小鼠大脑皮层神经元原代细胞培养

一、实验背景神经元是神经系统中最基本的结构和功能单位，研究神经元生物学特性对于理解神经系统疾病和开发新的治疗方法具有重要意义。

神经元原代培养是研究神经元生物学特性的重要方法之一，它能够模拟体内神经元的生长和发育过程，为神经元生物学研究提供了一种有效的手段。

二、实验目的1. 掌握神经元原代培养的方法和步骤。

2. 观察神经元原代培养过程中的形态学变化。

3. 分析神经元原代培养过程中细胞生长、增殖和分化情况。

三、实验材料1. 实验动物：E17-18d孕大鼠或E14-16d孕小鼠。

2. 试剂：含10%胎牛血清的DMEM培养基、神经元维持培养基(NeurobasalB27谷氨酰胺）、胰蛋白酶、抗神经丝抗体、荧光染料等。

3. 仪器：细胞培养箱、倒置显微镜、离心机、移液器等。

四、实验方法1. 取E17-18d孕大鼠或E14-16d孕小鼠大脑皮质，用胰蛋白酶消化，制成细胞悬液。

2. 将细胞悬液接种于培养皿中，置于37℃、5%CO2的培养箱中培养。

3. 每天观察细胞生长情况，记录细胞形态学变化。

4. 培养第3天，进行细胞计数，观察细胞生长速率。

5. 培养第5天，进行免疫荧光染色，观察神经元纯度。

6. 培养第10天，进行神经元分化实验，观察神经元功能。

五、实验结果1. 细胞形态学观察：神经元原代培养过程中，细胞从圆形逐渐转变为梭形，并逐渐出现突起，形态逐渐成熟。

2. 细胞生长速率：培养第3天，细胞生长速率为（2-4）×10^4个/皿；培养第5天，细胞生长速率为（4-8）×10^4个/皿。

3. 神经元纯度：免疫荧光染色结果显示，神经元纯度达到90%以上。

4. 神经元分化实验：神经元分化实验结果显示，神经元在培养过程中逐渐分化为不同类型的神经元，如运动神经元、感觉神经元等。

六、实验讨论1. 神经元原代培养过程中，细胞形态学变化与体内神经元生长和发育过程相似，为研究神经元生物学特性提供了有力手段。

2. 细胞生长速率受多种因素影响，如培养基、温度、CO2浓度等。

小鼠细胞原代培养取材方法原代培养是指直接从体内取下的细胞、组织和器官，经过清洗、剪切、分散等步骤后，立即进行培养的过程。

小鼠细胞原代培养取材方法主要包括以下步骤：1. 实验前准备：在超净工作台或生物安全柜中进行，确保无菌环境。

2. 取材：选择健康的成年小鼠，使用颈椎脱臼法处死小鼠。

用70-75%酒精对烧杯进行消毒，将整个小鼠浸入盛有纯酒精的烧杯中浸泡1分钟进行消毒。

3. 打开腹腔：取出小鼠，将其放在不锈钢手术盘中，用无菌手术剪打开腹腔。

4. 取出组织：小心将所需组织从体内取出，放入无菌培养皿中。

5. 清洗组织：用70-75%酒精擦拭培养皿外周后，将培养皿移至超净工作台或生物安全柜中，用含双抗的Hanks液洗涤组织数遍以去除血污。

6. 剪切组织：在体视显微镜下操作，用无菌手术器械去除多余组织，用解剖镊子或眼科剪将组织剪碎至1立方毫米的肉糜状。

7. 消化组织：将剪碎的组织放入含解离液或培养基的50ml离心管中，用10ml弯头滴管对组织进行吹打5-10次，然后用1ml枪头的吹打组织，最后用200μl的尖端进行吹打。

8. 过滤分散：将上述组织悬液通过70μm过滤器过滤，切碎和分散的组织悬浮液。

9. 离心收集细胞：在1200rpm、4℃下离心10分钟，弃掉上清液，加入配置好的细胞培养基重悬细胞。

10. 接种细胞：将细胞接种于经多聚赖氨酸预处理的培养瓶或培养板中，置于37℃、5%CO2的培养箱中进行培养。

注意事项：取材过程应在无菌环境中进行，确保整个过程不受到污染。

操作时要小心，避免损伤组织。

使用的仪器和器皿均应进行消毒处理。

培养基和试剂应选择适宜的种类和浓度。

培养条件要保持恒定，包括温度、湿度、CO2浓度等。

在实验过程中要密切观察细胞生长情况，及时发现和处理异常情况。

以上是小鼠细胞原代培养取材方法的简要步骤，具体操作可能因实验需求和条件而有所不同。

建议在进行实验前仔细阅读相关文献和资料，并咨询专业人士的建议和指导。

神经元原代培养方法
从孕17-18天的雌鼠的胎儿分离神经元细胞。

孕雌鼠麻醉然后解剖，胎
儿收集到HBSS-1中然后快速断头。

剥离脑膜和白质后，大脑皮质收集
入 HBSS-2 液中机械磨碎。

皮质碎片移到有0.025%胰酶的HBSS-2液中3 7°C消化15分钟。

胰酶消化后，细胞用含有10%胎牛血清的HBSS-2液冲
洗两次，用神经基础培养液重悬细胞（培养液添加了0.5mM左旋-谷氨
酰胺，25μM左旋-谷氨酸，2%B27和0.12mg/mL庆大霉素）。

以1×105c
ell/cm2接种到事先用多聚赖氨酸包被的培养皿上，放到37°C，5%CO2
湿温培养箱里进行培养。

每3天用吸管换液，一次换0.5mL。

体外培养8
天细胞就能用于实验。

选用17-18天的胎鼠能够提高神经元培养的效率，因为与乳鼠相比胚胎
组织的细胞连接还很少。

因此，用乳鼠会使神经元的分离更加困难，
会造成细胞连接不可逆的损伤，细胞之间的共同的轴突和树突更容易
发生损伤。

另外，用出生后1天内的大鼠皮质培养容易有胶质细胞污染，而用胎鼠则可以避免这种情况。

如果用的是乳鼠，一般是在培养36个
小时后加入阿糖胞苷，抑制胶质细胞生长。

另外，如果把分化的影响看成是考虑的重要因素，可以用培养4天的、
8天的、18天的细胞。

其中一个例子可以是观察毒性物质对小孩和成年
的不同效应。

小鼠背根神经节神经细胞的原代培养新方法小鼠背根神经节神经细胞原代培养是神经学研究、药物筛选及细胞病理学研究中必不可少的一环。

本文将介绍一种新的小鼠背根神经节神经细胞原代培养方法的步骤及注意事项。

步骤1: 动物处理。

用取出小鼠的背根神经节放入无菌的PBS缓冲液中搅拌7-8分钟，使神经节中的细胞离体，并通过多次离心来去除PBS缓冲液。

步骤2: 细胞悬浮。

将含有神经细胞的细胞悬液用1mL冰冷的PBS缓冲液洗涤2次。

再用1mL冰冷的70%酒精进行紧密覆盖，静置5分钟。

再用PBS缓冲液洗涤5次，最后用DMEM/F-12添加10%胎牛血清（FBS）调整至适当浓度。

步骤3: 细胞培养。

将细胞悬液转移到含有0.1%聚赖氨酸的DMEM/F-12培养基中，距离表面1cm左右，进行孵育24-48小时。

孵育室应控制在37℃的恒温条件下，同时CO2含量应设定在5%。

步骤4: 原代细胞出现。

24-48小时后，可见到原代神经细胞在培养皿中生长，而其他非神经细胞则无法生长。

这是因为神经元比其他细胞易受到聚赖氨酸的作用，从而对组织细胞进行筛选。

步骤5: 细胞传代。

当原代细胞数量足够时，可进行细胞传代。

将同等的DMEM/F-12培养基中加入0.5%胰酶，将原代细胞取下进行培养。

注意事项：1.处理过程中必须保持无菌，防止微生物污染。

2.神经节处理过程中的时间要注意，过久会导致细胞死亡，过短则分离不完整。

3.使用的培养基及化学试剂要质量优良。

4.培养条件要严格控制，CO2含量及温度要保持恒定。

本文介绍的方法较为简单易行，对于初学者或初学者也容易了解。

但细胞培养中实验操作需要非常谨慎，为保证实验的准确性和有效性，一定要保证实验过程中的无菌、温度、CO2含量和实验技术的高效性。

原代神经细胞培养新生鼠神经元细胞的培养准备工作：1、解剖器械一套（实验室有专门用于细胞间取材用的成套器械），需提前一天灭菌，过夜烤干。

2、试剂、溶液：Neuralbasal培养基（2mM glutamine）；D-PBS缓冲液；0.25%trypsin/0.02%EDTA消化液；0.05%poly-lysin。

3、包被玻片：干烤灭菌12 x 12mm2玻片，12孔板。

包被过程：0.05%poly-lysin滴于置培养板中的盖玻片上（注意勿溢出玻片），37℃放置12hr后纯水洗3遍，晾干。

4、操作中所用枪头均用剪刀剪去枪头尖，然后在酒精灯上迅速过一下抛光。

取材：1、从-200C取出三个冰袋，预冷若干皿D-PBS，一大皿用于冷却剥出的脑子，另外的35mm的皿用于冷却分离出的脑组织，如：海马，皮层，下丘脑等，分离几个部位就预冷几小皿D-PBS，小皿盖子上做好标记，第三个冰袋上放一皿盖，上面放灭过菌的滤纸，用于剥离脑子的操作。

2、取1-3天鼠，75％酒精浸泡片刻后，用大剪子断头处死。

3、弯头眼科剪剪开颅骨，取出完整脑至盛有预冷D-PBS的培养皿中，在体式镜下分离相应部位的组织,分别放在相应的皿中。

4、将组织块用弯头眼科剪剪碎，每小块约2mm3左右，用枪移入5mlEP中，稍为沉淀1分钟，吸弃上清，加入0.25%trypsin/0.02%EDTA，37℃消化10-15分钟左右，期间每3分钟颠倒几下。

注：每四个海马用胰酶1ml，每个皮层用胰酶2ml。

5、消化完毕，每毫升胰酶加入100ul血清以终止胰酶，颠倒混匀；1000rpm，4分钟，离心沉淀。

6、吸弃上清，注意不要将组织吸出。

7、加入37℃预热的1-2ml DMEM／10%FBS，用枪头吹打20下左右，此时液体浑浊，组织块明显变小。

8、放置沉淀3分钟左右，可见组织块沉底，吸取上清，其中包含所要的细胞。

9、计数，将细胞密度调整至2－4 x 10 5 /ml后接种于预先用poly-lysine包被过的盖玻片或皿上，100ul每玻片（12 x 12mm玻片）。

十、1.细胞种类：原代小鼠大脑皮层神经元 2.培养的天数：6d 3.放大倍速：20X4.培养基种类：DMEM/F12+2%B275.细胞状态与特征简述：细胞体积增大，突触发育完全，开始形成网络十一、1.细胞种类：原代小鼠大脑皮层神经元 2.培养的天数：7d 3.放大倍速：20X4.培养基种类：DMEM/F12+2%B275.细胞状态与特征简述：1抗Rabbit Anti-NSE，二抗Cy3-羊抗兔IgG，DAPI复染细胞核十二、【原创】原代培养大脑皮质神经元甲苯胺兰染色1、细胞种类：SD大鼠大脑皮质神经元2、培养天数：6天3、放大倍数：倒置显微镜200倍4、培养基种类：Neurobasal-B275、细胞状态及特征：胞体呈椭圆形、梭形、贴壁生长。

神经网络明显，细胞核淡染，偏于一侧。

尼氏颗粒明显，分布于胞浆。

十三、【原创】神经干细胞1.细胞种类：SD大鼠海马来源的神经干细胞；2.培养的天数：11天；3.放大倍速：（相差显微镜）200倍；4.培养基种类：DMEM-F12；5.细胞状态与特征简述:细胞呈克隆球状生长十四、1.细胞种类：SD乳鼠海马神经元； 2.培养的天数：12D； 3.放大倍速：100倍；4.培养基种类：90% DMEM+5% HS+1% N2 Supplement+1% glutamine+1% Penicillin-Streptomycin+2% B27 Supplement；5.细胞状态与特征简述:海马神经元某蛋白免疫荧光(FITC标记)十五、【原创】原代皮质神经元1、细胞来源：新生SD大鼠2、培养的天数：10d3、放大倍数：倒置显微镜×2004、培养基种类：DMEM/F12＋10％FBS＋双抗5、细胞特征简述：采用尼氏染色法—可见偏向胞体一侧的空泡状核，另外周边有深染的尼氏小体颗粒，神经细胞网络形成明显。

十六、【原创】原代培养神经干细胞抓拍分裂!1、细胞种类：大鼠神经干细胞分裂2、培养天数：3天3、放大倍数：倒置显微镜100倍4、培养基种类：DMEM+10%新生牛血清5、细胞状态及特征：呈椭圆形，贴壁生长。

世界上最完善最详细的神经元原代培养完全黄金版[精华]序言：国内外关于原代培养有很多文献，不幸的是，没有一篇是详细的，没有一篇解答过why. 为了让大家少走弯路，根据我杀过3000只老鼠的经验，我把我这几年摸索的经验和大家分享，请求多投几票得几个叮当。

相信你follow我的这篇文章一定会做的很好。

我的标题说的很像吹牛，但是我是严肃认真的说的，I earn it.note:这篇文章全是我个人的经验，99。

9%原创，经过无数失败的到的最完美的原代神经元培养法，除了最后那一副图是来自下面第2行那篇文献，所以我才说是99.9%原创。

（注：附录的图是常用的消化酶对实验的存活率影响，来自下面链接里的文献）另外，成年鼠的原代培养我没有摸索过，推荐一篇文献在我以前的帖子（无需叮当）（/bbs/post/view?bid=156&id=17651341&sty=3）本篇专门讨论胎鼠和新生鼠神经元的原代培养。

1.材料选择。

一定要严格按照国际上，NCBI数据库，其他文献的材料一致。

胎鼠就要胎鼠，新生鼠就要新生鼠，不能混淆。

因为新生鼠有一些受体，在培养的工作中失去功能，会不能再生，比如NMDA受体。

和文献不同会导致错误结论，甚至困惑。

很多人写信问我新生鼠的培养问题，我回答用新生鼠的实验很少，八成是你自己搞错了实验对象，请确认国际上的相关研究文献所用老鼠，再来问我下面的问题。

2，培养基选择（neurbasal/neurobasal-a,invitrogen Co.ltd)。

我强烈不建议用血清培养。

原因是：首先，血清刺激胶质细胞和杂细胞分裂，最后非常影响神经元产量；其次，为了抑制胶质生长，往往要加入阿糖孢苷。

严重的毒性会影响许多灵敏实验；再次，最重要的，血清培养的细胞状态很不均一，从正常到凋亡都有，严重影响试验准确，而无血清专用培养基所有的正常细胞都处于一样的状态，要么都好，要么都差，高度一致。

Invitrogen/GIBCO 无血清培养基neurobasal(neurbasal-A)被认为是最标准，最好的培养基。

原代神经元细胞的分离培养（小鼠）
本实验是自己实验室平时做的（仅供参考）
实验材料的准备：出生24h以内的小鼠若干只；预冷的pbs（不含钙、镁离子）；DMEM（高糖）培养液（实验之前预热）；75%酒精；尖头镊子、小剪刀；含EDTA的胰酶（实验之前预热）；神经元细胞培养液；灭菌的1.5mlEP管若干只
实验阶段：（整个操作保持无菌）
1，取小鼠用酒精擦拭全身，用剪刀剪下小鼠头部，小心剥下头皮和脑壳后取出整个脑子放入预冷的pbs中（也可以把pbs放在冰盒上面）
2，用剪头镊子小心剥下脑膜、小脑和大脑中的血管后将其放进1.5mlEP管中
3，用小剪刀反复剪（感到手很累了为止），然后用1ml枪头将其加入预热的胰酶中，反复吹打几次后放进37℃ 5%CO2培养箱中孵育20min，期间晃一晃有利于重复消化
4，消化时间到了之后，用含血清的DMEM培养液终止消化后，用吸管反复吹大几次
5，过筛网：用大概200目的筛网过滤后，计数种于培养皿中（培养皿提前一天用多聚赖氨酸包被）（6cm dish种300w个为好）
6，24h后，换成神经元培养液，48h后加入5-氟-脱氧尿苷（终浓度20ug/ml），以后每3-4天换半液。

小鼠大脑皮层神经元原代培养步骤1.确定实验目的：在进行任何实验之前，首先需要明确实验的目的和研究问题，以确定所需的实验材料和方法。

2.准备实验材料：准备所需的实验材料，包括培养基、细胞培养试剂和培养器具等。

3.小鼠胚胎的取材：通过异交法得到小鼠胚胎，通常在胚胎发育第15-17天时取材。

使用无菌饲料给小鼠提供丰富的营养，使其胚胎发育良好。

4.分离大脑皮层组织：将小鼠胚胎处死后，将其大脑取出并置于无菌的PBS缓冲液中。

然后用剪刀将大脑的外围组织移除，只保留皮层组织。

5. 组织的化学消化：将取出的大脑皮层组织放入含有无菌PBS缓冲液的培养皿中，用Pipettor将组织切碎成较小的块状，并加入含有0.05%胰蛋白酶和0.1%DNA酶的消化液，室温下消化15-20分钟。

6.组织的离心：将消化液中的细胞悬液经过离心处理，用PBS缓冲液洗涤1-2次，去除消化液中的酶和杂质。

7.细胞计数和分装：用显微镜和细胞计数板对细胞悬液进行计数，通过稀释和分装的方法，得到所需的细胞浓度。

8.细胞接种：将细胞悬液均匀地滴加到含有预先涂覆了聚-L-赖氨酸的培养皿中，使细胞均匀附着在培养皿的表面上。

9.培养基的添加：在细胞接种后，将预先配制好的培养基加入培养皿中，以提供细胞所需的营养和生长因子。

10.培养条件的控制：将培养皿放置于恒温培养箱中，温度为37°C，湿度为95%，CO2浓度控制在5%左右。

每隔一段时间，检查培养皿中细胞的生长情况，确保细胞的健康生长。

11.细胞形态观察：使用倒置显微镜观察细胞的形态变化，观察细胞的神经突起、细胞形态和相互作用等。

12.细胞维持和传代：根据实验需要，定期更换培养基以提供细胞所需的营养和生长因子。

当细胞达到80-90%的密度时，可以进行细胞传代，使细胞继续生长。

小鼠大脑皮层神经元原代培养是一项复杂的实验技术，在操作过程中需要注意无菌操作、细胞的取材和处理、培养条件的控制等方面的细节。

小鼠原代神经元提取
1. 背景介绍
小鼠是神经科学研究中常用的实验动物，尤其是小鼠原代神经元是研究神经细胞生长、形态及功能的理想模型。

提取小鼠原代神经元是展开这类研究的重要步骤。

2. 提取方法
2.1 原代神经元分离
将小鼠脑的皮层或海马区取出，用酶消化等方法分离出原代神经元。

其中，较为常用的来源是阿霉素（Ara-C）处理后，剥离出菜花状星形胶质细胞后得到神经元。

2.2 细胞贴附
将原代神经元移植到附着于玻璃片或培养皿的细胞培养基中，使其附着并生长。

2.3 细胞培养
在培养基中加入营养物质，如神经生长因子、谷氨酸等，加速神经元的生长，并使组成更加丰富多彩。

2.4 细胞鉴定
通过标记染色、光镜观察等手段，检测培养出来的细胞是否为神经元。

3. 应用领域
小鼠原代神经元的提取及培养成为研究神经科学和神经元特性的
重要手段。

研究重点主要包括神经元的细胞膜特性、各种信号转导途径、神经元与神经胶质细胞之间的相互作用及神经元发育等问题。

此外，还可运用于药理学研究、癫痫及脑防护药物的开发研究等。

4. 注意事项
提取方法中，对原代神经元的提取、分离及培养有许多细节问题，包括材料选择、酶消化时间调节、培养基添加条件等。

在实验过程中，需要注意操作规范化、洁净化，并遵守实验室安全规范。

原代海马及皮质神经元培养方法海马和皮质神经元是神经系统的重要组成部分，在研究神经生物学和药物疗效等方面具有重要价值。

为了研究这些神经元的生理特性和功能，我们常常需要从动物体内分离和培养这些神经元。

以下是针对原代海马和皮质神经元的培养方法。

1.实验动物准备：首先，需要准备实验所需的动物。

一般情况下，小鼠是最常用的实验动物。

在实验进行前，需要确保动物符合实验伦理和动物保护要求，并获得相应的实验动物使用许可。

2.动物脑组织的获取：在实验动物处死后，需要尽快取出脑组织。

使用无菌技术将大脑取出，并将其放入生理盐水或培养基中。

3.脑组织的分离和消化：将脑组织放入含有0.02％的溴酚红的磷酸缓冲生理盐水中，用无菌剪刀和镊子将其剪碎成小块。

然后，将组织块放入含有0.25％胰酶的溶液中，在37℃的恒温培养箱中消化2至5分钟。

然后，将溶液过滤并离心，以去除细胞碎片和大块组织。

4.细胞的分离和培养：将离心沉淀涂布在含有25％培养基和10％胎牛血清的培养皿中，然后放入37℃的恒温培养箱中。

培养基的成分可以根据具体需要进行调整。

细胞会附着在培养皿上，并开始生长和繁殖。

在细胞培养过程中，需要定期更换培养基，以提供细胞所需的营养物质。

5.细胞的处理和分选：在培养4至7天后，细胞会形成较为密集的神经元网络。

在这个时候，可以通过处理和分选细胞来提高神经元的纯度。

例如，使用抗体标记法可以针对神经元选择性地杀死胶质细胞。

此外，还可以使用细胞遗传方法，如转染特定基因或使用荧光探针标记细胞。

6.测试和分析：经过特定时间的培养后，可以对原代海马和皮质神经元进行测试和分析。

这些测试和分析可以包括细胞生存率、纯度、形态特征、电生理活性、细胞内信号和细胞功能等方面的内容。

这些测试和分析的方法可以通过显微镜观察、电生理仪器、蛋白质和基因分析等手段进行。

7.特殊处理：有时对于特定的研究需要，还可以对原代海马和皮质神经元进行特殊处理。

例如，可以通过给予特定药物、激素或其他刺激条件，来模拟不同的疾病模型或研究特定功能。

神经细胞培养实验报告摘要：神经细胞培养实验是一种常用的实验技术，可以用于研究神经细胞的生理功能和疾病机制。

本实验通过对小鼠皮层神经细胞进行培养，观察细胞的形态特征、生长情况和突触结构的发育，以探究神经细胞的发育过程和突触的形成。

实验结果表明，在适当的培养条件下，小鼠皮层神经细胞可以有效地培养并形成功能性突触。

1. 引言神经细胞是大脑和神经系统的基本组成单位，对于理解神经活动和疾病机制具有重要意义。

神经细胞培养实验通过将神经细胞置于适当的培养基中，提供所需的细胞外环境，并模拟神经系统的发育过程，使神经细胞得以存活和发育。

本实验旨在通过对小鼠皮层神经细胞的培养，观察其生长情况、突触结构的发育以及可能出现的变化。

2. 材料与方法2.1 神经细胞培养基的制备2.2 小鼠皮层神经细胞的分离和培养2.3 细胞形态观察2.4 突触结构分析2.5 细胞存活率检测3. 结果3.1 神经细胞的形态特征在培养基中，小鼠皮层神经细胞开始以单个细胞的形式附着在培养皿上。

随着时间的推移，细胞逐渐扩张、分化，并形成网状结构。

细胞体呈现圆形或椭圆形，胞质丰富，胞核明显可见。

3.2 生长情况观察经过一段时间的培养，小鼠皮层神经细胞开始迅速生长，并在培养皿上形成较为密集的细胞层。

细胞的生长速度和密度与培养基的成分以及培养条件有关。

3.3 突触结构的发育利用免疫荧光染色技术，我们观察到培养的小鼠皮层神经细胞在突触结构上发生了显著的变化。

初始阶段，突触相关蛋白的表达较低，突触结构不完整。

随着培养的延长，突触形成和突触相关蛋白的表达逐渐增加，形成典型的突触结构。

3.4 细胞存活率检测通过荧光染料染色和显微镜观察，我们评估了小鼠皮层神经细胞的存活率。

结果显示，细胞存活率在培养的早期阶段较低，但随着培养时间的增加，细胞存活率逐渐提高，稳定在一个较高的水平。

4. 讨论本实验成功地进行了小鼠皮层神经细胞培养，观察到了神经细胞的形态特征、生长情况和突触结构的发育过程。

小鼠大脑皮层神经元原代培养步骤:1、于无菌条件下切取鼠头并以75%酒精浸泡1min，解剖出完整鼠脑；2、预冷解剖液中分离去除软膜、血管、取大脑皮质漂洗，用眼科剪将皮质反复剪切成碎块；3、移入培养皿中，吸除解剖液加入0.25%胰蛋白酶2m1，37℃培养箱中消化30min；4、将皮层组织碎块移入离心管，弃去剩余消化液，用接种液洗3次，每次洗涤后使组织块充分沉降到试管底，弃去上清液；5、最后再用接种液1ml混悬，反复吹打（巴氏吸管）混悬液中组织块，力度适中，至浑浊后将上清液移入培养瓶待用；6、加入1ml接种液后再次吹打，如此反复3-4次，组织块逐渐消化后，弃去最终残块；7、收集含单细胞悬液的上清液约4-5ml于培养瓶中，以接种液重新悬浮细胞，细胞记数；接种1x107个细胞于6孔培养板中；8、培养24h至细胞贴壁后，换全培养液（DMEM/F12+2%B27）培养3d，观察神经元生长状况；9、换用阿糖胞苷培养液(终浓度2.5ug/ml，换半液)培养3d以抑制神经胶质细胞及杂细胞生长，获得单纯培养的原代神经细胞；10、每隔3d换全培养液1次，每次换半液。

神经元免疫化学鉴定:1、4%多聚甲醛固定细胞30min，PBS洗涤3次；2、加入无水甲醇:30%双氧水（5:1）处理30min，PBS洗涤3次；3、加入5%羊血清封闭20min，弃去多余液体；4、加入Rabbit Anti-NSE（1:100）（神经元特异性烯醇化酶），培养箱中孵育2-4h，PBS洗涤3次；5、加入Cy3-羊抗兔IgG（1:50）和20µl抗荧光衰减封片剂，室温放置1h；6、加入DAPI染液（1:40），室温放置5-10min；PBS洗涤3次。

7、荧光显微镜观察；。

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小鼠星形胶质细胞原代培养及分离纯化实验方案小鼠星形胶质细胞（astrocytes）是中枢神经系统中一种重要的胶质细胞，主要起支持和维护神经元生存、供能以及调节神经元活动等功能。

原代培养和分离纯化小鼠星形胶质细胞是研究其生物学特性和相关疾病发生机制的重要实验方法。

以下是一种常用的小鼠星形胶质细胞原代培养及分离纯化实验方案。

实验材料和仪器：1.小鼠（新生仔小鼠）2.离心管、培养皿、显微镜3.无菌生理盐水、套管、吸头4. DMEM/F12培养基、FBS、胰蛋白酶、DNase I5.离心机、试管摇床、显微镜、离心管架6.显微针、细胞计数板、加热振荡器实验步骤：1.小鼠的准备：a.使用新生仔小鼠，从母鼠的子宫中取出。

b.将小鼠头部朝下放在无菌生理盐水中，用套管轻轻吸出小鼠颅内的脑组织。

c.将脑组织转移到含有DMEM/F12培养基的离心管中，并用离心管摇床低速振荡15-20分钟使细胞均匀分散。

2.细胞分离：a.将离心管架放在显微镜下，用显微针将脑组织均匀挫碎。

b.将脑组织转移到含有DMEM/F12培养基的培养皿中。

c. 添加0.25%胰蛋白酶和10 U/ml DNase I，37°C孵育30分钟。

d.轻轻吸入含有酶切的脑组织，并用吸头轻轻洗涤脑组织，收集上清液。

e.将上清液通过0.22μm的滤网过滤，除去大颗粒的细胞。

3.细胞培养：a. 将滤过后的细胞悬液计数，计算细胞密度并将其稀释至10^6细胞/ml。

b.取DMEM/F12培养基，添加10%FBS，将稀释后的细胞悬液转移到培养皿中。

c.在培养皿中加入5%CO2，37°C孵育。

d.每两天更换一次培养基，直到细胞至80%～90%的密度。

4.纯化小鼠星形胶质细胞：a.将培养皿中的细胞收集到离心管中，进行离心。

b.用无菌生理盐水洗涤细胞，去除不附着的细胞和残留的培养基。

c.将洗涤后的细胞用DMEM/F12培养基重新悬浮，计数并计算细胞密度。

d.用磁层细胞分选仪，通过细胞表面标记的抗体对细胞进行阳性选择，分离纯化小鼠星形胶质细胞。

小鼠细胞原代培养取材方法
小鼠细胞原代培养取材的方法如下：
1. 准备工具和试剂：显微镜、组织培养耗材（培养皿、离心管、无菌吸管等）、组织培养基、酶消化液（如胰蛋白酶）、PBS缓冲液、抗生素/抗菌剂。

2. 选择适当的组织：根据需要培养的小鼠细胞类型，选择相应的组织。

常用的组织包括肝脏、肺、脾脏、肌肉等。

3. 术前准备：将工作台面清洗消毒，准备好所需的培养皿和离心管，并在显微镜下准备好所需的组织。

4. 组织分离：将小鼠人工麻醉后，用无菌PBS缓冲液冲洗外部组织，然后取出所需的组织。

将组织切成小块，放入含有适当酶消化液的离心管中，进行酶消化。

消化时间和温度根据具体实验要求来确定。

5. 组织纯化：将酶消化后的混合细胞悬液通过滤网过滤，去除组织碎片和大颗粒。

然后将悬液离心，收集沉淀细胞。

细胞沉淀可以通过悬液离心的速度和时间的调整来控制纯化程度。

6. 细胞计数：用显微镜和细胞计数板对细胞进行计数，以确定需要的细胞数量。

7. 细胞培养：将收集到的细胞沉淀转移到含有适当培养基的培养皿中。

根据细胞类型的不同，培养条件和培养基的配方也会有所区别。

一般来说，细胞培养条件包括适当的培养基、温度、CO2浓度和湿度。

8. 细胞培养维护：定期更换培养基，观察细胞的生长情况，及时处理培养皿中的细菌或真菌污染，并进行细胞的传代培养。

以上是小鼠细胞原代培养取材的基本方法，具体操作中还需要根据实验需求和细胞类型的特点进行相应调整。

原代细胞的培养原代细胞的培养不知道遭到多少研究生及博士生吐槽，其真实情况是，一边在超净工作台上哭，一边手上还在不停地提取原代细胞。

相比较细胞系细胞而言，原代细胞的培养周期长、成本高、摸索困难。

从大鼠的筛选分笼到母鼠受精怀孕，从孕育周期的看护到胎鼠的出生降临，从胎鼠脑组织的提取到神经细胞的培养，到最后的药物对原代细胞的作用机制研究。

这种复杂和辛苦的原代培养过程，其实也是最能反应药物在实验小白鼠上作用机制和效果最真实的反应。

1、大鼠的筛选和分笼首先是一个大笼子里放6只大鼠（5雌性，1雄性），每隔两天喂水和繁殖饲料，一星期给大鼠换一次垫料（给大鼠换垫料是体力活）。

舒适的空间和环境能让大鼠更好地繁殖，产下更多的胎鼠用于科学研究。

2、原代细胞的提取及培养原代细胞的提取一般是将胎鼠先用纯净水冲洗干净，在放进超净工作台处理。

先将胎鼠放入75%酒精消毒1min,再用手术剪刀将胎鼠的脑组织提取出来，放入遇冷的D-Hank's液中。

用手术剪刀将皮层的脑组织剪碎，加入等体积的0.25%胰酶进行消化，置于二氧化碳培养箱37℃培养。

（1）新生大鼠原代海马组织中神经干细胞的培养取新生24h内新生大鼠，75%乙醇浸泡消毒5min，用剪刀将头颅取下，剥离颅骨，暴露皮质下海马组织，于冰上快速取出组织放在遇冷的DMEM/F12或者PBS缓冲液中清洗，吸出置于15mLEP中，加入ACCUTASE1.5-2.0mL置于培养箱中，37℃、5%CO2混匀消化10min，取出混匀吹打组织块，1000r.5min-1离心，加入培养基重悬细胞过200目细胞筛（70μm），置于37℃、5%CO2培养箱中悬浮培养。

通过Nestin染色鉴定星形胶质细胞以确保纯度。

（2）大脑皮层原代星形胶质细胞培养细胞制备和培养从1 日龄新生Sprague-Dawley 大鼠的大脑皮层制备原代星形胶质细胞。

简而言之，分离大脑皮质并用0.25% 胰蛋白酶在37°C下消化15 分钟，然后通过70 μm 细胞过滤器过滤。

皮层神经元的原代培养
一、背景
大脑皮层是调节躯体运动的高级中枢。

它由初级感觉区、初级运动区和联合区三部分构成。

人类大脑皮层的神经细胞约有140亿个，面积约2200平方厘米，主要含有锥体形细胞、梭形细胞和星形细胞（颗粒细胞）及神经纤维。

体外原代培养神经元作为神经科学研究的有力手段，越来越受到广大科研工作者的重视。

由于神经元是一种高度分化的细胞，动物出生后很少分裂，相对于其它细胞而言，神经元在体外更难以存活和生长。

因此，体外培养神经元要求的培养方法和营养条件均较为特殊。

二、实验步骤
1. 无菌条件下，从怀孕18天的SD 大鼠腹中取出胚胎放入预冷的无钙、镁平衡盐溶液中；
2.在解剖显微镜下，分离取出胚胎大脑皮层，除去脑膜，剪碎组织（1mm3），加入0.125%胰酶-EDTA 消化液后放入 37℃孵箱内消化10 分钟，期间摇晃一次；
3.去掉上清，加入终止液终止消化，吹打10-15次，不能有气泡，收集上清；剩余沉淀加入终止液继续吹打5-10次;
4.所收集的上清过滤后，将细胞悬液于4℃1000rpm离心10min ，弃上清，管内加入新鲜培养液重悬；
5.台盼蓝染色计数，以 3 x 104cells/孔种入包被的24孔板，37℃，5%CO2，95%饱和湿度的培养箱中培养；
6.每周换液两次，每次半量换液。