酿酒酵母INO1基因的克隆

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乙醇脱氢酶Ⅰ基因敲除的酿酒酵母重组菌构建的初步研究

从啤酒厂发酵生产啤酒的工艺角度来看，发酵５ｄ时，正是各项检测指标值比较高的时期，尤其是乙醛含量，这说明，本实验通过基因敲除得到的转化子可以满足工厂发酵的需要。
参考文献：
Ｍ为分子量标准（ＤＬ２０００，天为时代）；泳道ｌ和２均为扩增的样品
分子量为１０２３ｂｐ。
图４
以ＨｙＢｌ和Ｈ［ｙＢ２为引物扩增转化酵母基因组结果
筛选抗性菌落。结果显示（图３），有部分菌株可以在含有潮霉素的平板上生长，表明其体内含有潮霉素抗性，
而在空白对照平板上（未涂有１００ｐｇ，ｍｌ潮霉素）没有菌落生成。
利用酵母基因组提取试剂盒，提取转化后酵母及野生酵母的基因组ＤＮＡ，以ＨｙＢｌ和ＨｙＢ２引物进行ＰＣＲ扩增。结果发现（图４），在酵母基因组上，扩增出本实验所需要的片段１０２６ｂｐ，说明外源基因已经整合到酵母基因组上。２．５发酵实验
酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)做为传统的乙醇生产菌株，具有乙醇耐受性强，发酵工艺成熟，工业应用范围广泛，与其它微生物比较生物安全性好等特点。同时，酿酒酵母是第一个基因组完成测序的真核生物，遗传背景非常清楚，由于其体内具有高效的同源重组机制，在分子和基因水平
进行操作非常容易。在实际工业生产中，为了降低发酵工艺成本、实现高效的转化率和产出率，菌种的优劣在整个生产流程中尤为重要。因此，菌种的选育必须以降低生产耗资与高产出为原则。近年来，依据代谢工程理念，应用分子生物学手段对酿酒酵母进行分子育种是主要的研究方向，其中，尤为突出的是重组DNA技术。应用代谢工程理念使用基因工程手段对菌种改造过程中，敲除或过表达特定基因可以阐明该基因功能，改变代谢途径，从而提高目标产物产量。同时，该突变株为进一步探索目的基因的转录调控机制、基因与蛋白质相互作用以及分子信号传导通路等提供了理想材料，并为进一步从基因和分子水平改进酿酒酵母乙醇代谢途径，构建优良性状高产乙醇生产菌奠定了基础。本研究利用酿酒酵母细胞内的同源重组机制，运用基因敲除和过表达技术，降低了由乙醛生成乙酸的分解代谢流，并在此基础上增强了己糖代谢率。与原始出发菌株相比，不仅提高了乙醇产量，而且缩短了发酵周期，提高了发酵产率。研究内容如下：

一株产核酸酿酒酵母工程菌及其构建方法与应用

一株产核酸酿酒酵母工程菌及其构建方法与应用
一株产核酸酿酒酵母工程菌是指经过基因工程技术改造的酿酒酵母菌株，具有高产核酸能力的微生物。

以下是一种构建该菌株的方法和应用：
构建方法：
1. 选择合适的酿酒酵母菌株作为基础菌株。

2. 通过PCR或其他基因克隆技术，获得目标基因（例如核酸
合成酶基因）的DNA序列。

3. 将目标基因与适当的表达载体连接。

4. 将表达载体转化到酿酒酵母菌细胞中。

5. 通过筛选、鉴定等方法，获得具有目标基因表达的酿酒酵母菌株。

应用：
1. 高产核酸酿酒酵母工程菌可用于生产核酸药物，如核酸疫苗、抗肿瘤药物等。

2. 该菌株还可用于生物反应器中进行大规模生产核酸。

3. 可通过进一步改造该菌株，使其具备其他有益特性，如耐高温、耐久性等，进一步拓展其应用领域。

4. 该菌株也可用于基础科学研究，探索核酸生物学、基因调控等领域。

酿酒酵母基因组进化的研究进展

由于细胞代谢和调控网络的复杂性，尤其是对于多基因调控的复杂性状和遗传工具有限的生物系统而言，基因组进化在微生物细胞工厂的构建中起着至关重要的作用。

基因组进化通过人为创造多样化性状以及功能筛选的迭代循环，在实验室中模拟且加速自然进化的过程，从而快速获得满足目标需求的进化突变体。

酿酒酵母是代谢工程中重要的底盘细胞，全基因组进化是对其进行系统性改造的最有效合成生物学手段之一。

本文总结了基因组进化在构建高效的酿酒酵母细胞工厂中的技术进展和应用，包括基因组改组、转座子插入诱变和全局转录机制工程（gTME）等基于随机突变的非理性基因组进化以及诸如酵母寡核苷酸介导的基因组工程（YOGE），真核基因组多重位点自动改造技术（eMAGE）、RNAi辅助的基因组进化方法（RAGE）以及基于CRISPR体系的基因组规模改造技术（CHAnGE、MAGIC和MAGESTIC）等可示踪的半理性基因组进化，并简要介绍了基因组进化面临的挑战和高通量筛选方法的发展前景。

由于对能源安全、可持续性发展和全球变暖的日益担忧，利用微生物细胞工厂将可再生资源转化为燃料和化学品是目前国内外研究的一大热点。

通过自下而上或自上而下的工程策略，深入了解生物网络对于构建有实际应用价值的“微生物细胞工厂”至关重要。

此外，系统生物学和合成生物学的最新进展使人们对生物系统有了更深的理解，能够做出更具预测性的工程设计。

然而，由于生物系统的复杂性，诸如胁迫耐受性等受到多基因调控的复杂表型，单基因理性改造方法很难实现预定的目标。

为了克服这一主要限制，越来越多的研究人员将目标转向一种强大的多功能工具——基因组进化，以构建满足工业生产需求的微生物细胞工厂。

酿酒酵母是第一个被完全测序的真核细胞，其分子生物学和细胞生物学研究最为透彻。

与原核生物不同，酿酒酵母含多种细胞器，能够为生物合成提供不同的环境。

此外，酿酒酵母是公认安全的模式生物，遗传操作简单，并且对恶劣的工业条件表现出很高的耐受性，适合大规模生产，因此在生物技术领域得到了广泛应用。

酿酒酵母高效自主复制区的筛选与鉴定

酿酒酵母高效自主复制区的筛选与鉴定沈方琳;黄双成;侯朋晨;耿安丽;阮文权【摘要】在酵母表达过程中,传统的表达载体存在着拷贝数低以及稳定性差的缺点.因此,找到一个可用于构建复制整合型载体的高效酵母自动复制区(Autonomously Replicating Sequence,ARS)是解决问题的关键.研究中,从酿酒酵母基因组中扩增得到4种不同的ARS(ARS304、ARS315、ARS735、ARS1512),然后连接到整合载体pNTS2K中,得到4种复制整合型载体(pNTS2K-ARS304、pNTS2K-ARS315、pNTS2K-ARS735、pNTS2 K-ARS1512).经电转化后,4种转化子(36a(pNTS2 K-ARS304)、36a(pNTS2K-ARS315)、36a(pNTS2K-ARS735)、36a(pNTS2K-ARS1512))都能在含有300 μg/mL G418的YPD平板上生长.然而,只有转化子36a(pNTS2K-ARS315)能在含有500 μg/mL G418的YPD液体培养基里较快生长.经过G418耐受性检测后,36a(pNTS2K-ARS315)仍能在含有1 mg/mL G418的YPD培养基中很好地生长.此外,通过质粒pNTS2 K-A RS315表达荧光蛋白,其表达效果高于普通商业质粒.实验结果证明,4种复制区都能在酿酒酵母中独立自主复制,其中ARS315复制能力最强.因此,ARS315可用于构建高拷贝且稳定的重组质粒,为构建高表达且稳定的工程酵母菌株奠定了基础.%In the case of yeast expression,low-copy number of transformed genes and low stability are disadvantages of the conventional types of expressionvectors.Therefore,finding a high effective Saccharomyces cerevisiae autonomously replicative sequence (ARS) that can be used for construction of replicative/integrated plasmid is significantly important.In this study,four different ARSs (ARS304,ARS315,ARS735,and ARS1512) were amplified from Saccharomyces cerevisiae and inserted into integratedyeast vector pNTS2K and four plasmids pNTS2K-ARS304,pNTS2K-ARS315,pNTS2K-ARS735,pNTS2K-ARS1512 were obtained.All the four plasmids were successfully transformed into S.cerevisiae and all transformants were able to grow on YPD plate containing 300 μg/mL ofG418.However,only transformant containing plasmid pNTS2K-ARS315 was able to grow well in the YPD medium containing 500 μg/mL of G418.After G418 tolerance detection,36a (pNTS2K-ARS315) still could grow well in YPD medium containing 1 mg/mL of G418.Furthermore,the expression of the fluorescent protein by the plasmid pNTS2K-ARS 315 was higher than that by the ordinary commercial plasmid.It can be concluded that all of the four ARSs functioned and the ARS315 had the highest replicate ability in S.cerevisiae.Consequently,ARS315 can be potentially used for high expression and stable recombinant strain construction and metabolic engineering of S.cerevisiae.【期刊名称】《食品与发酵工业》【年(卷),期】2017(043)003【总页数】6页(P20-25)【关键词】酿酒酵母;自动复制区;高拷贝复制整合型质粒;荧光蛋白【作者】沈方琳;黄双成;侯朋晨;耿安丽;阮文权【作者单位】江南大学环境与土木工程学院,江苏无锡,214122;江苏省厌氧生物技术重点实验室,江苏无锡,214122;义安理工学院,生命科学与化学技术实验室,新加坡;义安理工学院,生命科学与化学技术实验室,新加坡;义安理工学院,生命科学与化学技术实验室,新加坡;江南大学环境与土木工程学院,江苏无锡,214122;江苏省厌氧生物技术重点实验室,江苏无锡,214122【正文语种】中文在酵母表达蛋白以及其他有机产物的过程中，通过增强转化过程中的酶活性来加快产物生成是研究者公认的观点，而高表达特异性酶是解决问题的主要途径。

人生长激素基因在酿酒酵母中的同源重组及初步鉴定

482 0 引言
医学研究生学报
2004 年 6 月
第 17 卷
人生长激素( human growth hormone,HGH) 是由人脑垂体前叶分泌的多肽类激素, 它广泛用于抗衰老和治疗骨质疏松症、侏儒症、心血管疾病以及创伤组织修复等。通过 DNA 技术获得重组 hGH 倍受青睐。目前, hGH 有大肠杆菌表达系统、 Bac - to - Bac 杆状病毒系统、酿酒酵母表达系统等, 但大肠杆菌存在内毒素, 病毒载体易在染色体发生随机整合, 而酿酒酵母则存在分泌量不足等问题。这些都限制了治疗性重组 hGH 的获得, 也使其不能直接应用于消化道基因治疗。尽管对酿酒酵母表达载体采取增加信号肽或分泌增强子等措施, 能在一定程度上解决酿酒酵母分泌问题, 但在无选择压力下附加型质粒易丢失, 仍然不适于大规模应用。然而利用整合型载体将目的基因整合至酵母基因组上, 使其随酵母染色体一起复制, 这样获得的菌体稳定性好, 有利于目的基因的长期稳定地表达。本课题即期望借助 hGH 在酿酒酵母的同源重组, 通过消化道途径补充 hGH 。mTn - 3 HA/ lacZ ( U54828) 转座系统, 为 [1] Macdonald 等于 1997 年建立起了一种多功能小型转座体系。它可同时用于分析基因表达、蛋白的亚细胞结构定位、无意义突变表型、附加表位等位基因以及任何给定酿酒酵母基因诱变的分析等, 具有四环素抗性 r ( tet ) 细菌筛选标记, 尿嘧啶缺陷型( URA 3) 的酵母筛选标记, lacZ 基因的表达可判断上游启动子情况, 进行同源重组方便快捷。 1 材料和方法
mol/ L LiAC, 40% PEG4000, 100 mol/ L -ME) , 以不同浓度载体转化酵母 , 在营养缺陷型 SC -Ura平板上铺板, 30 培养 4 天左右, 能在平板上长出的白色菌落可能为发生了同源重组的阳性重组子。 1 2 4 酵母菌落 PCR 初步鉴定阳性重组子上游引物 5- ATCGGGCTGCTCTACTGCTTCA- 3 , 下游引物 5- ACTTCTTCCGCCGCCTGCTT - 3 , 反应体系按酵母遗传学方法实验指南 [ 5] 。反应条件为: 94 变性 45 s, 60 退火 45 s, 72 延伸 1 min 15 s, 扩增 35 个循环。 1 2 5 lacZ 显色反应将 SC -Ura 平板中初步筛选出的克隆挑选出来 , 铺片于 YPAD 平板 ( 100 个铺片 / 板 ) , 以无菌滤纸将上述平板复制于另一 SC -Ura 平板上 , 37 过夜 ( 对于 ade2 菌株 , 尚需加入 80 mg/ L 的 adenine) , 取出滤纸 , 克隆面朝上 , 置于一密闭容器内, 以 10 ml 氯仿薰约 10~ 30 min, 取出滤纸, 克隆面朝上 , 置于另一 X -Gal 平板[ 5] , 30 培养 2 天显色。查找 X -Gal 的阳性克隆 , 并从 YPAD 平板上重新挑取单克隆于 SC - Ura 平板上 , 划线培养, 并找出 lacZ 表达最强菌株所对应的质粒 , 转化大肠杆菌 DH5 , 大规模培养保存质粒。 e results of PCR and identification of constructed li brary plasmids

酿酒酵母NHX1基因克隆与烟草表达分析

ＣｌｎｎｆＮＨＸ１ＧｅｅｆｏＳｃｈｒｍｙｅｅｅｉｉｎｔｔｒｌｇｕｓｏｉｇｏｎｒｍａｃａｏｃｓｃｒｖｓａａｄｉｓＨｅｅｏｏｏＥｘｒｓｉｎｉｂａｃｐｅｓｏＴｏｃｏｎ
ｎｅｌｉａｄｒａｔｅＰＣＲａｙｓｓＴｈｅｕｌｓｏｈｍｉａｏｔｎｓａｏｉｒｅｈａｍｎａｌｉ￣ｅｒｓｔｆｃｅｃｌｃｎｅｔａｓｙｓｃｎｆｍｄｔｔＮＨＸ１ｇｎａｅｘｒｓｅｅｅｈｄｂｅｎｅｐｅｓｄｅｅｔｅｙｉｈｏｉｅｏａｃＴｈｔｓｉｆｃｉｌｔｅｍｄｆｄｔｂｃｏ．ｅｐｏａｓｕｍｏｅｅｔｂｃｏｌａｏｆａｓｏａｔＴｌｅｅａｉｎｈｄｉ — ｖｎｉｃｎｔｎｔｎｔａｃｅｆｔｎｆｒｎｎｒｔｏａｎｉｈａｒｍｇｃｅｓｄａｏｔ３ｒａｅｂｕ０％ａｄｔｕｇｒｃｎｔｎｎｔｅｌａｗａｅｕｅｉｎｆｃｔｙ．ｔｉｉａｅｈｔｎｓａｏｅｔｉｅｆｓｒｄｃｄｓｇｉａｌＩｈｅｈｉｎｎｄｃｔｄｔａＮＨＸ１ｇｎａｅｅｅｈｄｔｈｆｃｉｆＫ＋ｐｔｋ．ｕｎｔｏｎｏｕａｅＫｅｗｏｄＳａｃａｏｃｓｃｒｖｓａＮＨＸ１Ｔｒｎｓｅｉｏｂｃｏｌ＋ｃｎｔｎｔｙｒｓｃｈｒｍｙｅｅｅｉｉ，，ａｇｎｃｔａｃ，（ｏｅ

酿酒酵母代谢木糖工程菌的构建

酿酒酵母是一种常见的微生物，具有将糖类转化为酒精和二氧化碳的能力，因此被广泛用于酿酒和制作面包等食品。

但是，传统的酿酒酵母只能利用葡萄糖、果糖等简单的糖类，而不能利用木糖。

因此，为了提高酿酒酵母的利用率和产率，需要构建能够代谢木糖的工程菌。

构建酿酒酵母代谢木糖工程菌的方法包括以下步骤：
1.筛选能够利用木糖的菌株：从自然界或实验室保存的菌种库中筛选出能够利用木糖的菌株，并进行鉴定和筛选，选择具有较高木糖利用率的菌株。

2.克隆木糖代谢相关基因：从能够利用木糖的微生物中克隆出木糖代谢相关基因，并将其转移到酿酒酵母中。

3.构建工程菌：通过基因工程技术将木糖代谢相关基因插入酿酒酵母的染色体或质粒中，并筛选出具有木糖代谢能力的工程菌。

4.鉴定和筛选：对构建的工程菌进行鉴定和筛选，选择具有较高木糖利用率和产率的工程菌。

在构建酿酒酵母代谢木糖工程菌的过程中，需要注意以下几点：
1.选择具有较高木糖利用率的菌株，以保证工程菌具有较高的产率和利用率。

2.选择适当的基因工程技术，以保证基因的表达和调控。

3.注意工程菌的安全性和稳定性，以保证生产过程中的安全和稳定。

总之，构建酿酒酵母代谢木糖工程菌可以提高酿酒酵母的利用率和产率，具有重要的应用价值和研究意义。

酿酒酵母蔗糖酶基因的克隆、异源表达及重组酶学性质研究

Ｒｉｂ。 — ｏ
（．西大学生命科学与技术学院，１广广西南宁５００；．３０４２广西科学院，广西南宁５００）３０７
（１．ＣｏｌｇｏＬｉＳｃｅｅｎｄｌｅｆｆｅｅｉｎｃａＴｅｈｎｌｇｃｏｏｙ，ＧｕｎｘｉａｇＵｎｉｅｓｔｖｒｉｙ，Ｎａｎｉｎｎｇ，ａｇ，５３０４，Ｇｕｎｘｉ００
ｐｏｅｎｗａｕｉｉｄｙｉｒｔｉｓｐｒｆｅｂｍｍｏｉｚｄｂｌｅｍｅａｆｉｔｈｏｔｇｒｐｉｔｌａｆｎｉｙｃｒｍａｏａｈｙ．ＩｗａｒｓｎｔｄａｉｇｅｔｓｐｅｅｅｓａｓｎｌｐｏｅｎｂｎｎＤＳ— ｒｔｉａｄｏＳＰＡＧＥｔｌｃｌｒｗｉｈｍｏｅｕａｗｅｇｏｋＤ．Ｔｈｅｏｂｎｎｎｙｆｌｉｈｔｆ６０ｅｒｃｍｉａｔｅｚｍｅｏｌｏｗｅｄ
维普资讯
广西科学ＧｕｎｘＳｉｃｓ０８１（）１４８ａｇｉｃｎｅ０，５２：８～１８ｅ２
酿酒酵母蔗糖酶基因的克隆、源表达及重组酶学性质异
研究
Ｃｌｎｉｎｇ，ｐｅｓｏｎｄＣｈａａｔｒｚｔｏｆＧｅｅｏＥｘｒｓｉｎａｒｃｅｉａｉｎｏｎ
Ｃｈｎ；．ａｇｉａｅｙｏｃｅｃｓＮａｎｎＧｕｎｘ，３０７Ｃｈｎ）ｉａ２ＧｕｎｘＡｃｄｍｆｉｅ，ｎｉｇ，ａｇｉ５００，ｉａＳｎ

基因克隆与构建酵母菌表面展示系统的步骤

基因克隆与构建酵母菌表面展示系统的步骤基因克隆和构建酵母菌表面展示系统是生物学和生物工程领域中常用的实验技术。

通过这些步骤，可以将目标蛋白质在酵母菌表面进行展示，从而实现对蛋白质结构和功能的研究。

以下是基因克隆和构建酵母菌表面展示系统的典型步骤：1. 选择合适的表达载体和宿主酵母菌：根据实验需求，选择适合的表达载体和酵母菌，常用的酵母菌包括酿酒酵母（Saccharomyces cerevisiae）和毕赤酵母（Pichia pastoris）等。

2. 获得目标基因的DNA序列：通过PCR扩增、基因合成、酶切等方法，获得目标基因的DNA序列。

3. 克隆目标基因到表达载体：将目标基因与适当的表达载体连接，常用的连接方法包括限制性内切酶切割与连接、热力连接、基因克隆等。

4. 转化酵母菌宿主：将表达载体与目标基因连接后的DNA构建物转化到目标酵母菌宿主中。

5. 筛选阳性克隆：采用适当的筛选方法，如抗生素抗性或基因报告系统，筛选转化后的酵母菌，确保含有目标基因的阳性克隆。

6. 验证基因表达：通过Western blot、ELISA等方法，验证目标基因的表达水平和蛋白质的产量。

7. 酵母菌的培养和表达：将阳性克隆的酵母菌进行液体培养，通过适当的诱导条件，促使目标蛋白质在酵母菌表面进行展示。

8. 验证酵母菌表面展示效果：通过流式细胞仪、酶活性测定等方法，验证酵母菌表面展示的目标蛋白质的外露情况和活性。

9. 进一步利用和研究：根据实验需求，对展示的目标蛋白质进一步利用和研究，如结构分析、功能研究等。

总结：基因克隆和构建酵母菌表面展示系统是一项重要的实验技术，能够实现对目标蛋白质的展示和研究。

通过选择合适的表达载体和酵母菌宿主，克隆目标基因到表达载体，转化酵母菌宿主并筛选阳性克隆，验证基因表达和酵母菌的培养和表达，最终实现目标蛋白质在酵母菌表面的展示。

这一技术在生物学和生物工程领域有着广泛的应用，可以帮助科研人员更好地研究和利用蛋白质。

酵母菌表面展示操作步骤之基因克隆与构建

酵母菌表面展示操作步骤之基因克隆与构建酵母菌表面展示技术是一种广泛应用于蛋白质工程和生物药物研发领域的技术。

它通过将目标蛋白质的编码基因插入酵母菌表面展示载体中，使得酵母菌能够在外界环境中表达和展示该蛋白质，并且能够通过酵母菌表面展示载体的特定信号传导机制，将目标蛋白质定向地展示在酵母菌表面。

本文将介绍酵母菌表面展示操作中的基因克隆与构建步骤。

基因克隆是酵母菌表面展示操作的第一步，它包括了目标蛋白质基因的扩增、酶切、连接和转化等过程。

首先，需要通过PCR方法扩增目标蛋白质基因序列。

根据已知的目标蛋白质序列，设计引物并进行PCR扩增。

扩增得到的产物将带有酶切位点。

接下来，使用相应的限制性内切酶对扩增产物进行酶切。

选择适当的酶切位点，将目标蛋白质基因序列切割成需要的片段。

然后，将酶切后的目标蛋白质基因片段与表达载体进行连接。

表达载体通常是一个环状的质粒，其中含有所需的基因调控元件和表达元件。

使用DNA连接酶将酶切后的目标蛋白质基因片段连接到表达载体上。

经过连接后，将连接产物进行转化。

将连接产物与酵母菌进行共转化，使得表达载体能够进入酵母菌细胞，并在酵母菌中稳定复制。

经过基因克隆步骤，即完成了酵母菌表面展示操作的基本构建工作。

下一步将对构建完成的酵母菌细胞进行筛选和鉴定。

可以通过选择性培养基的筛选来鉴定含有目标蛋白质基因的酵母菌细胞。

将转化后的酵母菌细胞接种于含有相应选择性抗生素的培养基中，通过抗生素的抑制作用，筛选出带有目标蛋白质基因的酵母菌细胞。

同时，也可以通过PCR、Western blot等方法对酵母菌细胞进行鉴定。

通过PCR可以验证目标蛋白质基因是否被成功地插入到酵母菌细胞的基因组中；通过Western blot可以检测目标蛋白质在酵母菌细胞中的表达情况。

最后，经过筛选和鉴定后的酵母菌细胞即可用于表面展示实验。

将筛选出的酵母菌细胞培养并收获细胞，通过洗涤和离心等操作，去除培养基和杂质。

通过以上步骤，我们完成了酵母菌表面展示操作中的基因克隆与构建工作。

酿酒酵母基因编辑的主要技术成果探究

国内外监管政策对比分析
国内监管政策
介绍中国针对基因编辑酿酒酵母的监管政策，包括审批流程、安全性评估要求等。
国外监管政策
概述国外主要国家和地区对基因编辑酿酒酵母的监管政策，如美国、欧盟等。
对比分析
对国内外监管政策进行对比分析，探讨其异同点及可能的原因。
未来发展趋势预测
技术发展趋势
预测基因编辑技术在酿酒酵母领域的发展趋势，包括更高效、更精准的编辑方法等。
记等。
Hale Waihona Puke 基因编辑工具准备基因编辑所需的工具，如 CRISPR-Cas9系统、TALENs或ZFNs 等。
培养基和试剂
准备适合酿酒酵母生长的培养基和试剂，如YPD培养基、抗生素等。
基因敲除实验流程示例
设计sgRNA
根据靶标基因序列，设计特异性的sgRNA，并构建到CRISPR-Cas9载体上。
转化酿酒酵母
TALENs技术已成功应用于多种细胞类型的基因编辑，包括酿酒酵母。
其他新兴基因编辑方法
Base editing技术
该技术可在不切割DNA双链的情况下实现单碱基替换，为酿酒酵母基因编辑提供了新的思路。
Prime editing技术
该技术结合了CRISPR-Cas9和逆转录酶的功能，可实现更精确的基因编辑。
监管政策趋势
分析未来国内外监管政策的可能变化，如审批流程的简化、安全性评估标准的更新等。
市场应用前景
探讨基因编辑酿酒酵母在市场应用方面的前景，如其在食品、医药等领域的潜在应用价值。
06
挑战、争议及前景展望
技术挑战与局限性分析
基因编辑效率
酿酒酵母基因编辑效率受到多种因素影响，如基因位置、编辑方法、细胞状态等，提高编辑效率是技术面临的重要挑战。

基于合成基因和酿酒酵母同源重组机制的分子克隆方法[发明专利]

(19)中华人民共和国国家知识产权局(12)发明专利申请(10)申请公布号 (43)申请公布日 (21)申请号 202010983909.9(22)申请日 2020.09.18(71)申请人中国科学院深圳先进技术研究院地址 518000 广东省深圳市南山区深圳大学城学苑大道1068号(72)发明人戴俊彪　姜双英　唐园玮　(74)专利代理机构深圳中一联合知识产权代理有限公司 44414代理人郝文婷(51)Int.Cl.C12N 15/81(2006.01)C12N 15/65(2006.01)C12R 1/865(2006.01)(54)发明名称基于合成基因和酿酒酵母同源重组机制的分子克隆方法(57)摘要本申请提供了一种结合基因合成和酿酒酵母内源同源重组系统的分子克隆方法，不受限于序列改变的类型(删除、突变或者插入)和复杂度，仅涉及简单的体外分子克隆操作，利用两端带有同源臂的合成序列与酵母同源重组实现原载体的无缝修改，可实现4‑150kbp穿梭质粒上多个不连续DNA区段的同步改造和多种版本的批量构建，操作简单，构建效率较高，构建成功率较高，使得本发明适用于多版本、高通量的无缝克隆操作。

权利要求书2页说明书17页序列表4页附图7页CN 112175984 A 2021.01.05C N 112175984A1.一种基于合成基因和酿酒酵母同源重组机制的分子克隆方法，其特征在于，所述分子克隆方法包括如下步骤：提供待修改载体，将所述待修改载体进行序列比对，确定所述待修改载体的修改区域及替换所述修改区域的标记基因；设计所述标记基因的第一同源臂引物序列并扩增得到所述标记基因片段，将所述标记基因片段与所述待修改载体共转化至野生型酿酒酵母细胞，筛选得到含有第一质粒前体的酿酒酵母细胞，其中，所述第一质粒前体包括所述标记基因；合成带有同源臂的供体序列并进行线性化处理得到线性化的供体序列，将所述线性化的供体序列转化至所述含有第一质粒前体的酿酒酵母细胞，筛选得到含有供体序列质粒的目的酿酒酵母细胞。

本土酿酒酵母低温耐受性主效QTL的定位及克隆鉴定

本土酿酒酵母低温耐受性主效QTL的定位及克隆鉴定葡萄酒低温发酵是提高葡萄酒品质、丰富葡萄酒香气的重要手段,已成为现代葡萄酒工艺革新的研究热点。

低温发酵能否顺利进行,主要取决于酿酒酵母的低温耐受性。

因此,研究酿酒酵母低温耐受性的遗传基础,对优良耐低温酿酒酵母的筛选、遗传改良和应用,提高葡萄酒品质,提升我国葡萄酒的竞争力具有重要意义。

本研究以我国本土酿酒酵母为研究对象,利用全基因组测序技术与分离群体分组分析（BSA）相结合的QTL定位方法,对酿酒酵母低温耐受性的主效QTL进行定位,并通过相互半合子分析（RHA）、序列多态性分析以及等位基因替换等方法对主效基因进行鉴定。

主要研究结果如下:1.通过分析来自我国5个主要葡萄酒产区的68株本土酿酒酵母在低温下（16℃、12℃、8℃、4℃）的发酵能力和生长状况,研究本土酿酒酵母的低温耐受能力。

结果显示:在各温度下,酿酒酵母的最大比生长速率基本遵循正态分布,而且随着温度的降低,酵母的生长逐渐受到抑制,最大比生长速率大幅度降低,菌株之间的差异也越来越大,同时菌株的发酵能力也随着温度的降低而降低。

Wb-3-40、ZX11、ZX13相比其他菌株生长状况优良,产气较快,低温耐受能力较强;而菌株31y3、NX9412、112y4在低温条件下生长状况较差,产气较慢,发酵受到了严重抑制,其耐低温能力较弱。

这些菌株可作为后续低温耐受性遗传基础研究的出发材料。

2.利用Cre-loxP重组系统敲除6株低温耐受表型差异显著的二倍体酿酒酵母的HO基因,分离其单倍体,筛选表型极端的单倍体菌株,并对其进行营养缺陷型改造。

结果显示:通过表型筛选,获得两株表型差异极端的单倍体菌株ZX11（6）（MATα,hoΔ）和NX9412（4）（MATa,hoΔ）,在4℃下的最大比生长速率分别为0.0143和0.0025,作为杂交的耐受亲本和敏感亲本;成功构建亲本的营养缺陷型菌株ZX11（6）（MATα,hoΔ,ura3::KanMX4）和NX9412（4）（MATa,ho Δ,ura3::KanMX4,lys2::URA3）,二者分别具有稳定的尿嘧啶、赖氨酸营养缺陷遗传性状,且低温耐受性与原始菌株无显著差异。

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酿酒酵母INO1基因的克隆黄贞杰1,2,3，叶冰莹1,2,3，陈由强1,2,3★（1.福建师范大学生命科学学院，福建福州350108；2.农业部甘蔗遗传改良重点开放实验室，福建福州350108；3.发育与神经生物学福建省高等学校重点实验室，福建福州350108）摘要利用PCR扩增技术，以酿酒酵母S288C的基因组DNA为模板，扩增得到酿酒酵母的结构基因，大小为1537bp的序列。

利用NCBI对此序列进行比对，发现此序列与酿酒酵母S288C的催化葡萄糖-6-磷酸生成肌醇-3-磷酸的肌醇-3-磷酸合成酶的编码基因INO1的第41到1577位序列有100％的同源性，而INO1的完整CDS是1602bp。

由此可见克隆得到的结构基因是酿酒酵母S288C的肌醇-3-磷酸合成酶的编码基因INO1，但不是全长。

关键词INO1;酿酒酵母；基因克隆Cloning of INO1 Gene from Saccharomyces cerevisiae S288C Abstract The Saccharomyces cerevisiae inositol-3-phosphate synthase encodes gene( INO1) is amplified from a genomic DNA of S.ce s288c by PCR. sequence amplified size is 1537bp.It have 100% homology with INO1 gene complete sequence from 41 to 1577 had reported. but not complete cds.Keywords INO1 ;Saccharomyces cerevisiae ;cloning of gene0 引言随着石油能源日益耗竭，国内外许多科学家开始研究利用生物质生产燃料乙醇。

乙醇被公认为不仅是一种可以代替汽油的优良液体燃料，而且是很好的燃油品质改善剂。

利用非粮生物质原料生产燃料乙醇对于我国现状来说将成为一项迫切、具有重要现实意义的任务。

利用甘蔗生成燃料乙醇可以充分弥补利用粮食作为原材料的不足，巴西利用甘蔗生产燃料酒精的成功充分说明了这一点。

然而,发酵终点高浓度的乙醇对酵母细胞生长和乙醇发酵具有强烈抑制作用,而提高酵母菌的乙醇耐受性可以保证酵母菌发酵过程中较好的细胞活性和较高的发酵性能,因此酵母菌的乙醇耐性重新成为世界范围内的研究热点。

采用分子遗传与代谢控制育种的方法筛选高产燃料乙醇的酿酒酵母具有重要的意义。

肌醇对真核生物细胞的生长是必需的。

它不仅是磷脂酰肌醇(PI)合成的前体，而且对磷脂酰肌醇(PI)、磷脂酰胆碱(Pc)和心磷脂(CL)合成有关酶类的表达具有调控作用[1]。

池振明等研究[2]发现，在培养基中添加肌醇在某种程度上可以对耐酒精酵母菌W4的蔗糖酶分泌和细胞的生长起解葡萄糖阻遏的作用。

在乙醇胁迫下，Ino1的表达被证明不可缺少[3],低的肌醇量影响细胞内物质的泄漏，从而影响细胞内PH、H+—ATPase的活性，改变细胞质离子稳态，进而影响膜透性屏障。

高的肌醇量使ATPase的活性提高，抵偿质子流入量，触发改变脂质组成，最终提高乙醇耐受性。

Min-Eui Hong等[4]通过反向代谢工程发现过表达酿酒酵母四个内源基因（INO1, DOG1, HAL1,MSN2）可以促进乙醇的耐性。

而过表达INO1的酵母菌具有最高的乙醇耐性，在高浓度葡萄糖下发酵具有较高的效价和体积产率。

综上，为了进一步提高甘蔗等生物质发酵燃料乙醇的效率，本研究试图通过构建整合表达载体过表达催化葡萄糖6-磷酸生成肌醇-3-磷酸的肌醇-3-磷酸合成酶的编码基因INO1，得到能够耐高乙醇，较强细胞活力，发酵甘蔗汁产较高乙醇量的工程菌株。

本实验首先利用PCR扩增技术，以酿酒酵母S288C的基因组DNA为模板，克隆INO1基因，为下一步在工业酿酒酵母中过表达，构建工程菌株奠定基础。

1 材料和方法1.1实验材料1.1.1菌株和质粒酿酒酵母S288C：大连理工大学生命科学与技术学院惠赠；大肠杆菌DH5α由福建师范大学农业部甘蔗遗传改良重点实验室保存。

pMD-19T克隆载体购于TAKARA公司。

1.1.2培养基和培养条件YPD培养基（g/L）：酵母提取物10 g、葡萄糖20 g、蛋白胨20 g，pH自然，1×105 Pa 灭菌20 min。

培养温度为30 ℃ 200 rpm。

大肠杆菌利用LB培养基，37 ℃，对于转化的细菌培养基中加入100 µg／mL的氨苄青霉素。

1.1.3 试验试剂Ex Taq酶、酵母基因组DNA提取试剂盒购于TAKARA公司，PCR所用引物由上海生工生物工程有限公司合成。

质粒小提取试剂盒（天根生化科技有限公司）； SV Gel and PCR Clean-Up System (Promega)；其他分子生物学试剂均购于TAKARA公司与Sigma公司。

其他生化试剂的配制参照分子克隆实验指南。

1.1.4 主要仪器和设备全自动凝胶成像分析仪（上海培清科技）；2720 Thermal Cycler PCR仪(Applied Biosystems)；DYY26B型稳压稳流电泳仪（北京市六一仪器厂）；GeneQuant pro分光光度计(Amersham Biosciences)；TGL-16M高速台式冷冻离心机（长沙湘仪离心机仪器有限公司）；净化工作台（苏州净化设备有限公司）。

1.2实验方法1.2.1酿酒酵母基因组提取原始酿酒酵母菌株s288c活化后，使用YPD固体培养基进行平皿划线分离得到酿酒酵母菌株s288c单菌落，牙签挑取单菌落接至50 ml YPD液体培养基进行30 ℃摇瓶培养24-30 h，离心去上清；按照Takara公司酿酒酵母基因组DNA提取试剂盒提取基因组DNA。

1.2.2 INO1基因序列扩增根据NCBI上已知的酿酒酵母S288C的肌醇-3-磷酸合成酶编码基因INO1用引物设计软件设计引物，引物序列如下：上游引物5’- TAGTTACCGACAAGTGCACGTACA -3'，下游引物5'-AGTTCGTTTTGAGAAGGCAATCCA -3'以酿酒酵母S288C基因组DNA为模板进行PCR扩增。

反应条件如下：预变性94℃ 5 min，变性94℃30s，退火54℃ 30s,延伸72℃ 97s，30个循环，延长72℃10min保存4℃。

反应结束后取2 uL PCR扩增产物于1％琼脂糖凝胶电泳进行检测。

采用Promega公司的胶回收试剂盒SV Gel and PCR Clean-Up System进行胶回收。

1.2.3 INO1基因克隆1.2.3.1 PCR回收产物的连接与转化取回收后的PCR产物与PMD-19T载体进行连接(表1)。

连接产物采用CaCl2法转化E. coli DH5α感受态细胞。

在含有IPTG与X–gal 的LB/Amp平板上进行蓝白斑筛选。

表1 PMD-19T载体与PCR产物连接体系Table 1The PMD-19T vector and PCR production ligation system反应物体积(μL)Solutio nⅠ(含DNAligase) 5PMD-19T载体 1PCR回收产物 3.5ddH2O 加至10稍离心混匀，16℃连接过夜1.2.3.2 阳性克隆的鉴定与质粒提取挑取白色菌落摇菌，进行菌液PCR检测。

表2 菌液PCR验证Table 2The bacteria liquid PCR for verification反应物体积(μL)10×Ex Taq Buffer 1dNTP (2.5 mmol · L-1) 0.8上游引物(4 μmol · L-1) 0.8下游引物(4 μmol · L-1) 0.8菌液 2Ex Taq酶(5 U/μL) 0.2ddH2O 加至10PCR扩增程序：预变性94℃ 5 min，变性94℃ 30s，退火54℃ 30s,延伸72℃ 97s，30个循环，延长72℃10min保存4℃。

反应结束后取3 μL PCR扩增产物1％琼脂糖凝胶电泳进行检测。

鉴定的阳性克隆用购于天根生化科技有限公司的质粒小提取试剂盒进行少量抽提质粒。

1.2.3.3 阳性克隆质粒测序测序由Takara公司完成，将测得的序列在NCBI上进行BLAST。

2 结果和分析2.1酿酒酵母基因组提取采用Takara公司酿酒酵母基因组DNA提取试剂盒提取基因组DNA。

酿酒酵母s288c基因组电泳检测如图1；大小符合酿酒酵母基因组大小，电泳条带清晰，说明提取得到了完整的酿酒酵母基因组。

图1 酿酒酵母s288c基因组提取Fig.1Genomic DNA extraction from Sacchromyces cerevisiae s288c Lane M：λDNA/HindⅢDNA Marker；Lane 1、2 Genomic DNA of Sacchromyces cerevisiae s288c2.2 INO1基因PCR扩增利用设计的引物通过PCR扩增得到一个大约有1600bp的片断(结果见图2),与预期结果一致。

图2 INO1基因的扩增泳道M：DL2000DNA Marker；泳道1、2：INO1基因PCR扩增产物Fig.2 Amplification of INO1 geneLane M: DL2000DNA Marker; Lane 1、2 : PCR products of Genomic DNA2.3 INO1基因克隆将纯化后的PCR产物与PMD-19T连接，转化E.coli DH5α,筛选到阳性菌落，摇菌,再做菌液PCR（菌液PCR产物的琼脂糖凝胶电泳结果见图3）。

鉴定的阳性克隆用质粒小提取试剂盒进行少量抽提质粒。

进行琼脂糖凝胶电泳验证（见图4）,结果得到一个大约有4300bp 的片断，表明纯化后的PCR产物INO1基因片段与PMD-19T载体正确连接。

将所克隆的 INO1基因进行测序，得到的序列大小1537bp（图5），将测得的序列在NCBI上进行BLAST,结果和所报道的INO1基因全序列 (GenBank Accession No. NM_001181586)的第41到1577位有100％的同源性,表明所获得的目的基因是正确的但不完整。

M 1 2 3图3菌液PCR鉴定重组子Fig.3 Identification of some recombinants by PCRLane M：DL 2000DNA Marker；Lane 1~3:recombinants clone PCR products图4. INO1基因的克隆Fig.4 The cloning of ino1 geneLane M: DL 5000DNA Marker; Lane 1、2：PMD-19T-INO1TAGTTACCGACAAGTGCACGTACAAGGACAACGAGCTGCTCACCAAGTACAGCTA CGAAAATGCTGTAGTTACGAAGACAGCTAGTGGCCGCTTCGATGTAACGCCCACT GTTCAAGACTACGTGTTCAAACTTGACTTGAAAAAGCCGGAAAAACTAGGAATTA TGCTCATTGGGTTAGGTGGCAACAATGGCTCCACTTTAGTGGCCTCGGTATTGGC GAATAAGCACAATGTGGAGTTTCAAACTAAGGAAGGCGTTAAGCAACCAAACTAC TTCGGCTCCATGACTCAATGTTCTACCTTGAAACTGGGTATCGATGCGGAGGGGA ATGACGTTTATGCTCCTTTTAACTCTCTGTTGCCCATGGTTAGCCCAAACGACTTT GTCGTCTCTGGTTGGGACATCAATAACGCAGATCTATACGAAGCTATGCAGAGAA GTCAAGTTCTCGAATATGATCTGCAACAACGCTTGAAGGCGAAGATGTCCTTGGT GAAGCCTCTTCCTTCCATTTACTACCCTGATTTCATTGCAGCTAATCAAGATGAGA GAGCCAATAACTGCATCAATTTGGATGAAAAAGGCAACGTAACCACGAGGGGTAAGTGGACCCATCTGCAACGCATCAGACGCGATATCCAGAATTTCAAAGAAGAAAAC GCCCTTGATAAAGTAATCGTTCTTTGGACTGCAAATACTGAGAGGTACGTAGAAG TATCTCCTGGTGTTAATGACACCATGGAAAACCTCTTGCAGTCTATTAAGAATGAC CATGAAGAGATTGCTCCTTCCACGATCTTTGCAGCAGCATCTATCTTGGAAGGTG TCCCCTATATTAATGGTTCACCGCAGAATACTTTTGTTCCCGGCTTGGTTCAGCTG GCTGAGCATGAGGGTACATTCATTGCGGGAGACGATCTCAAGTCGGGACAAACC AAGTTGAAGTCTGTTCTGGCCCAGTTCTTAGTGGATGCAGGTATTAAACCGGTCT CCATTGCATCCTATAACCATTTAGGCAATAATGACGGTTATAACTTATCTGCTCCAA AACAATTTAGGTCTAAGGAGATTTCCAAAAGTTCTGTCATAGATGACATCATCGCG TCTAATGATATCTTGTACAATGATAAACTGGGTAAAAAAGTTGACCACTGCATTGT CATCAAATATATGAAGCCCGTCGGGGACTCAAAAGTGGCAATGGACGAGTATTAC AGTGAGTTGATGTTAGGTGGCCATAACCGGATTTCCATTCACAATGTTTGCGAAG ATTCTTTACTGGCTACGCCCTTGATCATCGATCTTTTAGTCATGACTGAGTTTTGT ACAAGAGTGTCCTATAAGAAGGTGGACCCAGTTAAAGAAGATGCTGGCAAATTCG AGAACTTTTATCCAGTTTTAACCTTCTTGAGTTACTGGTTAAAAGCTCCATTAACA AGACCAGGATTTCACCCGGTGAATGGCTTAAACAAGCAAAGAACCGCCTTAGAA AATTTTTTAAGATTGTTGATTGGATTGCCTTCTCAAAACGAACT图5 克隆的INO1基因的核酸序列Fig.5: nucleotide sequence of ino1 gene by clone3 讨论肌醇对细胞生长和对蔗糖酶分泌都具有调控作用[5]，在某种程度上可以起解葡萄糖阻遏的作用。