聚赖氨酸用之前要用高压的去离子水洗3遍,再用D-HANKS过一遍.3. 多聚赖氨酸包被时,如果有条件可以放在4度振摇过夜,效果更佳.4. 神经元细胞种植之前1小时把种植培养基加进去,会提高细胞活力.7.纯化细胞方法：1.差速贴壁：接种前可将制备的细胞悬液放入底面积为75cm2的培养瓶中（未包被），然后放入37度，5%CO2培养箱中半小时，然后再过滤，转移至培养皿/瓶中。

神经细胞原代培养从动物（大鼠或小鼠等）的胚胎或新生动物的脑组织取下某一局部区域，分离细胞，培养在培养容器后不再移植，常称为原代神经细胞培养。

一、培养前准备1. 器械和器皿器械：外科剪、镊子、虹膜剪等、小剪刀、细镊子和虹膜小刀等各种金属器械如解剖器械，使用后及时刷洗干净，用酒精棉球擦拭后晾干，或经60℃烘干，以防生锈。

由于湿热消毒对手术器械容易可用70－80％酒精浸泡1小时以上消毒。

器皿：1)玻璃瓶及相应的胶塞或胶木螺旋盖，2)用于分装血清、多聚赖氨酸、解剖液、各种盐溶液和培养液等。

3)培养瓶、盖玻片4)培养用的盖玻片必须不含铅、不发霉，可用0.2N盐酸浸泡10分钟，用蒸馏水洗2次，每次10分钟，然后移入丙酮或乙醇浸泡10分钟，再用双蒸水洗2次，每次10分钟，烘干待消毒。

凡组织学用过的旧盖玻片一般不用。

5)移液管、吸管、烧杯、离心管和培养皿。

6)塑料培养皿（35mm）、塑料培养板（6、24、96孔）。

辅助工具：放置试管、吸管和玻璃瓶等的架子。

2. 培养基和培养用液的配制1) 培养基质：有多聚赖氨酸、牛皮胶原和鼠尾胶原。

本室目前常用分子量为7-140000多聚赖氨酸（Poly-L-lysine，浓度为0.1mg/ml。

2) 平衡盐溶液：主要以无机盐和葡萄糖配制而成。

各种平衡盐溶液主要的不同点在于NaCl的浓度、离子浓度及缓冲系统的不同，可根据实际需要选用适当的平衡盐溶液。

3) 培养液：目前已有现成的干粉出售，按说明书进行配制即可。

神经细胞培养需高糖，培养液应含有或加葡萄糖至6g/L。

目前培养海马神经元可选用B27无血清培养液。

4) 血清：有胎牛血清、小牛血清和马血清等。

分装成小瓶，4℃保存备用（分装前需56℃灭活30分钟）。

5) 胰蛋白酶溶液：用于分离细胞。

先用少量灭菌三蒸水将胰蛋白酶粉末溶成糊状，然后补水至2.5%浓度，振荡摇匀，4℃过夜，待完全溶解后用滤器过滤灭菌，并分装成1-2ml冻存。

用前以D-Hanks平衡盐水或其他无钙镁离子溶液溶解稀释至0.25%或0.125%。

原代细胞培养步骤(1)、取新生SD大鼠3只，入75%酒精消毒2分钟，断颈取脑。

(2)、将新生鼠脑放入盛有冷的D’Hanks平衡盐溶液的玻璃培养皿内，置冰盘上，于解剖显微镜下仔细剥除脑膜(3)、将分离的海马组织放入另一个盛有冷的D’Hanks溶液的玻璃培养皿内，用眼科剪剪成小碎片，并移入15(4)、向离心管中加入37℃ 0.25%胰酶溶液，每6个海马组织加1ml胰酶消化液，放入37℃培养箱中孵育10-1即可。

900rpm离心2min。

(5)、吸除胰酶消化液，加入等量的37℃种植液以终止消化，置室温10min。

、加入2ml种植液，以抛光的滴管吹打约15次，分散细胞，静置10min（如仍有组织块，应用200目筛网(7)、调整细胞密度，以90-320/mm2的密度种于六孔板内。

置37℃ 5%CO2培养箱中培养。

、24h后全部吸除种植液，更换成Neurobasal + 2% B27培养液培养。

此后每周以此液半量换液2次。

培养8-10天进行下一步实验。

投票1收藏1实验已经开始了，遇到了其他一些新的问题，但在此我想说说我取新生大鼠海马的体会：象有战友说的那样，我刚开始也是成年大鼠上练习的，一切都还比较顺利，但是要取新生1天的大鼠海马是否要困难的多，主要是由于脑组织太嫩了，稍不注意就化成泥了。

1.冻僵老鼠后，用酒精浸泡消毒，然后用PBS液清洗一下，剪下鼠脑。

2.游离脑部皮肤，用眼科剪经枕骨大孔沿矢状缝剪开颅骨，轻轻游离颅骨和脑组织后，在顶骨和顶间骨之间向左右剪开，然后剪掉颅骨，尽可能往两侧剪，使脑组织充分暴露，以便下一步剥离脑皮质和游离海马。

3.用眼科剪分别两侧在大脑皮质中间横向剪开，深约1mm，然后将整个脑置于装有PBS液的培养皿中，要使液体没过脑组织。

用刮针（用缝衣服的针插在一次性筷子里自制的，用针鼻儿那头）沿着刚才的切口轻轻的向后刮除皮质，切忌过深，完全显露出海马后，从两侧游离，使其漂浮于液体中，然后用牙刮匙从连接处将整个海马从脑中分离出来。

胎鼠、新生大鼠原代海马神经元培养及鉴定熊丽娇;郭阗廷;曾治平;黄志华;曾靖【摘要】目的:建立胎鼠、新生鼠海马神经元体外培养方法.方法:分别取胎鼠、新生鼠海马,消化后种植,用含有2%B27的neurobasal培养液培养,第3天加入5 μmol·L-1的阿糖胞苷,换液后继续培养,以获得纯度较高的海马神经元.培养第3、7天观察细胞生长及突起情况,用neurofilament抗体以免疫荧光方法鉴定神经元细胞.结果:海马神经元种植24 h后贴壁,7天时神经元突起相互连接成网络.经neurofilament染色,培养细胞阳性率高,新生鼠原代培养海马神经元阳性率达(89±3.4)%,胎鼠海马神经元阳性率达(98±1.5)%.结论: 本方法培养出的胎鼠、新生大鼠海马神经元纯度较高,可作为海马神经元模型用于进一步研究.【期刊名称】《赣南医学院学报》【年(卷),期】2017(037)003【总页数】3页(P354-356)【关键词】海马神经元;细胞培养;胎鼠;新生鼠【作者】熊丽娇;郭阗廷;曾治平;黄志华;曾靖【作者单位】赣南医学院第一附属医院全科医学VIP科;赣南卫生健康职业教育学院外科教研室,江西赣州 341000;赣南医学院第一附属医院全科医学VIP科;赣南医学院;赣南医学院【正文语种】中文【中图分类】R285.5海马是大脑边缘系统重要部分，神经元分布高度集中，在认知、记忆、情绪、植物神经系统方面起着不可替代的作用[1-3]。

海马神经元体外培养模型已经成为研究神经元发育分化、神经疾病的发生机制的重要技术手段[4-6]。

海马神经元体外培养文献报道方法多样，动物来源主要有胎鼠和新生鼠，根据实验条件，我们摸索出了原代胎鼠、新生大鼠的海马神经元培养方法，并进行了细胞鉴定，获得了高纯度的胎鼠、新生大鼠海马神经元。

1.1 材料1.1.1 实验动物孕17天SD大鼠及出生24 h内的SD大鼠。

1.1.2 主要试剂 DMEM培养基、neurobasal培养基、胎牛血清(FBS)和B27培养基添加剂(Gibco公司)、青链霉素、胰酶、多聚L赖氨酸(sigma公司)。

原代海马神经元细胞培养-CAL-FENGHAI.-(YICAI)-Company One1原代海马神经元细胞培养溶液的配制：(1) 4%多聚甲醛溶液：4g多聚甲醛溶于100ml pH=7.4的0.01mol/l PBS中，混匀过滤，室温保存。

(2)磷酸盐缓冲液（PBS）（0.01mol l-1）：KH2PO4，0.1g；Na2HPO412H2O，1.7g；KCl，0.1g；NaCl，4.0g，双蒸水加至500ml，pH=7.2～7.4。

用0.2m滤膜过滤，4℃保存。

(3) 1%蛋白酶的配制：用磷酸缓冲液（pH=7.2～7.4）配制成浓度为1%的胰蛋白酶母液冻存。

使用时，用解剖液稀释至0.25%。

(4) 培养皿涂被多聚赖氨酸：配制0.01%的多聚赖氨酸，分装冻存。

将上述多聚赖氨酸放入培养皿中涂两遍，自然晾干后备用。

(5) 解剖液：葡萄糖，3.0g；蔗糖，7.5g；NaCl，8.0g；KCl，0.4g；Na2HP047H20，0.18g；KH2PO4，0.03g；HEPES，2.14g；加双蒸水1000ml，调pH=7.0～7.4，过滤，4℃保存。

(6) 种植液：DMEM 79%，胎牛血清，10%；马血清，10%；谷氨酰胺培养液1%。

(7) 饲养液：Neurobasal培养基，97%；谷氨酰胺培养液，1%；B-27，2%。

(8) 阿糖胞苷：用双蒸水配制成浓度为l mg ml-1的母液储存。

用0.2m 滤膜过滤，-20℃储存。

使用时，取6l母液加入2ml培养液中，终浓度为3g ml-1。

（根据实验情况调整浓度）大鼠原代海马神经元细胞的培养(1) 新生SD大鼠（＜12h），75%酒精浸泡消毒后断头，剥离出全脑并将其放入盛有解剖液的培养皿中。

(2) 在解剖液中解剖大脑，分离出海马，移入另一盛有解剖液的培养皿中。

在分离出全部的海马后，去除血管等组织，然后用剪刀将海马分成数小块，放入盛有0.25%胰蛋白酶的培养皿中，将培养皿放入9%CO2、37℃消化20min。

小鼠大脑皮层和海马神经元的分离与培养一、玻片的准备A．玻片的清洗1. 第一天，将玻片(12mm，633009，Carolina) 逐片置于装有浓硝酸(HNO3) 或者洗液的平皿中，混匀，然后浸泡过夜。

2. 第二天，将玻片放在有单蒸水的陶瓷盘中，搁在摇床上晃动，速度为200rpm，将玻片上的硝酸残液清洗干净。

每10min换水一次，要换20次以上。

晚上置于双蒸水中浸泡过夜。

3. 第三天，换双蒸水，重洗两次，每次速度为200rpm ，时间为60min，去除玻片上的离子和其它杂质，最后再换用无水乙醇，清洗三次以上。

洗完后置于小烧杯中，拿到细胞房超净台将玻片浸泡在无水乙醇中室温保存。

4. 解剖小鼠取细胞前两天将玻片从无水乙醇中取出，在酒精灯焰上烘干，稍微在空气中停一下，再放到灭菌的parafilm膜上。

玻片高温易碎，速度要快。

完成后在紫外下照射1h。

B. 玻片的包被（PDL包被）用0.1M的硼酸钠溶液将PDL配成0.01mg/ml PDL的溶液(pH 8.4)。

1.准备500ml 0.1M的硼酸钠（Na2B4O7·10H2O, B3545-500G，Sigma）溶液。

2.在超净台中，往一整瓶Poly-D-Lysine（PDL，5mg/ml，Sigma, P6407-5MG）中加入25ml的该硼酸钠溶液。

盖上瓶盖，溶解5min，可以轻轻晃动。

然后将该溶液加到剩下的硼酸钠溶液中。

即为所配溶液，0.22μm过滤，用锡纸包好，4℃避光保存。

3.使用的时候，6/12/24孔板每孔加1ml/500μl/250ul的PDL溶液，12mm盖玻片每片加50μl的PDL溶液，放在超净台中，室温包被4hrs或者过夜。

4.第二天，紫外照射超净台1-2hrs，再将PDL吸干。

将板和玻片盖揭开，室温晾过夜。

5.第三天，将每个孔/玻片用灭菌水洗两遍，吸干，盖上盖，避光待用。

二. 大脑皮层与海马的解剖A. 解剖前的准备1.解剖器械的灭菌解剖前将器械放在铝饭盒中，倒入75%乙醇，并在超净台中放入适量卷纸，打开紫外杀菌1-2hrs。