木糖醇脱氢酶基因高拷贝表达载体构建及在酿酒酵母中的表达

2008, Vol. 29, No. 02食品科学※生物工程210收稿日期：２００７－０１－１５基金项目：黑龙江省科学技术厅青年基金项目（ＱＣＯ４Ｃ３３）；黑龙江省教育厅一般项目（１０５５１２３３）； 黑龙江大学青年基金项目（ＱＬ２００４３５）作者简介：葛菁萍（１９７２－），女，教授，博士，研究方向微生物学。

Ｅ－ｍａｉｌ：ｇｅｊｉｎｇｐｉｎｇ５１２＠ｙａｈｏｏ．ｃｏｍ．ｃｎ＊通讯作者：平文祥（１９５９－），男，教授，学士，研究方向微生物学。

Ｅ－ｍａｉｌ：ｗｅｎｘｉａｎｇｐ＠ｙａｈｏｏ．ｃｏｍ．ｃｎ乙醇脱氢酶Ｉ基因敲除的酿酒酵母重组菌构建的初步研究葛菁萍，宋　刚，孙宗祥，凌宏志，蔡柏岩，刘松梅，平文祥＊（黑龙江大学　微生物黑龙江省高校重点实验室，黑龙江　哈尔滨 １５００８０）摘 要：本实验根据酿酒酵母乙醇代谢途径，构建一株低乙醇产量的酿酒酵母基因工程菌株，以满足人们对低醇啤酒的需要。

利用抗性基因筛选基因敲除突变体的方法，通过引物Ｌ１和Ｌ２扩增潮霉素Ｂ基因（两翼与酿酒酵母同源），按常规醋酸锂法转化酵母细胞后，筛选标记与酵母ａｄｈ　Ｉ基因发生同源重组，得到一株ＡＤＨ　Ｉ酶活性降低的工程菌株。

发酵实验结果表明，转化菌株乙醇含量平均值为１．８％（Ｖ／Ｖ），较原始菌株低了６５％。

说明转化菌株体内乙醇生成途径受到干扰。

关键词：酿酒酵母；基因敲除；乙醇脱氢酶ＩＰｒｅｌｉｍｉｎａｒｙ　Ｓｔｕｄｙ　ｏｎ　Ｄｅｌｅｔｉｏｎ　ｏｆ　Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ　ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ　Ａｌｃｏｈｏｌ　Ｄｅｈｙｄｒｏｇｅｎｉａｓｅ　Ｉ　ＧｅｎｅＧＥ　Ｊｉｎｇ－ｐｉｎｇ，ＳＯＮＧ　Ｇａｎｇ，ＳＵＮ　Ｚｏｎｇ－ｘｉａｎｇ，ＬＩＮＧ　Ｈｏｎｇ－ｚｈｉ，ＣＡＩ　Ｂａｉ－ｙａｎ，ＬＩＵ　Ｓｏｎｇ－ｍｅｉ，ＰＩＮＧ　Ｗｅｎ－ｘｉａｎｇ＊（Ｈｅｉｌｏｎｇｊｉａｎｇ　Ｋｅｙ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ　ｏｆ　Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ，　Ｃｏｌｌｅｇｅ　ｏｆ　Ｌｉｆｅ　Ｓｃｉｅｎｃｅ，　Ｈｅｉｌｏｎｇｊｉａｎｇ　Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ，　Ｈａｒｂｉｎ １５００８０，　Ｃｈｉｎａ）Ａｂｓｔｒａｃｔ　：Ｔｈｅ　ｍａｉｎ　ｐｕｒｐｏｓｅ　ｏｆ　ｔｈｉｓ　ｒｅｓｅａｒｃｈ　ｉｓ　ｔｏ　ｃｏｎｓｔｒｕｃｔ　ａ　ｌｏｗ　ａｌｃｏｈｏｌ　ｐｒｏｄｕｃｉｎｇ　ｓｔｒａｉｎ　ａｃｃｏｒｄｉｎｇ　ｔｏ　ｔｈｅ　ａｌｃｏｈｏｌ　ｍｅｔａｂｏｌｉｃｐａｔｈｗａｙ　ｏｆ　Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ　ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ，　ｓｏ　ａｓ　ｔｏ　ｓａｔｉｓｆｙ　ｔｈｅ　ｐｅｏｐｌｅ　ｗｈｏ　ｐｒｅｆｅｒ　ｔｏ　ｄｒｉｎｋ　ｌｏｗ－ａｌｃｏｈｏｌ　ｂｅｅｒ．　Ｈｙｇｒｏｍｙｃｉｎ　Ｂ　ｒｅｓｉｓｔａｎｔｇｅｎｅ　ｗａｓ　ｕｓｅｄ　ｔｏ　ｓｃｒｅｅｎ　ｍｕｔａｎｔｓ　ｗｉｔｈ　ａｄｈ　Ｉ　ｇｅｎｅ　ｋｎｏｃｋｅｄ　ｏｕｔ．　Ａｆｔｅｒ　Ｈｙｇｒｏｍｙｃｉｎ　Ｂ　ｒｅｓｉｓｔａｎｔ　ｇｅｎｅ　ｗａｓ　ａｍｐｌｉｆｉｅｄ　ｗｉｔｈ　ｐｒｉｍｅｒｓＬ１　ａｎｄ　Ｌ２　（ｔｈｅ　ｆｌａｎｋｉｎｇ　ｆｒａｇｍｅｎｔｓ　ｗｅｒｅ　ｃｏｍｐｌｅｍｅｎｔ　ｗｉｔｈ　Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ　ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ　ｇｅｎｅ），　ｉｔ　ｗａｓ　ｔｒａｎｓｆｏｒｍｅｄ　ｉｎｔｏ　ｙｅａｓｔ　ＨＤＹ－０１　ｂｙ　ＬｉＡｃ　ｍｅｔｈｏｄ　ａｎｄ　ｔｈｅ　ａｌｃｏｈｏｌ　ｄｅｈｙｄｒｏｇｅｎａｓｅ　Ｉ　（ＡＤＨ　Ｉ）　ｉｎ　Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ　ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ　ｗａｓ　ｄｅｌｅｔｅｄ　ｔｈｒｏｕｇｈ　ｈｏｍｏｌｏｇｏｕｓｒｅｃｏｍｂｉｎａｔｉｏｎ．　Ａ　ｔｒａｎｓｆｏｒｍａｎｔ　ｗａｓ　ｏｂｔａｉｎｅｄ　ｗｉｔｈ　ｌｏｗ　ＡＤＨ　Ｉ　ａｃｔｉｖｉｔｙ．　Ｔｈｅ　ｆｅｒｍｅｎｔａｔｉｏｎ　ｔｅｓｔｓ　ｓｈｏｗｅｄ　ｔｈａｔ　ｔｈｅ　ａｖｅｒａｇｅ　ａｌｃｏｈｏｌｃｏｎｔｅｎｔ　ｏｆ　ｔｈｅ　ｔｒａｎｓｆｏｒｍａｎｔ　ｉｓ　１．８％（Ｖ／Ｖ），　６５％　ｌｏｗｅｒ　ｔｈａｎ　ｔｈｅ　ｏｒｉｇｉｎ　ｏｎｅ．　Ｔｈｅ　ａｌｃｏｈｏｌ　ｍｅｔａｂｏｌｉｃ　ｐａｔｈｗａｙ　ｉｎ　ｔｈｉｓ　ｔｒａｎｓｆｏｒｍａｎｔｉｓ　ｉｎｔｅｒｆｅｒｅｄ．Ｋｅｙ　ｗｏｒｄｓ：Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ　ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ；ｇｅｎｅ　ｄｅｌｅｔｉｏｎ；ａｌｃｏｈｏｌ　ｄｅｈｙｄｒｏｇｅｎａｓｅ　Ｉ　（ＡＤＨ　Ｉ）中图分类号：ＴＳ２６２５ 文献标识码：Ａ 文章编号：１００２－６６３０（２００８）０２－０２１０－０３啤酒是以麦芽为主要原料，添加酒花，经酵母发酵酿制而成的，是一种含二氧化碳、起泡和低酒精度的饮料酒［１］。

带有木糖还原酶基因和木糖醇脱氢酶基因的重组酿酒酵母的构建摘要：酿酒酵母是工业上生产乙醇的优良菌种。

但酿酒酵母不能发酵木糖，只能发酵木糖的异构体。

木糖是半纤维素水解液中除葡萄糖外的另一种主要成分，最高可占半纤维素水解糖类的34%，但是自然界中的微生物普遍对木糖的利用率较低，因此提高木糖的生物转化率，可促进对半纤维素水解液的利用，从而实现对木质纤维素原料的全糖利用。

关键词：木糖还原酶基因；木糖醇脱氢酶基因；酿酒酵母；一、木质纤维素生产乙醇的研究目前各国的乙醇主要以玉米、小麦、薯类等粮食为原料经过发酵生产而成，以淀粉类和糖类作为发酵原材料，采用微生物法发酵生产乙醇是一项成熟的技术，但高昂的原料成本使发酵法生产乙醇的工业应用受到限制，尤其是中国这样的人口大国，粮食作为原料生产乙醇决非长远之计。

车用汽油乙醇的推广必将增加粮食的供需矛盾。

目前，国内外均以淀粉质和糖蜜为原料生产乙醇，底物成本在生产总成本中占有很大的比例，在欧美发达国家为40％左右，而在中国这一数值高达60％--70％。

因此开发用于燃料乙醇生产的廉价原材料是这一能源领域研究的主要方向之一。

地球上最丰富的可再生资源--木质纤维素，每年仅陆生植物就可以产生约500亿吨，它还是最主要的生物质资源，占地球生物总量的60％----80％。

它是光合作用产物，充分将其中可利用成分转化为燃料乙醇，不仅可以提供清洁能源，而且有利于推动太阳光能的转化利用，同时促进大气中C02的循环，减少由矿物燃料燃烧造成的C02净排放。

木质纤维素具有成本低廉、可再生、来源丰富、品种多、再生时间短等优点，尤其是农林废弃物资源，开展利用农林废弃物生产燃料乙醇的研究不仅可以解决农林废弃物的利用问题，而且可以缓解粮食和能源紧张。

我国是一个农业大国，具有巨大的农业资源，木质纤维素尤为丰富，农作物秸秆、皮壳、林业副产品、城市垃圾和工业废物数量也很可观。

我国每年仅农作物秸秆产量就有5亿吨左右，可生产7256万吨无水乙醇，潜力十分巨大。

专利名称：木糖醇发酵重组酵母菌株的构建方法及应用专利类型：发明专利
发明人：李荣杰,徐斌,薛培俭
申请号：CN200910084025.3
申请日：20090512
公开号：CN101565698A
公开日：
20091028
专利内容由知识产权出版社提供
摘要：本发明公开了一种木糖醇发酵重组酵母菌株的构建方法，其主要是采用基因工程技术完全突变产木糖醇的酵母细胞中木糖醇脱氢酶双拷贝基因中的第一拷贝；以及突变第二拷贝3′端的60－150碱基，使得突变基因编码的木糖醇脱氢酶变构体在C－端有氨基酸缺失，从而降低酶活性。

用本发明方法得到的重组热带假丝酵母菌株发酵生产木糖醇，产木糖醇119.2克/升，木糖转化率提高29.8％，提高了木糖醇的得率。

申请人：安徽丰原发酵技术工程研究有限公司
地址：233010 安徽省蚌埠市胜利西路北侧
国籍：CN
代理机构：北京路浩知识产权代理有限公司
代理人：王朋飞
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转木糖还原酶基因XYL1酿酒酵母的构建及产木糖醇能力研究王凤梅;张邦建;岳泰新;马利兵【摘要】将人工合成的树干毕赤酵母(Pichia stipitis)的木糖还原酶基因XYL1插入酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)表达载体pYES2中,然后将重组质粒pYES2-XYL1导入酿酒酵母INVSc1中,构建转木糖还原酶基因XYL1酿酒酵母菌株INVSc 1/pYES2-XYL1,最后采用营养缺陷培养基筛选转木糖还原酶基因酿酒酵母并对其产木糖醇的能力进行检测.结果表明,成功获得2株转木糖还原酶基因XYL1酿酒酵母菌株INVSc1/pYES2-XYL1-01、INVSc1/pYES2-XYL1-02,当两菌株以50g/L木糖及10g/L半乳糖为碳源发酵5d后,木糖醇产量分别高达(13.68±2.37) g/L、(12.09±1.45)g/L,显著高于非转基因酿酒酵母INVSc1的木糖醇产量(1.08±0.37)g/L(P＜0.05),说明XYL1基因的导入显著提高了酿酒酵母INVSc1生产木糖醇的能力(P＜0.05).为采用基因工程酿酒酵母制备食用木糖醇提供了理论及技术基础.【期刊名称】《中国酿造》【年(卷),期】2018(037)012【总页数】5页(P66-70)【关键词】酿酒酵母;木糖还原酶基因;工程菌构建;木糖醇【作者】王凤梅;张邦建;岳泰新;马利兵【作者单位】包头轻工职业技术学院食品药品学院,内蒙古包头014035;包头轻工职业技术学院食品药品学院,内蒙古包头014035;包头轻工职业技术学院食品药品学院,内蒙古包头014035;内蒙古科技大学生命科学与技术学院,内蒙古包头014010【正文语种】中文【中图分类】TS245.8木糖醇为五碳糖醇，是一种白色结晶类物质，可由木糖经氢化作用形成。

其甜度与蔗糖相近，却具有较低的热值[1]。

更为重要的是体内木糖醇的利用无需胰岛素，因此，可作为糖尿病人饮食中的一种増甜剂。

热带假丝酵母木糖醇脱氢酶的分离纯化摘要：随着社会经济的高速发展，能源危机日益困扰着整个世界，开发新的替代能源显得越发重要。

木质纤维素是地球上最丰富、最廉价的可再生资源，木质纤维素的开发利用已成为国际研究的热点。

在酸或酶的作用下，木质纤维素的水解产物主要为六碳糖（葡萄糖、甘露糖和半乳糖）和五碳糖（木糖和阿拉伯糖），其中六碳糖可由传统的酿酒酵母发酵生成乙醇，而五碳糖则不能被酿酒酵母发酵利用。

研究表明，热带假丝酵母可代谢利用木糖产生乙醇。

生物技术的发展为构建以木质纤维素为原料生产燃料乙醇的酵母工程菌铺展了技术平台，目前主要手段有原生质体融合和克隆木糖代谢关键酶基因构建基因工程菌等。

关键词：热带假丝酵母木糖醇脱氢酶；分离纯化一、概述木糖醇脱氢酶来源主要集中于一些能代谢木糖的酵母和丝状真菌中，如酵母中的假丝酵母，毕氏酵母和管囊酵母3 个属，真菌中的尖镰孢菌及粗糙脉孢菌。

尽管酿酒酵母不能发酵和在木糖上生长，但据报道，它能以一个很低的速率代谢木糖。

关于酿酒酵母中是否存在木糖醇脱氢酶活性的报道存在矛盾，能在酿酒酵母中检测到木糖醇脱氢酶活性，为了澄清木糖醇脱氢酶是否在酿酒酵母中存在，进行了不同培养成分条件下，木糖醇脱氢酶活性测定。

结果表明，当在混合糖（葡萄糖和木糖）条件下培养时，仅当细胞葡萄糖消耗完，且有木糖存在时，才可检测到此酶活性。

由此推断是由于没有在木糖存在条件下培养酵母。

不同菌株中提取的木糖醇脱氢酶其性质有一些差异，但其蛋白序列和酶学性质有一定的相似性，这些酶特异性地以NAD+ 为辅酶，酶活多受金属离子的影响。

一般认为，多数木糖醇脱氢酶属于中链脱氢酶家族，为同型聚体结构，亚基由300～400 个氨基酸组成，其活性中心序列有较高的保守性，但也有不同报道。

二、热带假丝酵母木糖醇脱氢酶的分离纯化1.木糖醇脱氢酶活性测定。

木糖醇脱氢酶需要NAO千作为其辅因子，催化木糖醇生成木酮糖以及NADH，通过测里单位时间内酶催化反应体系在吸光度的增量从而测定XDH的活力，也以次定义其反应速度。

专利名称：一种酿酒酵母基因表达系统及其构建与应用
专利类型：发明专利
发明人：张梁,范贺超,高芝,李由然,石贵阳,顾正华,李赢,丁重阳,何冬旭
申请号：CN201510005035.9
申请日：20150106
公开号：CN104630258A
公开日：
20150520
专利内容由知识产权出版社提供
摘要：一种整合型酿酒酵母基因表达系统，包括一种表达载体，所述表达载体从5’-3’依次包括以下可操作性元件：pMD19-Tsimple质粒骨架、rDNA同源重组序列、外源基因表达盒和筛选标记基因表达盒；所述外源基因表达盒自上游至下游依次包括启动子、外源基因插入酶切位点以及转录终止子；所述筛选标记基因表达盒包括启动子、抗生素抗性基因、转录终止子。

所述酵母为酿酒酵母。

本发明的表达载体可实现在酿酒酵母中的整合型稳定表达，对酿酒酵母的基础理论研究及产品开发具有重要的意义。

申请人：江南大学
地址：214122 江苏省无锡市滨湖区蠡湖大道1800号
国籍：CN
代理机构：无锡华源专利事务所(普通合伙)
代理人：聂汉钦
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藏躲市安详阳光实验学校生物人教版选修3专题1 基因工程单元检测（时间：60分钟，满分：100分）一、选择题（每小题2分，共50分）1．下列除哪一项外，其余均为基因工程载体必须具备的条件？（）A．具有标记基因，便于筛选B．具一至多个酶切位点，以便与目的基因连接C．能在宿主细胞中复制并稳定保存D．是环状DNA分子2．下图表示限制酶切割某DNA的过程，从图中可知，该限制酶能识别的碱基序列及切点是（）。

A．CTTAAG，切点在C和T之间B．CTTAAG，切点在G和A之间C．GAATTC，切点在G和A之间D．CTTAAC，切点在C和T之间3．在基因表达载体的构建中，下列说法错误的是（）。

①一个基因表达载体的组成包括目的基因、启动子、终止子②有启动子才能驱动基因转录出mRNA ③终止子的作用是使转录在相应地方停止④所有基因表达载体的构建是完全相同的A．②③B．①④C．①②D．③④4．多聚酶链式反应（PCR）是一种体外迅速扩增DNA片段的技术。

PCR过程一般经历30多次下述循环：90～95 ℃下使模板DNA变性、解链→55～60 ℃下复性（引物与DNA模板链结合）→70～75 ℃下引物链延伸（形成新的脱氧核苷酸链）。

下列有关PCR过程的叙述中，不正确的是（）。

A．变性过程中被切断的是DNA分子内碱基对之间的氢键，也可利用解旋酶实现B．复性过程中引物与DNA模板链的结合依靠碱基互补配对原则完成C．延伸过程中需要DNA聚合酶、ATP、四种核糖核苷酸D．PCR与细胞内DNA复制相比所需要酶的最适温度较高5．下列哪项不是将目的基因导入植物细胞的方法？（）A．基因枪法B．显微注射法C．农杆菌转化法D．花粉管通道法6．目的基因导入受体细胞后，是否可以稳定维持和表达其遗传特性，只有通过检测和鉴定才能知道。

下列属于目的基因检测和鉴定关键步骤的是（）。

A．检测受体细胞是否含有目的基因B．检测受体细胞是否含有致病基因C．检测目的基因是否转录出mRNAD．检测目的基因是否翻译出蛋白质7．下列有关基因工程叙述错误的是（）。

专利名称：一种表达木糖醇脱氢酶基因的质粒的构建方法专利类型：发明专利
发明人：平文祥,葛菁萍,杜春梅,凌宏志,宋刚,赵丹,高冬妮,洛雪
申请号：CN200810064830.5
申请日：20080630
公开号：CN101302534A
公开日：
20081112
专利内容由知识产权出版社提供
摘要：一种表达木糖醇脱氢酶基因的质粒的构建方法，它涉及一种质粒载体的构建方法。

它解决了目前酿酒酵母缺乏木糖醇脱氢酶(XDH)，而不能使木糖代谢后产生乙醇问题。

构建方法：一、克隆xyl2基因；二、回收、纯化xyl2基因片段后与pGMT vector载体连接，得到pGMT－xyl2；三、重组质粒p406ADH1－1的构建；四、重组质粒p406ADH1－2的构建；五、重组质粒p406ADH1－3的构建；六、将xyl2基因加入质粒p406ADH1－3，即得到表达木糖醇脱氢酶基因的质粒。

本发明方法所构建的载体转化酿酒酵母后实现了木糖醇脱氢酶基因的高效稳定表达。

申请人：黑龙江大学
地址：150080 黑龙江省哈尔滨市南岗区学府路74号
国籍：CN
代理机构：哈尔滨市松花江专利商标事务所
代理人：荣玲
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(19)中华人民共和国国家知识产权局(12)发明专利申请(10)申请公布号 (43)申请公布日 (21)申请号 201810954604.8(22)申请日 2018.08.21(71)申请人 吉林农业大学地址 130118 吉林省长春市新城大街2888号(72)发明人 张斯童　陈光　孙旸　王刚　陈欢　(74)专利代理机构 重庆晶智汇知识产权代理事务所(普通合伙) 50229代理人 李靖(51)Int.Cl.C12N 1/19(2006.01)C12N 15/81(2006.01)C12P 19/00(2006.01)C12R 1/865(2006.01)(54)发明名称一种高产木聚糖酶酿酒酵母菌及应用(57)摘要本发明涉及一种高产木聚糖酶酿酒酵母菌株S8-H，通过将来源于黑曲霉CICC2462菌的木聚糖酶xynB基因构建表达盒，利用rDNA整合法构建得到8拷贝木聚糖酶基因菌株，木聚糖酶表达量325U/mL，通过转化pYES6-PGK -HAC1片段到该菌株得到过表达HAC1 8拷贝木聚糖酶酿酒酵母工程菌，木聚糖表达量达到381U/mL，过表达HAC1提高了与内质网蛋白折叠相关基因表达水平，同时本发明提供了一种酿酒酵母菌分泌表达多拷贝外源基因的模型，可利用该模型构建表达其他基因,本发明所提供的高产木聚糖酶酿酒酵母菌株可优势的应用于秸秆降解，饲料制造过程中。

权利要求书2页 说明书7页序列表9页 附图3页CN 108949602 A 2018.12.07C N 108949602A1.一种高产木聚糖酶酿酒酵母菌株，其特征在于：所述菌株含有木聚糖酶xynB基因，序列如SEQ ID NO：23；所述菌株含有8拷贝木聚糖酶基因表达盒PαXC，PαXC序列如SEQ ID NO：9；所述菌株含有过表达基因HAC1，序列如SEQ ID NO：27；所述菌株以酿酒酵母菌为工程菌。

2.如权利要求1所述的菌株，其特征在于：所述菌株含有8个拷贝的木聚糖酶基因表达盒PαXC，每个所述木聚糖酶基因表达盒包括以下元件：（a）起始信号元件为PGK，序列如SEQ ID NO：24；（b）分泌信号肽α-factor，序列如SEQ ID NO：25；（c）木聚糖酶xynB基因；（d）终止子CYC1，序列如SEQ ID NO：26。

第４０卷Ｖ０１．４０第３期Ｎｏ．３山东大学学报（理学版）ＪＯＵＲＮＡＬＯＦＳＨＡＮＤＯＮＧＵＮＩＶＥＲＳＩＴＹ２００５年６月Ｊｕｎ．２００５文章编号：１６７１．９３５２（２００５）０３。

０１０５—０５ｒＤＮＡ介导的多拷贝整合表达载体的构建及其在酿酒酵母工业菌株中的应用刘向勇，沈煜，郭亭，鲍晓明＋（山东大学微生物技术国家重点实验室，山东济南２５０１００）摘要：根据酵母整合质粒的设计要求，ＰＣＲ扩增特定的２．２ｋｂｒＤＮＡ片段，并以此替换酿酒酵母（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓｃｅｒｅｖｉ—ｓｉａｅ）整合栽体ＹＩｐ５的ＵＲＡ３片段；在此基础上，引入Ｇ４１８抗性基因ＫａｎＭＸ和酵母磷酸甘油激酶（ｐｈｏｓｐｈｏｇｌｙｃｅｒａｔｅｋｉｎａｓｅ，ＰＧＫ）组成型强启动子和终止子序列（ＰＧＫｐ—ｔ），构建适合酿酒酵母工业菌株高拷贝整合表达载体ｐＹＭＩＫＰ．以细菌木糖异构酶（；ｙｌ。

ｉｓｏｍ。

ｅ，Ｘ１）基因ｘｙｌＡ为目标基因，通过载体ｐＹＭＩＫＰ引入到酵母工业菌株ＮＡＮ一２７中．酵母转化子在非选择培养条件下，连续生长５０世代质粒稳定性为９９．７２％．目标基因高拷贝重组菌的木糖异构酶比酶活是对照菌株的６７．２倍，达到０．６７２Ｕ／ｍｇ蛋白，实现了外源基因在酿酒酵母工业菌株中的稳定高效表达．关键词：ｒＤＮＡ；显性选择标记；多拷贝整合中图分类号：Ｑ９３文献标识码：ＡＣｏｎｓｔｒｕｃｔｉｏｎｏｆａｒｉｂｏｓｏｍａｌＤＮＡｍｕｌｔｉ—ｃｏｐｙｉｎｔｅｇｒａｔｉｏｎｖｅｃｔｏｒａｎｄａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｉｎｔｈｅｉｎｄｕｓｔｒｉａｌＳａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓｃｅｒｅｖｉｓｉａｅｓｔｒａｉｎＬＩＵＸｉａｎｇ—ｙｏｎｇ，ＳＨＥＮＹｕ，ＧＵＯＴｉｎｇ＆ＢＡＯＸｉａｏ—ｍｉｎｇ＋（ＳｔａｔｅＫｅｙＬａｂｏｒａｔｏｒｙｏｆＭｉｃｒｏｂｉａｌＴｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，ＳｈａｎｄｏｎｇＵｎｉｖ．，Ｊｉｎａｎ２５０１００，Ｓｈａｎｄｏｎｇ，Ｃｈｉｎａ）Ａｂｓｔｒａｃｔ：ＢａｓｅｄｏｎｔｈｅＹＩｐ５（ｙｅａｓｔｉｎｔｅｇｒａｔｉｏｎｖｅｃｔｏｒ），ｃｏｎｓｔｒｕｃｔｉｏｎｏｆｔｈｅｍｕｌｔｉ—ｃｏｐｙｉｎｔｅｇｒａｔｉｏｎｖｅｃｔｏｒｐＹＭＩＫＰｗａｓｉｎｖｅｓｔｉｇａｔ—ｅｄｂｙｕｓｉｎｇａ２．２ｋｂｄｅｓｉｇｎｅｄｒＤＮＡｆｒａｇｍｅｎｔｆｒｏｍＳａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓｃｅｒｅｖｉｓｉａｅｔｏｒｅｐｌａｃｅｔｈｅｏｒｉｇｉｎａｌＵＲＡ３ｇｅｎｅｆｏｒｔａｒｇｅｔｅｄｂｏ—ｍｏｌｏｇｏｕｓｒｅｃｏｍｂｉｎａｔｉｏｎ．ＴｈｅＧ４１８ｒｅｓｉｓｔａｎｃｅｇｅｎｅＫａｎＭＸｗａｓｕｓｅｄａｓｔｈｅｄｏｍｉｎａｎｔｓｅｌｅｃｔｉｏｎｍａｒｋｅｒ，ａｎｄｙｅａｓｔｐｈｏｓｐｈｏｇｌｙｃｅｒ—ｉｃｋｉｎａｓｅ（ＰＧＫ）ｃｏｎｓｔｉｔｕｔｉｖｅｐｒｏｍｏｔｅｒａｎｄｔｅｒｍｉｎａｔｏｒ（ＰＧＫｐ—ｔ）ｗｅｒｅｕｓｅｄｆｏｒｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎｃｏｎｔｒｏｌｅｌｅｍｅｎｔｉｎｔｈｅｐＹＭＩＫＰｒｅｓｐｅｅ—ｔｉｖｅｌｙ．ＴｈｅｐｌａｓｍｉｄｃａｒｒｙｉｎｇｘｙｌＡｇｅｎｅｗａｓｔｒａｎｓｆｏｒｍｅｄａｎｄｔｈｅｘｙｌＡｇｅｎｅｗａｓｉｎｔｅｇｒａｔｅｄｉｎｔｏｇｅｎｏｍｅｒＤＮＡｌｏｃｕｓｏｆＳ．ｃｅｒｅｖｉｓｉ—ｕｅＮＡＮ一２７ｂｙｕｓｉｎｇｔｈｅｐＹＭＩＫＰ．ＴｈｅｘｙｌｏｓｅｉｓｏｍｅｒａｓｅＸＩｓｐｅｃｉｆｉｃａｃｔｉｖｉｔｙｏｆｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔｓｔｒａｉｎＸＨ３４ｉｓ０．６７２Ｕ／ｍｇｐｒｏｔｅｉｎ，ｗｈｉｃｈｉｓ６７．２ｔｉｍｅｓａｓｍｕｃｈａｓｔｈｅｐａｒｅｎｔｓｔｒａｉｎ．Ｔｈｅｉｎｔｅｇｒａｎｔｓａｒｅｍｉｔｏｔｉｃａｌｌｙｓｔａｂｌｅｆｏｒ５０ｇｅｎｅｒａｔｉｏｎｓｕｎｄｅｒｔｈｅｎｏｎ—ｓｅｌｅｃｔｉｖｅｐｒｅｓｓｕｒｅｃｏｎｄｉｔｉｏｎ．Ｋｅｙｗｏｒｄｓ：ｒｉｂｏｓｏｍａｌＤＮＡ；ｄｏｍｉｎａｎｔｓｅｌｅｃｔａｂｌｅｍａｒｋｅｒ；ｍｕｌｔｉ—ｃｏｐｙｉｎｔｅｇｒａｔｉｏｎ０引言酿酒酵母（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）具有生长旺盛，易培养，生物量大，公认安全等优良特点，是发酵工业的重要微生物之一，人们对酿酒酵母的利用已有上千年的历史．随着分子生物学技术的不断发展完善和酵母工程菌产业化需求的日趋强烈，直接对酿酒酵母工业菌株进行基因工程改造的工作日益受到重视．由于酵母工业菌株一般是原养型多倍性菌收稿日期：２００５—０１．１０基金项目：国家自然科学基金委员会与中国节能投资公司联合研究基金资助项目（５０２７３０１９）；国家重点基础研究发展计划（９７３计划）资助项目（２００４ＣＢ７１９７０２）作者简介：刘向勇（１９８１．），男，硕士研究生，主要从事微生物遗传与分子生物学研究．＊通讯作者　万方数据１０６山东大学学报（理学版）第４０卷株，同时其使用环境的粗放性，生产原料化学成分的不确定性，使常规的营养缺陷型标记和附加体质粒不再适用对酿酒酵母工业菌株的分子生物学操作，取而代之的是引导外源基因插入酵母染色体的整合型载体，以提高其遗传稳定性；同时必须采用显性选择标记以适应其原养型遗传背景．早期的酿酒酵母整合质粒载体（例ＹＩｐ５）的同源整合位点是营养标记基因片断，由于这类基因在酿酒酵母基因组中没有重复序列，因而一般认为是低拷贝整合载体；同时这类整合载体要求受体菌必须是营养缺陷型才能有效筛选转化子，显然，这不适用于工业菌株的分子生物学操作．根据酿酒酵母较易发生同源重组的特点，使用重复序列作为整合载体同源重组位点是提高外源基因在酵母基因组中拷贝数的有效途径，酵母基因组中ｒＤＮＡ有１００～２００个重复单元…，以此为整合位点提高整合拷贝数的应用策略在酿酒酵母（Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）幢Ｊ、产朊假丝酵母（Ｃａｎｄｉｄａｕｔｉｌｉｓ）１３］和乳酸克鲁维酵母（Ｋｌｕｙｖｅｒｏｍｙｃｅｓｌａｃｔｉｓ）Ｈ１等多种微生物中展开研究，但Ｌｏｐｅｓ等忸１所构建的酿酒酵母整合质粒依然是以营养缺陷型作为选择标记．近年来逐渐使用一些酵母显性选择标记，如氨基糖苷类抗生素Ｇ４１８抗性基因，铜离子抗性基因等，使对工业菌株的转化成为可能，其中来自转座子Ｔｎ９０３的Ｇ４１８抗性基因ＫａｎＭＸ，应用得较为广泛，并通过提高Ｇ４１８的浓度筛选高拷贝的整合转化子ｂＪ．采用强启动子是实现外源基因高效表达的另一途径，目前常用的酿酒酵母组成型启动子有ＰＧＫ，ＡＤＨｌ（ａｌｃｏｈｏｌｄｅｈｙｄｒｏｇｅｎａｓｅＩ），ＧＰＤ（１ｙｃｅｒａｌｄｅｈｙｄｅｓｐｈｏｓｐｈａｔｅｄｅ．ｈｙｄｒｏｇｅｎａｓｅ）等．本文以酿酒酵母整合载体ＹＩｐ５为骨架，在其中引入特定的ｒＤＮＡ片段及Ｇ４１８抗性基因，同时引入酿酒酵母ＰＧＫ强启动子，构建ｒＤＮＡ介导的多拷贝整合表达载体，以适用对酿酒酵母工业菌株的分子生物学操作，提高外源基因的稳定性和表达量．木糖异构酶催化木糖转化为木酮糖，是酿酒酵母利用木糖产生乙醇代谢工程改造的关键酶之一，本文以细菌木糖异构酶（ｘｙｌｏｓｅｉｓｏｍｅｒａｓｅ，ＸＩ）基因ｘｙｌＡ为目标基因，研究了构建质粒在酵母工业菌株中的适用性．１材料与方法１．１菌株和质粒Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ．ｃｏｌｉＤＨ５ａ（Ｆ—ｒｅｃＡ１ｅｎｄＡ１ｈｓｄＲｌ７［ｒｘ—ｍＫ一］ｓｕｐＥ４４），一ｔｈｉ－１ｇｙｒＡ９６ｒｅｌＡ１）用于亚克隆．酿酒酵母酒精生产工业菌株ＮＡＮ．２７为受体菌，由河南天冠企业集团惠赠；ＹＩｐ５为酵母整合载体改造的骨架；质粒ｐＦＡ６ａ一‰ｎＭｘ４［６１用于获得Ｇ４１８抗性基因‰ｎ删；质粒ｐＭＡ９１［７３用于获得ＰＧＫ启动子；质粒ｐＢＸＩ一１用于获得ｘｙｌＡ基因．１．２分子生物学方法分子生物学常规操作按各公司说明书进行，限制性内切酶、Ｔ４ＤＮＡ连接酶、Ｔａｑ聚合酶为ＴａＫａＲａ或上海Ｓａｎｇｏｎ公司产品．ＤＮＡ片断凝胶回收采用美国Ｏｍｅｇａ公司ＧｅｌＥｘｔｒａｃｔｉｏｎＫｉｔ试剂盒．Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ染色体的制备参照文献［８］方法进行，以ＴｈｅｒｍｏＳａｖａｎｔ公司ＦＰｌ２０型细胞破碎仪破碎细胞．酵母工业菌株转化参照文献［９］，采用醋酸锂转化法进行，在Ｇ４１８平板上筛选转化子．所用ＰＣＲ引物由上海博亚公司合成．１．３转化子验证Ｇ４１８抗性表型测定：制备酵母菌休止细胞，划线接种在含Ｇ４１８的ＹＰＤ平板上，３０℃培养４８ｈ，观察生长情况．青霉素酶活力测定：参照ＣｈｅｖａｌｌｉｅｒＭＲｎ刮方法进行．转化子中Ａｍｐ‘基因表达产生的青霉素酶水解青霉素可产生还原性的青霉素噻唑酸，该酸可以使碘．淀粉复合物脱色，因此转化子可以在含有碘．淀粉的固体平板上形成透明圈．青霉素酶量越大形成的透明圈越大，表明拷贝数越高．转化子稳定性测定：酵母转化子接种４０ｍＬＹＰＤ液体培养基中，不同时间取样，系列稀释，分别在ＹＰＤ和含Ｇ４１８的ＹＰＤ平板上菌落计数，分别记为总菌数和带有整合质粒的菌落数，以下式计算质粒稳定性：稳定性（％）＝（带有整合质粒的菌落数÷总菌数）×１００％．（１）１．４粗酶液的制备及木糖异构酶活性测定粗酶液的制备参照文献［７］的方法进行．木糖异构酶的活性以转化果糖为葡萄糖的能力表示，一个比活力单位（Ｕ／ｍｇ）定义为：被转化底物的量（ｍｍ０１）／（酶蛋白质（ｍｇ）×转化时间（ｍｉｎ））．蛋白含量的测定用考马斯亮兰（ＣｏｏｍａｓｓｉｅＢｌｕｅ）法，牛血清蛋白为标准品．　万方数据第３期刘向勇，等：ｒＤＮＡ介导的多拷贝整合表达载体的构建及其在酿酒酵母工业菌株中的应用１０７２结果与讨论２．１ｒＤＮＡ克隆酵母基因组中高度重复的ｒＤＮＡ单元，是构建高拷贝整合表达载体同源重组区的首选序列．每个ｒＤＮＡ单元长达９．１ｋｂ左右，由５Ｓ、５．８Ｓ、２５Ｓ和１８ＳｒＲＮＡ的转录区及一些非转录区组成．有研究表明”１“，用于介导整合的ｒＤＮＡ区域，不应包含其ＲＮＡｐｏｌｙｍｅｒａｓｅＩ的起始转录区，同时整合于ｒＤＮＡ区域的外源片断大小接近ｒＤＮＡ单元长度时，其在有丝分裂中稳定性最高．根据这一要求，对Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅｒＤＮＡ序列进行分析，确定所需２．２ｋｂ片断，其在ｒＤＮＡ单元中的相对位置（图１（Ａ）），设计引物分别引入ＸｍａＨＩ和ＢｓｐＭ１Ｉ酶切位点（下划线），ｓ—ｒＤＮＡ．Ｆ２（ＡＴＣＡＣＧＧＣＣＧＡＡＣＧＡＡＣＧＡＧＡＣＣＴＩ’ＡＡＣＣＴ）和Ｓ—ｒＤ．ＮＡ—Ｒ２（ＧＣＴＧ！垦垦堡！垫ＧＧＡＡｃｃＴｃＴＡＡＴｃＡＴＴＧＧｃＴ），ＰＣＲ反应条件：９４℃，２ｍｉｎ；９４℃，１ｍｉｎ；５３ｏＣ，１ｍｉｎ；７２℃，２．５ｍｉｎ；循环３４次；７２℃，７ｍｉｎ．以Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ染色体ＤＮＡ为模板，２．２ｋｂｒＤＮＡ片段ＰＣＲ产物见图１（Ｂ），该片段含有质粒用于线性转化的肋ｎＩ单酶切位点．图１ＰＣＲ扩增克隆进入载体ｐＹＭＩＫＰ中的ｒＤＮＡ片段和在ｒＤＮＡ单元中的位置ＰｏｌＩ一：ＲＮＡ聚合酶Ｉ转录起始区；霾鏊克隆进入载体ｐＹＭＩＫＰ中的ｒＩ）ＮＡ片段；１，２．２ｋｂｒＤＮＡ片段；２，１一ｋｂｌａｄｄｅｒ．Ｆｉｇ．１Ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎｏｆ２．２ｒＤＮＡｆｒａｇｍｅｎｔｂｙＰＣＲａｎｄｉｔｓｐｏｓｉｔｉｏｎｉｎｔｈｅｒＤＮＡｕｎｉｔｓＰｏｌＩ一：ＲＮＡｐｏｌｙｍｅｒａｓｅＩｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎｉｎｉｔｉａｔｉｏｎｒｅｇｉｏｎ：瓣《．囊冀纂ｒＤＮＡｆｒａｇｍｅｎｔｃｌｏｎｅｄｉｎｐＹＭＩＫＰｖｅｃｔｏｒ；１，２．２ｋｂｒＤＮＡｆｒａｇｍｅｎｔ；２，１－ｋｂｌａｄｄｅｒ．２．２酵母表达载体ｐＹＭＩＫＰ的构建１．８ｋｂＰＧＫ启动子一终止子片段来源于质粒ｐＭＡ９１，连接于ＹＩｐ５的ＨｉｎｄⅢ位点，产生ｐＹＩＰ一１０５．１．５ｋｂＧ４１８抗性基因‰ｎ删以质粒ｐＦＡ６ａｋａｎＭＸ４为模板，ＰＣＲ扩增得到．反应条件：９４℃，２ｍｉｎ；９４℃，１ｍｉｎ，４５℃，１ｍｉｎ，７２℃，２ｍｉｎ，循环３０次；７２℃，７ｍｉｎ，引物均引入ＳａｌⅡ酶切位点（下划线），Ｓ—ＫａＢｒ＿ＦＩ（ＡＴＹＡＧＴＣＧＡＣＴＣＴＧＴＩＴＡＧＣＴＹＧＣＣＴＣ）和Ｓ．Ｋａｎｒ＿Ｒ１（ＡＣＧＣＧＴＣＧＡＣＴＡＴＣＡＴＣＧＡＴＧＡＡＴＩ＂ＣＧＡ），ＰＣＲ产物连接于ｐＹＩＰ．１０５的ＳａｌＩ位点，得到ｐＹＩＰ．１０７（图２）．２．２ｋｂｒＤＮＡ片段与ＸｍａⅢ和ＢｓｐｍＨＹ双（酶切翻ⅥＡ９ｌ图２整合载体ｐＹＭＩＫＰ的构建及其物理图谱Ｆｉｇ．２ＣｏｎｓｔｒｕｃｔｉｏｎｏｆｔｈｅｉｎｔｅｇｒａｔｉｖｅｐｌａｓｍｉｄｐＹＭＩＫＰａｎｄｉｔｓｐｈｙｓｉｃａｌｄｉａｇｒａｍ１，ｐＹＭＩＫＰ／Ｓａｌｌ；２，ｐＹＭＩＫＰ／Ｓｐｈｉ；３，１－ｋｂｌａｄｄｅｒ　万方数据１０８山东大学学报（理学版）第４０卷ｐＹＩＰ．１０７的大片段连接．分别用ＳａｌＩ（７．６ｋｂ，１．５ｋｂ）和Ｓｐｈｉ（６．３ｋｂ、２．８ｋｂ）进行酶切验证，重组质粒定名为ｐＹＭＩＫＰ（图２）．ｐＹＩＰ．１０７和ｐＹＭＩＫＰ均带有适用于工业酵母转化的Ｇ４１８显性选择标记，用于表达外源基因的ＰＧＫ酵母强启动子一终止子．但ｐＹＩＰ．１０７以酿酒酵母ＵＲＡ３区域为整合位点，为低拷贝整合载体，ｐＹＭＩＫＰ以酿酒酵母２．２ｒＤＮＡ片段为整合位点，为高拷贝整合载体．此外该质粒的ｒＤＮＡ片断中含有肋ⅡＩ线性化位点，同时为提高载体的稳定性¨”，去掉了ＹＩｐ５中的ＵＲＡ３基因，最大限度减少所构建载体的大小．２．３不同删Ｈ表达质粒的构建细菌木糖异构酶基因ｘｙ／Ａ以质粒ｐＢＸＩ［７１为模板，ＰＣＲ扩增得到，反应条件：９４℃，２ｍｉｎ；９４℃，１ｍｉｎ；５８ｏＣ，１ｍｉｎ；７２℃，１ｍｉｎ；循环３４次；７２℃，７ｍｉｎ，引物均引入取ｚⅡ的同尾酶ＢｃｌＩ酶切位点（下划线），Ｓ．ＸＩ．Ｆ３（ＧＣＧＣＴＧＡＴＣＡＴＣＴＡＧＡＡＴＧＴＡＧＧＡＧＣＣＣＡＡＡＣＣＧＧＡＧＣＡＣＡＧ）和Ｓ．ＸＩ．Ｒ３（ＧＣＴｒＴＧＡＴＣＡＴＣＴＡＧＡＴＣＡＣＣＣＣＣＧＣＡＣＣＣＣＣＡＧＧＡＧＧＴＡＣＴ）．分别连接于质粒ｐＹＭＩＫＰ和ｐＹＩＰ．１０７中ＰＧＫ启动子下，得到ｘＩ多拷贝整合表达载体ｐＹＭＩＫＰ．ＸＩ（图３Ａ）和低拷贝整合表达载体ｐＹＩＰ一１０７．ＸＩ（图３Ｂ）．（Ａ）鬻１ＩＩ尸蘸转Ⅱ∞３７ｂｐＪ洳一ＵＲＡ３／ｓ∥Ｘｍ１１曰印曲广’一ｓｍＩ图３质粒ｐＹＭＩＫＰ－ＸＩ和ｐＹＩＰ一１０７一ＸＩ的物理图谱Ｆｉｇ．３ＰｈｙｓｉｃａｌｄｉａｇｒａｍｓｏｆｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔｐｌａｓｍｉｄｐＹＭＩＫＰ—ＸＩａｎｄｐＹＩＰ－１０７一ＸＩ２．４酵母转化和转化子验证分别以ｔｔｐａＩ、ＳｔｕＩ对ｐＹＭＩＫＰ．ＸＩ和ｐＹＩＰ．１０７．ＸＩ线性化，转化酵母工业菌株ＮＡＮ．２７．根据Ｇ４１８对ＮＡＮ．２７最低抑菌浓度测试结果∽１，用４００肚ｇ／ｍＬＧ４１８的ＹＰＤ筛选转化子．分别随机挑取上述两种质粒的酿酒酵母转化子若干，以染色体为模板，ＰＣＲ检测ｘｙｌＡ基因，所有被测转化子均得到ｘｙｌＡ特异性带，表明外源基因整合于酵母基因组上．Ｇ４１８抗性的验证：提高Ｇ４１８质量浓度至６００ｔ－ｇ／ｍＬ，对转化子进一步验证，所有被测转化子均表现出良好的Ｇ４１８抗性表型（图４），但在这个浓度下两种类型的转化子的生长状态没有明显区别．图４转化子Ｇ４１８抗性表型Ｆｉｇ．４ＣｏｍｐａｒｉｓｉｏｎｏｆＧ４１８ｒｅｓｉｓｔａｎｃｅｂｅｔｗｅｅｎｈｏｓｔｓｔｒａｉｎａｎｄｐａｒｔｉａｌｔｒａｎｓｆｏｒｍａｎｔｓ（Ａ），ＹＰＤ；（Ｂ），６００肛ｇ／ｍＬＧ４１８ＹＰＤ；１，２，３，Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅｔｒａｎｓｆｏｒｍａｎｔｓ；４，Ｐａｒｅｎｔａｌｓｔｒａｉｎ．青霉素酶活力测定：挑取单菌落较大的高拷贝和低拷贝转化子分别定名为ＸＨ３４和ＸＬ２６．对ＸＨ３４和ＸＬ２６青霉素酶透明圈的测定结果见图５．图５显示：与对照菌株不同，转化子ＸＨ３４和ＸＬ２６均出现明显的透明圈，而且ＸＨ３４透明圈明显大于ＸＬ２６，表明ＸＨ３４插入外源基因的拷贝数的确高于ＸＬ２６．这一方法在美国普度大学ＨｏＮＷ实验室已是筛选高表达量转化子的常规手段ｎ２卅３｜．图５酵母转化子青霉素酶活力测定Ｆｉｇ．５ＤｅｔｅｃｔｉｏｎｏｆｐｅｎｉｃｉｌｌｉｎａｓｅｐｒｏｄｃｅｄｂｙＳ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅｔｒａｎｓｆｏｒｍａｎｔｓ１，Ｐａｒｅｎｔａｌｓｔｒａｉｎ；２，Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅｔｒａｎｓｆｏｒｍａｎｔＸＨ３４；３，Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅｔｒａｎｓｆｏｒｍａｎｔＸＬ２６２．５转化子的稳定性测定将高拷贝转化子ＸＨ３４，接种到ＹＰＤ液体培养基即在非选择性压力下摇瓶培养５０世代（每２４ｈ为ｌｏ世代）．每隔１０世代，平板计数菌落数进行稳定性测定按公式（１）计算（结果见图６），结果显示５０世代后的稳定性为９９．７２％，表明在非选择性压力下，整合于酿酒酵母染色体上的外源片断具有良好的遗传稳定性，能适合用于工业生产的粗放环境．万方数据第３期刘向勇，等：。

酿酒酵母代谢木糖工程菌的构建汤斌;张风琴;汤文晶;丁丽霞【期刊名称】《食品与发酵工业》【年(卷),期】2011(037)011【摘要】通过PCR方法从休哈塔假丝酵母基因组DNA中克隆得到木糖还原酶（XR）基因XYL1和木糖醇脱氢酶（XDH）基因XYL2,将其分别连接到酵母表达载体pYES2上,得到重组表达载体pYES2-XYL1和pYES2-XYL2,从pYES2-XYL1上克隆得到含半乳糖启动子的XYL1,将其连接到pYES2-XYL2序列的下游,得到重组表达载体pYES2-XYL1-XYL2,通过电转化方法将pYES2-XYL1-XYL2转入酿酒酵母宿主菌INVSc1。

在初始pH为5.5,温度为33℃,前5h转速为150r/min,后变为50r/min的条件下,乙醇产量为33.45g/L。

【总页数】5页(P16-20)【作者】汤斌;张风琴;汤文晶;丁丽霞【作者单位】安徽工程大学微生物发酵安徽省工程技术研究中心,安徽芜湖241000;安徽工程大学微生物发酵安徽省工程技术研究中心,安徽芜湖241000;安徽工程大学微生物发酵安徽省工程技术研究中心,安徽芜湖241000;安徽工程大学微生物发酵安徽省工程技术研究中心,安徽芜湖241000【正文语种】中文【中图分类】TS261.11【相关文献】1.用于钝齿棒杆菌木糖代谢途径研究的基因工程菌构建 [J], 张凤琴;刘俊;陈小举;晏娟;2.用于钝齿棒杆菌木糖代谢途径研究的基因工程菌构建 [J], 张凤琴;刘俊;陈小举;晏娟3.利用不同启动子控制木糖代谢关键酶基因构建可共代谢葡萄糖木糖重组酿酒酵母[J], 金怡;王震;莫春玲;杨秀山;田沈4.代谢木糖产乙醇的酿酒酵母工程菌研究进展 [J], 张金鑫;田沈;刘继开;张亚珍;杨秀山5.稳定代谢葡萄糖和木糖产乙醇的重组酿酒酵母工程菌初步构建 [J], 杨忞;张金鑫;田沈因版权原因，仅展示原文概要，查看原文内容请购买。