第十八章平面色谱法(五版)
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第十八章 色谱分析法通论
第十八章色谱分析法通论液相色谱法第十九章色谱法通论§1 概述色谱法是一种重要的分离分析技术。
近年来，由于色谱分析技术的飞速发展。
色谱学已形成一门专门的资料，已成为多组分混合物分离分析的最重要的分析方法之一。
一、色谱法（层析法）定义：利用各组分理化学性质的不同，在流动相流经固定相时，由于各组分在两相间的吸附、分配或其它亲和力的差异而产生不同速度的移动，最终达到分离的目的。
分离基础：差速迁移特点：效率高、灵敏度高，能把性质相近的物质彼此分开，适合于干扰组分存在的混合物的分离分析。
二、分类（一）以两相所处的状态分类：流动相固定相类型液固l-s色谱液相色谱液液l-l色谱气固g-s色谱气相色谱气液g-l色谱（二）按分离机理分类：1、吸附色谱：利用吸附剂表面对不同组分吸附力不同而分离。
(l-s色谱、g-s色谱)固定相为固体的色谱。
2、分配色谱：（l-l、g-l）利用各组分在两相间分配系数不同进行分离。
3、离子交换：4、分子排阻色谱：利用某些凝胶对不同组分因分子大小利用不同组分对离子交换剂亲和力不同分离。
不同而阻止作用不同，进行分离。
（三）按操作类型分类：柱色谱：气相、高效、超临界流体、经典柱等等。
平面色谱：薄层、纸色谱（载体水）逆流分配：属液相色谱、目前已很少使用一、色谱过程：物质分子在相对运动的两相间，分配“平衡”的过程。
前边已讲，其分离机制产差速迁移。
例P222-223 顺反偶氮苯在柱中吸附解吸附，再吸……柱中填氧化铝，将正、反体溶解加入柱用流动相冲洗，经吸附，解吸附……其流出曲线：二、分配系数与保留行为的关系：1、分配系数：柱中分配平衡后，组分在固定相与流动相中的浓度之比。
K=Cs/Cm S——固定相m——流动相*K与T有关对于不同的分离机理，K的含意不同。
吸附色谱称吸附系数分配色谱称分配系数离子交换色谱称离子交换系数统称K分子排阻色谱称分子排阻系数2、保留时间：从进样到某组分色谱峰峰顶的时间间隔，为该组分的保留时间（t R）。
18 平面色谱法
练 习
1. 已知某混合试样a、b、c三组分的K分别为400、 450、500，则a、b、c在薄层上的Rf值的大小顺序 为：
A Rf(a)> Rf(b)> Rf(c)
C Rf(b)> Rf(a)> Rf(c)
B Rf(c)> Rf(b)> Rf(a)
D Rf(a)> Rf(c)> Rf(b)
练 习
第十八章 经典液相色谱法
内容回顾
色谱分离原理： 利用物质在固定相与流动相之间的 分配系数差异而实现分离。
Cs ms K k Cm mm Vs kK Vm t` k R
t0
概述
经典柱色谱法 经典 液相 色谱 平面色谱法 现代柱色谱法
薄层色谱法 (TLC) Thin layer Chromatography 纸色谱法 Paper Chromatography
经典柱色谱法
18.2 液－固吸附柱色谱法
18.2.1 分离原理
固定相：固体吸附剂 吸附剂一般是多孔性微粒状物质，具有较大的
比表面积，表面有许多吸附中心。
吸附是溶质在吸附剂表面的集中浓缩现象。
吸附色谱法的分离原理（P449）
吸附剂一般是多孔性微粒状物质，具有较大的比表 面积，表面有许多吸附中心。 吸附与竞争
三、平面色谱操作方法
制板 点样
定性分析
展开
显色 分析
定时展开
定位 定性分析、定量分析
洗脱法 直接定量法
六、薄层扫描法（p472）－定量方法
尿中雌三醇含量的测定
取尿液5mL，加3.0g硫酸 铵，离心后取沉淀，然 后在pH9.5条件下用乙醚 萃取；在碱性条件下， 萃取液的雌三醇与丹酰 氯作用，生成丹酰雌三 醇。用薄层展开荧光扫
平面色谱法
2014~2015学年
3.扫描方式 直线扫描和曲折扫描。 （二）定量分析法 常用外标一点法。
m样 A样 m标 A标
2014~2015学年
第三节 纸色谱法简介
以纸做载体进行的液-液分配色谱法
固定相：纸纤维吸附的水 流动相：与水不互溶的有机溶剂（饱和正丁醇） 分离机制：同液-液分配色谱 定性参数：
L 1 Rf L0 1 K VS Vm
讨论：Rf与组分性质、流动相及溶解度有关 极性组分→易保留，Rf 小（流动相极性↑， Rf ↑） 非极性组分→易流出，Rf大（流动相极性↑，Rf ↓）
2014~2015学年
（二） 相对比移值Rr
相对比移值：是在一定条件下，被测组分的比移值与参 考物质的比移值之比。
原点到组分斑点中心的距离 L1 Rr R f（参） 原点到参考物斑点中心的距离 L2
讨论
•
R f（组）
参考物与被测组分在完全相同条件下展开，可以消除系统 误差，大大提高重现性和可靠性. 参考物可以是后加入的纯物质，也可是样品中已知组分。 相对比移值Rr与组分、参考物性质及色谱条件有关，范围 可以大于或小于1.
吸附剂裝于柱中。都是经典液相色谱法的一种。
2014~2015学年
（四）薄层色谱操作方法
操作步骤:制板、点样、展开、斑点定位 1.制板 ⑴薄层板的选择：表面光滑、平整、洁净、厚度均匀
⑵薄层板的涂布： 软板（不加粘合剂)：干,湿法铺 硬板（加粘合剂）：湿法铺板(匀浆） 要求：涂布均匀 ，厚度0.25mm ~ 0.5mm 常用硅胶： 硅胶G——自含粘和剂 硅胶H——不含粘和剂，铺板时另加入CMC-Na 硅胶G254——含荧光剂，254nm紫外光照发绿光 硅胶HF356——含荧光剂，356nm紫外光照发光
3.扫描方式 直线扫描和曲折扫描。 （二）定量分析法 常用外标一点法。
m样 A样 m标 A标
2014~2015学年
第三节 纸色谱法简介
以纸做载体进行的液-液分配色谱法
固定相：纸纤维吸附的水 流动相：与水不互溶的有机溶剂（饱和正丁醇） 分离机制：同液-液分配色谱 定性参数：
L 1 Rf L0 1 K VS Vm
讨论：Rf与组分性质、流动相及溶解度有关 极性组分→易保留，Rf 小（流动相极性↑， Rf ↑） 非极性组分→易流出，Rf大（流动相极性↑，Rf ↓）
2014~2015学年
（二） 相对比移值Rr
相对比移值：是在一定条件下，被测组分的比移值与参 考物质的比移值之比。
原点到组分斑点中心的距离 L1 Rr R f（参） 原点到参考物斑点中心的距离 L2
讨论
•
R f（组）
参考物与被测组分在完全相同条件下展开，可以消除系统 误差，大大提高重现性和可靠性. 参考物可以是后加入的纯物质，也可是样品中已知组分。 相对比移值Rr与组分、参考物性质及色谱条件有关，范围 可以大于或小于1.
吸附剂裝于柱中。都是经典液相色谱法的一种。
2014~2015学年
（四）薄层色谱操作方法
操作步骤:制板、点样、展开、斑点定位 1.制板 ⑴薄层板的选择：表面光滑、平整、洁净、厚度均匀
⑵薄层板的涂布： 软板（不加粘合剂)：干,湿法铺 硬板（加粘合剂）：湿法铺板(匀浆） 要求：涂布均匀 ，厚度0.25mm ~ 0.5mm 常用硅胶： 硅胶G——自含粘和剂 硅胶H——不含粘和剂，铺板时另加入CMC-Na 硅胶G254——含荧光剂，254nm紫外光照发绿光 硅胶HF356——含荧光剂，356nm紫外光照发光
第十八章 平面色谱法-分析化学
d
28
5、显色
xe 仪 器 分 析
第 十 八 章 经 典 液 相 色 谱 法
日光下观察有色物质的色斑 紫外灯下观察荧光或无荧光色斑 通用显色剂：碘、硫酸、荧光黄
专用显色剂：茚三酮、三氯化铁
显色方法：直接喷雾法、浸渍法
d
29
四、定性与定量分析方法
xe 仪 器 分 析
第 十 八 章 经 典 液 相 色 谱 法
一般在105℃～110℃加热30分钟。但加热 温度不可太高，否则易使硅胶失活：
O H + Si O H Si O 5000C Si Si + H2O
d
硅胶具有微酸性，适用于分离酸性和中 性物质，如有机酸、氨基酸、甾体等
18
2、氧化铝
xe 仪 器 分 析
第 十 八 章 经 典 液 相 色 谱 法
目视法：直接比较样品斑点与对照 品斑点的颜色深度或面积大小； 薄层扫描法
d
32
五、高效薄层色谱法(HPTLC)
xe 仪 器 分 析
第 十 八 章 经 典 液 相 色 谱 法
1、高效薄层板
由较小颗粒的吸附剂(或其他固定相) 用喷雾法制备而成的均匀薄层。
2、点样 要求：原点直径小；铂-铱合金点 样毛细管、专用点样器
第 十 八 章 经 典 液 相 色 谱 法
被分离物质的结构和性质 薄层板的性质，固定相的粒度， 薄层的厚度，吸附剂的活度 温度（主要对分配层析）
d
展开室内的展开剂蒸气饱和程度
7
3、分离参数
xe 仪 器 分 析
第 十 八 章 经 典 液 相 色 谱 法
分离度
2d R W1 W2 R
d
12
平面色谱法
Rr = Rf(a) / Rf(s) = La / Ls
薄层色谱R 薄层色谱 r值的示意图
参考物质可以是加入试样的纯物质，也 可以是试样中的某一已知组分。 Rr的优点： 1）可以消除系统误差，重现性和可比 性都比Rf好。 2） Rr可以大于1，也可以小于1。
(二)相平衡参数 分配系数K 和容量因子k。 1. K、k与Rf值的关系 v ' 因为 R=
薄层色谱法： 1938年 产生 20世纪60年代 发展和普及 20世纪80年代 仪器化薄层色谱法 (instrumental thin layer chromatography))
第一节
平面色谱法的分类和原理
• 平面色谱法的分类 • 平面色谱法参数
一、平面色谱法的分类 按操作方式分为薄层色谱法、纸色谱法、 薄层电泳法。 1.薄层色谱法 定义：把固定相均匀地铺在玻璃板、铝 箔或塑料板上形成薄层，在此薄层上进 行色谱分离，称薄层色谱法。 分离原理：随所用的固定相不同而异， 与柱色谱相同。
2.相对比移值(relative Rf ,Rr) 定义：组分与参考物质在同一条件下 的Rf值(或移行距离)之比。 计算公式 Rf = Rf(i) / Rf(s) = L(i) / L(s) 其中 Rf(i)：组分i的Rf值。 同一条件 下测得。 Rf(s)：参考物质的Rf值。
前沿 S A l0 la 原点 ls
(一)吸附薄层色谱法 定义:固定相为吸附剂的薄层色谱法为 吸附薄层色谱法。 分离原理：将A、B两组分的混合溶液 点在薄层板的一端，在密闭的容器中 用适当的溶剂(展开剂，developing solvent,developer)展开。
A,B两组分 A，B移动
吸附剂 吸附 新的吸附剂 吸附
展开剂溶解 解吸附 展开剂 解吸 薄层板上
平面色谱法习题答案
第十八章 平面色谱法思考题和习题1．名词解释平面色谱法 比移值 相对比移值 分离度 分离数 荧光薄层板 高效薄层色谱 边缘效应2．在吸附薄层色谱中如何选择展开剂？欲使某极性物质在薄层板上移动速度快些，展开剂的极性应如何改变？主要应根据被分离物质极性、展开剂极性以及吸附剂的活度三方面来选择。
被分离物质极性 吸附剂的活度 展开剂极性 大 小 大 小 大 小欲使某极性物质在薄板上移动速度快些，展开剂的极性应增大。
3．薄板有哪些类型？硅胶-CMC 板和硅胶-G 板有什么区别？见教材P381页4．薄层色谱的显色方法有哪些？①在日光下观察，划出有色物质的斑点位置。
②在紫外灯（254 nm 或365 nm ）下观察有无暗斑或荧光斑点，并记录其颜色、位置及强弱。
能发荧光的物质或少数有紫外吸收的物质可用此法检出。
③荧光薄层板检测。
适用于有紫外吸收物质，荧光薄层板在紫外灯下，整个薄层板呈黄绿色荧光，被测物质由于荧光猝灭作用而呈现暗斑。
④既无色，又无紫外吸收的物质，可采用显色剂显色。
薄层色谱常用的通用型显色剂有碘、硫酸溶液和荧光黄溶液等。
5．在薄层色谱中，以硅胶为固定相，氯仿为流动相时，试样中某些组分R f 值太大，若改为氯仿－甲醇(2:1)时，则试样中各组分的R f 值会变得更大，还是变小？为什么？以硅胶为固定相的应为吸附薄层色谱，氯仿为流动相时，试样中某些组分R f 值太大，若改为氯仿－甲醇(2:1)时，则试样中各组分的R f 值会变得更大，此时应加入适量极性小的溶剂如环已烷，以降低展开剂的极性。
6．在硅胶薄层板A 上，以苯－甲醇(1:3)为展开剂，某物质的R f 值为0.50，在硅胶板B 上，用相同的展开剂，此物质的R f 值降为0.40，问A 、B 两种板，哪一种板的活度大？B 板的活度大。
7．已知A ，B 两物质在某薄层色谱系统中的分配系数分别为100和120。
问哪一个的R f 值小些？ 根据kV K V V R s m m f +=⋅+=11可知，分配系数K 越大， R f 越小，因此分配系数为120的物质R f 小些。
平面色谱法
与待分离 组分无作 用？
纸色谱是以滤纸为载体的液-液分配色谱。滤纸由纤维素 制成，其分子中具有很多羟基，有较强的亲水性，能吸收 20~25%的水分，其中6%左右的水分通过氢键与纤维素上 的羟基相结合形成的固定相。 正相色谱
若要分离非极性物质可用适当的低级性液体如石蜡油、硅
油等处理滤纸。反相色谱
流动相（展开剂）：与水不相溶（或部分相溶）的溶剂
薄层材料（3）
载板
具有一定机械强度、化学惰性、耐一定温度、表面平整、厚度
均匀、价格便宜
玻板：5cm10cm、10cm20cm、20cm20cm
光滑、平整、洗净后不附水珠、干燥
薄层材料（4）
粘结剂
加强固定相颗粒的附着力，增加薄层板润湿性，改善色谱分离
无机粘结剂：煅石膏
硅胶G：含1315%煅石膏
制备硅胶G：含30%煅石膏 氧化铝G：含9%煅石膏 硅胶H：不含粘结剂
有机粘结剂：羧甲基纤维素钠（CMC）
0.8%CMC溶液配均浆涂铺的薄层板强度高，色谱分离性能好
注意：不适合浓硫酸显色、易霉变降解
薄层材料（5）
荧光指示剂
适当波长激发光照射下可产生均匀的荧光背景，清晰显示化合物暗斑
用量：1.52.0%
滤纸或薄层板的处理
样品制备 色谱前衍生化
点样
滤纸或薄层板预平衡
展开 定位
定性 定量
3-1 概述（6）
薄层色谱法的基本材料及设备
滤纸及薄层板（自制或市售） 涂布器 点样器（定性：普通毛细管；定量：微量注射器或微量定量毛细管） 展开室 显色器
薄层扫描仪
3-2 薄层色谱系统
薄层材料
平面色谱法（TLC）
3-1 概述 3-2 薄层色谱系统
第十八章平面色谱法五版
• 纸质的松紧适宜。
• 纸质纯，无明显的荧光斑点。
39
2. 点样方法： 同薄层色谱法 3. 展开剂：水饱和的正丁醇、正戊醇、
酚等。
40
5. 定位方法：同薄层。 但不能用硫酸
6. 定性方法：同薄层。 7. 定量方法：同薄层。
41
17
（三）展开
展开剂：由一种或多种 溶剂按一定比例组成。
•上行法：用于硬板 •多次展开：用于硬板 •径向展开：纸色谱 •下行法：纸色谱
18
注意：
•点样线不能浸入展开剂中； •展开时要恒温、恒湿度； •展开槽和薄板须用展开剂蒸气饱和后再展开。
目的：消除边缘效应
19
边缘效应： 同一物质在同一薄层板上出现中间部分的Rf值比
（一）定性分析方法 定性分析的依据： 在固定的色谱条件下， 相同物质的Rf值 相同。
23
已知物对照法:样品与已知物对照品在同一薄
层上展开，比较组分与对照品的Rf值。
24
（二）定量分析
1. 洗脱测定法： 斑点定位斑点取下洗脱适当方法测定。
2. 直接测定法： •目视比较法: 比较样品斑点与对照品斑点的 颜色深度或面积大小 •薄层扫描法: 测量斑点的面积大小。
29
• 测光方式 a. 透射法： 只适用于透明薄板。 b. 反射法：
30
31
外标两点法：
m样 = a + b A样
b = (m1 - m2) / (A1- A2) a = m1 - b A1
32
七、薄层色谱法的应用
• 合成药物反应速度或反应完成程度的监控； • 药物的杂质检查； • 天然药物有效成分的分离、鉴定、含量测定； • 少量物质的制备、提纯等。
被分离物质的极性 小 大
平面色谱法
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二、吸附剂与展开剂
(一）吸附剂 1. 硅胶：硅胶H、硅胶G、硅胶F254 2. 氧化铝：可分为中性（pH7.5)、碱性（pH9.0）和酸性
（pH4.0）
（二）展开剂 常用的有： 石油醚<环己烷<二硫化碳<四氯化碳<三氯乙烷<苯<甲苯<二氯 甲烷<乙醚<氯仿<乙酸乙酯<正丁醇<丙酮<乙醇<甲醇<吡啶< 酸<水
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吸附剂与展开剂的选择
▪ 吸附剂的选择：根据被测物极性和吸附剂的吸附能力 被测物极性强——弱极性吸附剂 被测物极性弱——强极性吸附剂
▪ 展开剂的选择：根据被测组分、吸附剂和展开剂本身的极性
上一内容 下一内容 图1回8－主3目录
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三、操作方法
（一）薄层板的制备 定性分析——窄条 定量分析——10×20cm 硅胶G——自含粘和剂 硅胶H——不含粘和剂，铺板时另加入CMC 硅胶FH254——含荧光剂，254nm紫外光照发绿光 硅胶FH365——含荧光剂，365nm紫外光照发光
⑵薄层板一定，Rf只与组分性质有关，对于极性组分，
展开剂极性↑大，Rf↑大（容易洗脱）
展开剂极性↓小，Rf↓小 （不容易洗脱）
⑶Rf＝1 K或k=0 组分在前沿
Rf＝0 K或k=∞
组分在原点
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（三）面效参数
• 1、理论塔板数 n=16(L/W)2 L:原点到斑点中心的距离 W：组分斑点的纵向宽度
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第三节 薄层色谱法
• 一、主要类型 • 二、吸附剂与展开剂 • 三、操作方法 • 四、定性与定量分析 • 五、高效薄层色谱法 • 六、薄层扫描法 • 七、应用实例
平面色谱法全解课件
土壤污染物检测案例展示
1 2
案例一
某农田土壤中农药残留的分离与测定
采样方法
使用不锈钢钻头采集农田土壤
分离方法
3
硅胶柱色谱分离
土壤污染物检测案例展示
01
测定方法
GC-MS检测
02
结果
成功分离和测定了农田土壤中的农药残留，包括有机氯农药、有机磷农
药等
03
案例二
某工业区土壤中重金属的分离与测定
土壤污染物检测案例展示
点样、展开与显色
点样
用毛细管或点样器将样品开剂进行展开，使各组分分离 。
显色
对于需要显色的组分，可以采用显 色剂进行显色，以便观察和测量。
03
平面色谱法分离原理与影响
因素
分离原理介绍
平面色谱法是一种基于不同物质在固 定相和流动相之间分配平衡的差异， 实现物质分离的物理化学方法。
药物杂质检查案例展示
案例一
采用薄层色谱法对某中成药中的有关 物质进行检查。通过制备薄层板、点 样、展开、显色等步骤，对有关物质 进行定性鉴别和限量检查，从而对该 中成药的质量进行控制。
案例二
采用高效液相色谱法对某化学药中的 有关物质进行检查。通过色谱柱分离 、检测器检测等步骤，对有关物质进 行定性鉴别和限量检查，从而对该化 学药的质量进行控制。
原理
基于不同物质在固定相和流动相 之间的分配平衡，在流动相推动 下，不同物质在固定相上的移动 速度不同，从而实现分离。
发展历程与现状
发展历程
平面色谱法自20世纪初诞生以来， 经历了近百年的发展，逐渐成为一种 成熟的分离技术。
现状
目前，平面色谱法在多个领域得到广 泛应用，如医药、食品、环保等。随 着科技的不断进步，平面色谱法也在 不断创新和完善。
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羧甲基纤维素钠（CMC- Na）
(2) 硬板的铺制方法：
薄层板是用专门的涂布器把浆状的吸附剂（硅胶 或氧化铝，200～250目）均匀地涂在长条形玻璃板上 （厚度0.15～0.5mm）。干燥后即可使用。
第十八章平面色谱法(五版）
15
4. 活化:
硅胶板先晾干，再在 105 ～ 110C 活化 0.5～1 小时。
层上展开，比较组分与对照品的Rf值。
第十八章平面色谱法(五版）
25
（二）定量分析
1. 洗脱测定法： 斑点定位斑点取下洗脱适当方法测定。
2. 直接测定法： •目视比较法: 比较样品斑点与对照品斑点的 颜色深度或面积大小 •薄层扫描法: 测量斑点的面积大小。
第十八章平面色谱法(五版）
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六.薄层扫描法简介
以一定波长的光照射展开后的薄层色 谱板，侧定其对光的吸受或所发出的 荧光，进行定量分析的方法。
第十八章平面色谱法(五版）
27
双 波 长 薄 层 扫 描 仪 光 路 示 意 图
第十八章平面色谱法(五版）
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波长的选则： 测定波长：斑点中化合物的 max 参比波长：斑点中化合物无吸收的波长
目的：消除背景吸收
冷却即可使用．也可保存于干燥器中备用。
第十八章平面色谱法(五版）
16
（二）点样
1. 样品溶液的制备：
应尽量避免用水作溶剂， 一般用甲醇、乙醇、丙酮、氯仿等挥发性有机溶剂 溶解样品。
2. 点样：用微量注射器或玻璃毛细管吸取一定量试样
点在原点上。试样点的直径一般应小于4mm。可并 排点多个试样同时展开。
第十八章平面色谱法(五版）
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注意：➢ 点样线距底边1.5 ～2cm处。 ➢ 斑点面积越小越好。
第十八章平面色谱法(五版）
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（三）展开
展开剂：由一种或多种 溶剂按一定比例组成。
•上行法：用于硬板 •多次展开：用于硬板
•径向展开：纸色谱
•下行法：纸色谱
第十八章平面色谱法(五版）
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注意：
•点样线不能浸入展开剂中； •展开时要恒温、恒湿度； •展开槽和薄板须用展开剂蒸气饱和后再展开。
目的：消除边缘效应
第十八章平面色谱法(五版）
20
边缘效应：
同一物质在同一薄层板上出现中间部分的Rf值比 边缘的Rf值小。
第十八章平面色谱法(五版）
21
（四）定位方法
1. 显色法：喷洒显色剂进行显色反应使组分显 色而定位。 • 通用型显色剂：碘 硫酸溶液 荧光黄 •专用显色剂： 茚三酮 氨基酸 酸碱指示剂 羧酸
第十八章 平面色谱法
第十八章平面色谱法(五版）
1
第一节 平面色谱法的分类和原理
一、平面色谱法的分类 1. 薄层色谱法： 2. 纸色谱法
第十八章平面色谱法(五版）
2
二、平面色谱法参数
定性参数：
1. 比移值（Rf）：
原点到斑点中心的距离 Rf = ———————————
原点到溶剂前沿的距离
l0 l
l = ——
第十八章平面色谱法(五版）
33
七、薄层色谱法的应用
• 合成药物反应速度或反应完成程度的监控； • 药物的杂质检查； • 天然药物有效成分的分离、鉴定、含量测定； • 少量物质的制备、提纯等。
第十八章平面色谱法(五版）
29
图19-2 薄层色谱扫描曲线
第十八章平面色谱法(五版）
30
• 测光方式 a. 透射法： 只适用于透明薄板。 b. 反射法：
第十八章平面色谱法(五版）
31
第十八章平面色谱法(五版）
32
外标两点法：
m样 = a + b A样
b = (m1 - m2) / (A1- A2) a = m1 - b A1
l0
第十八章平面色谱法(五版）
3
讨论：
1）K↑大，Rf↓小 2）薄层板一定，对于极性组分
展开剂极性↑大，Rf↑大（容易洗脱） 展开剂极性↓小，Rf↓小 （不容易洗脱） 3）Rf范围：0< Rf <1 （组分迁移速度和距离小于展开剂迁移速度和距离） Rf = 0.2——0.8（常用） 0.3——0.5（最佳）
第十八章平面色谱法(五版）
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2. 荧光法： 吸附剂中混有荧光剂，展开后，在紫
外灯下，色斑在荧光背景上呈现暗斑。
第十八章平面色谱法(五版）
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四. 定性与定量分析
（一）定性分析方法 定性分析的依据： 在固定的色谱条件下， 相同物质的Rf值 相同。
第十八章平面色谱法(五版）
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已知物对照法:样品与已知物对照品在同一薄
第十八章平面色谱法(五版）
4
2. 相对比移值（Rr）： 原点到样品斑点中心的距离
Rr = ——————————————— 原点到参考物质斑点中心的距离
目的：消除系统误差
第十八章平面色谱法(五版）
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第二节 薄层色谱法
—、分类和原理
分类 吸附薄层色谱 分配薄层色谱 胶束薄层色谱
原理 吸附系数的差异分配系数的差异分配系数的差异
固定相 吸附剂
液体
聚酰胺
流动相 有机溶剂 正相：有机溶剂含表面活性剂
反相：甲醇-水
第十八章平面色谱法(五版）
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二、吸附薄层色谱法
(一)吸附剂
1.硅胶：-SiOH
特点：(1) 吸附力与含水量有关。含水量高吸 附力下降。
(2) 微酸性 (3) 分离酸性或中性物质，如有机酸、氨
基酸、甾体
第十八章平面色谱法(五版）
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三、薄层色谱法操作方法 动画
（一)薄层板的制备
吸附剂涂铺均匀 薄层板要求: 表面光滑
厚度一致
第十八章平面色谱法(五版）
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1. 载板的准备： 要求：表面光滑、平整清洁。
2. 软板的制备： 直接将吸附剂置于玻板上并使成为一均匀薄层。
第十八章平面色谱法(五版）
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3.粘合薄层板（硬板）的铺制 (1) 粘合剂：煅石膏
硅胶含水量% 活性级 氧化铝含水量
0
Ⅰ （最强）
%0
5
Ⅱ
3
15
Ⅲ
6
25
Ⅳ
10
38
Ⅴ （最弱）
15
第十八章平面色谱法(五版）
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（二）展开剂 展开剂选择的一般原则: 相似相溶
第十八被分离物质的极性 小 大
吸附剂吸附性能 强 弱
展开剂极性 小 大
第十八章平面色谱法(五版）
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种类：
硅胶H：不含粘合剂，制板时需另加粘含剂。 硅胶G：硅胶和煅石膏混合而成。 硅胶HF254：不含粘结剂含剂,而含萤光剂，在 254
nm紫外光下呈强烈黄绿色荧光背景。
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2.氧化铝： 氧化铝G、氧化铝H、氧化铝HF254等
第十八章平面色谱法(五版）
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表19-1 硅胶和氧化铝的含水量与活性关系
(2) 硬板的铺制方法：
薄层板是用专门的涂布器把浆状的吸附剂（硅胶 或氧化铝，200～250目）均匀地涂在长条形玻璃板上 （厚度0.15～0.5mm）。干燥后即可使用。
第十八章平面色谱法(五版）
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4. 活化:
硅胶板先晾干，再在 105 ～ 110C 活化 0.5～1 小时。
层上展开，比较组分与对照品的Rf值。
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（二）定量分析
1. 洗脱测定法： 斑点定位斑点取下洗脱适当方法测定。
2. 直接测定法： •目视比较法: 比较样品斑点与对照品斑点的 颜色深度或面积大小 •薄层扫描法: 测量斑点的面积大小。
第十八章平面色谱法(五版）
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六.薄层扫描法简介
以一定波长的光照射展开后的薄层色 谱板，侧定其对光的吸受或所发出的 荧光，进行定量分析的方法。
第十八章平面色谱法(五版）
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双 波 长 薄 层 扫 描 仪 光 路 示 意 图
第十八章平面色谱法(五版）
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波长的选则： 测定波长：斑点中化合物的 max 参比波长：斑点中化合物无吸收的波长
目的：消除背景吸收
冷却即可使用．也可保存于干燥器中备用。
第十八章平面色谱法(五版）
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（二）点样
1. 样品溶液的制备：
应尽量避免用水作溶剂， 一般用甲醇、乙醇、丙酮、氯仿等挥发性有机溶剂 溶解样品。
2. 点样：用微量注射器或玻璃毛细管吸取一定量试样
点在原点上。试样点的直径一般应小于4mm。可并 排点多个试样同时展开。
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注意：➢ 点样线距底边1.5 ～2cm处。 ➢ 斑点面积越小越好。
第十八章平面色谱法(五版）
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（三）展开
展开剂：由一种或多种 溶剂按一定比例组成。
•上行法：用于硬板 •多次展开：用于硬板
•径向展开：纸色谱
•下行法：纸色谱
第十八章平面色谱法(五版）
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注意：
•点样线不能浸入展开剂中； •展开时要恒温、恒湿度； •展开槽和薄板须用展开剂蒸气饱和后再展开。
目的：消除边缘效应
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边缘效应：
同一物质在同一薄层板上出现中间部分的Rf值比 边缘的Rf值小。
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（四）定位方法
1. 显色法：喷洒显色剂进行显色反应使组分显 色而定位。 • 通用型显色剂：碘 硫酸溶液 荧光黄 •专用显色剂： 茚三酮 氨基酸 酸碱指示剂 羧酸
第十八章 平面色谱法
第十八章平面色谱法(五版）
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第一节 平面色谱法的分类和原理
一、平面色谱法的分类 1. 薄层色谱法： 2. 纸色谱法
第十八章平面色谱法(五版）
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二、平面色谱法参数
定性参数：
1. 比移值（Rf）：
原点到斑点中心的距离 Rf = ———————————
原点到溶剂前沿的距离
l0 l
l = ——
第十八章平面色谱法(五版）
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七、薄层色谱法的应用
• 合成药物反应速度或反应完成程度的监控； • 药物的杂质检查； • 天然药物有效成分的分离、鉴定、含量测定； • 少量物质的制备、提纯等。
第十八章平面色谱法(五版）
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图19-2 薄层色谱扫描曲线
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• 测光方式 a. 透射法： 只适用于透明薄板。 b. 反射法：
第十八章平面色谱法(五版）
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第十八章平面色谱法(五版）
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外标两点法：
m样 = a + b A样
b = (m1 - m2) / (A1- A2) a = m1 - b A1
l0
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讨论：
1）K↑大，Rf↓小 2）薄层板一定，对于极性组分
展开剂极性↑大，Rf↑大（容易洗脱） 展开剂极性↓小，Rf↓小 （不容易洗脱） 3）Rf范围：0< Rf <1 （组分迁移速度和距离小于展开剂迁移速度和距离） Rf = 0.2——0.8（常用） 0.3——0.5（最佳）
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2. 荧光法： 吸附剂中混有荧光剂，展开后，在紫
外灯下，色斑在荧光背景上呈现暗斑。
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四. 定性与定量分析
（一）定性分析方法 定性分析的依据： 在固定的色谱条件下， 相同物质的Rf值 相同。
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已知物对照法:样品与已知物对照品在同一薄
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2. 相对比移值（Rr）： 原点到样品斑点中心的距离
Rr = ——————————————— 原点到参考物质斑点中心的距离
目的：消除系统误差
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第二节 薄层色谱法
—、分类和原理
分类 吸附薄层色谱 分配薄层色谱 胶束薄层色谱
原理 吸附系数的差异分配系数的差异分配系数的差异
固定相 吸附剂
液体
聚酰胺
流动相 有机溶剂 正相：有机溶剂含表面活性剂
反相：甲醇-水
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二、吸附薄层色谱法
(一)吸附剂
1.硅胶：-SiOH
特点：(1) 吸附力与含水量有关。含水量高吸 附力下降。
(2) 微酸性 (3) 分离酸性或中性物质，如有机酸、氨
基酸、甾体
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三、薄层色谱法操作方法 动画
（一)薄层板的制备
吸附剂涂铺均匀 薄层板要求: 表面光滑
厚度一致
第十八章平面色谱法(五版）
13
1. 载板的准备： 要求：表面光滑、平整清洁。
2. 软板的制备： 直接将吸附剂置于玻板上并使成为一均匀薄层。
第十八章平面色谱法(五版）
14
3.粘合薄层板（硬板）的铺制 (1) 粘合剂：煅石膏
硅胶含水量% 活性级 氧化铝含水量
0
Ⅰ （最强）
%0
5
Ⅱ
3
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Ⅲ
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Ⅳ
10
38
Ⅴ （最弱）
15
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（二）展开剂 展开剂选择的一般原则: 相似相溶
第十八被分离物质的极性 小 大
吸附剂吸附性能 强 弱
展开剂极性 小 大
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种类：
硅胶H：不含粘合剂，制板时需另加粘含剂。 硅胶G：硅胶和煅石膏混合而成。 硅胶HF254：不含粘结剂含剂,而含萤光剂，在 254
nm紫外光下呈强烈黄绿色荧光背景。
第十八章平面色谱法(五版）
8
2.氧化铝： 氧化铝G、氧化铝H、氧化铝HF254等
第十八章平面色谱法(五版）
9
表19-1 硅胶和氧化铝的含水量与活性关系