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酵母表达引言酵母是一类单细胞真核生物，被广泛应用于生物学研究中。
酵母表达系统是指利用酵母细胞表达外源基因的技术，被广泛应用于蛋白质的高效表达和产量大规模生产。
本文将介绍酵母表达系统的原理、优势和应用。
原理酵母表达系统的核心原理是将外源基因导入酵母细胞，并通过酵母细胞的转录、翻译和修饰机制，使外源基因在酵母细胞中得到表达和功能发挥。
通常情况下，酵母表达系统主要采用酵母菌属的酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)或毕赤酵母(Pichia pastoris)作为宿主细胞。
1.酵母转录机制：酵母细胞的基因表达主要通过RNA聚合酶Ⅱ进行转录，产生mRNA分子。
2.酵母翻译机制：酵母细胞通过核糖体进行翻译，将mRNA翻译成蛋白质。
3.酵母修饰机制：酵母细胞具有多种修饰酶，可以对蛋白质进行翻译后修饰，如糖基化、磷酸化等。
优势相比其他常用的表达系统，酵母表达系统具有一系列的优势：1.高效表达能力：酵母表达系统能够实现高水平的外源基因表达，产量可达到克级。
2.翻译后修饰：酵母细胞具有多种修饰酶，可以对蛋白质进行翻译后修饰，使蛋白质得到正确的糖基化等修饰。
3.生长条件简单：酵母菌生长条件相对简单，可以在常规培养基中进行培养，对培养条件的要求相对较低。
4.可溶性蛋白质表达：酵母细胞具有较强的蛋白质折叠和修饰能力，能够高效地表达可溶性蛋白质。
应用酵母表达系统广泛应用于以下领域：1.蛋白质研究：酵母表达系统可用于大规模蛋白质表达和纯化，为蛋白质的结构、功能和相互作用研究提供了高效的工具。
2.药物筛选：酵母表达系统可用于药物靶点鉴定和药物分子筛选，加速药物研发过程。
3.疫苗研究：酵母表达系统可用于疫苗候选抗原的高效表达和产量大规模生产。
4.代谢工程：酵母表达系统可用于代谢工程领域，利用酵母细胞对外源代谢产物的高效合成能力，实现产生复杂化合物的目标。
5.生物制药：酵母表达系统已经被广泛应用于生物制药领域，用于生产重组蛋白和抗体等生物药物。
毕赤酵母常用培养基与载体一、毕赤酵母表达常用载体：典型的巴斯德毕赤酵母表达载体载体包含醇氧化酶－1（AOX1）基因的启动子和转录终止子（5'AOX1和3'AOX1），它们被多克隆位点（MCS）分开，外源基因可以在此插入。
此载体还包含组氨醇脱氢酶基因（HIS4）选择标记及3'AOX1区。
当整合型载体转化受体时，它的5'AOX1和3'AOX1能与染色体上的同源基因重组，从而使整个载体连同外源基因插入到受体染色体上，外源基因在5'AOX1启动子控制下表达。
毕赤酵母本身不分泌内源蛋白，而外源蛋白的分泌需要具有引导分泌的信号序列。
而由89个氨基酸组成的酿酒酵母的分泌信号—α交配因子(α-factor)引导序列已经成功地引导了几种外源蛋白的分泌。
分泌表达载体主要有：pPIC9，pPIC9K，pHIL-S1，pPICZα A，pYAM75P等。
胞内表达载体主要有：pHIL-D2，pA0815，pPIC3K，pPICZ，pHWO10，pGAPZ，pGAPZa(Invitrogen)，pPIC3.5K等。
工程菌株Y11430，MG1003，GS115 （AOX1），KM71，SMD1168。
毕赤酵母宿主菌常用的有GS115和KM71两种，都具有HIS4营养缺陷标记。
其中，GS115茵株具有AOX1基因，是Mut＋，即甲醇利用正常型；而KM71菌株的AOX1位点彼ARG4基因插入，表型为Muts，即甲醇利用缓慢型，两种菌株都适用于一般的酵母转化方法。
多拷贝表达菌株的获得方式：与自主复制的质粒型表达载体不同，整合型表达载体的拷贝数可以有很大的变化。
含多拷贝外源基因的表达菌株合成蛋白的量也较多。
体内整合可通过高遗传霉素抗性，筛选可能的多拷贝插入；而体外整合可通过连接产生外源基因的串联插入。
多拷贝表达菌株的获得方式有两种：一种是利用SDS-PAGE 电泳、免疫杂交或菌落点杂交方法在大量的转化子中进行自然筛选。
利用强效可调控启动子AOX，已高效表达了HBsAg、TNF、EGF、破伤风毒素C片段、基因1工程抗体等多种外源基因［11、12、13］，证实该系统为高效、实用、简便，以提高表达量并保持产物生物学活性为突出特征的外源基因表达系统，而且非常适宜扩大为工业规模［14］11. 彭毅，杨希才，康良仪。
影响甲醇酵母外源蛋白表达的因素。
生物技术通报2000，4：33-3612. 11 3 Cregg JM . Tschopp JF Stillman C, et al .High-level expression and efficient assembly of hepatitis B surface antigen in the methylotrophic yeast pichia.pastoris Bio/Technology,1987,5:479-48513. Sreekrishma K , Nelles L ，Potenz R，et al .High-level expression ,purification ,and characterization of recombinant human tumor necrosis factor synthesized and characterization in the methylotrophic yeast pichia .pastoris ,Biochemistry ,1989,28:4117-412514. Siegel RS , Buckholz RG, Thill GP , et al .Production of epider growth factor in methylotrophic yeast cells, International Patent Application ,1990 ,Publication No:WO90/10697毕赤酵母是甲醇营养型酵母，可利用甲醇作为其唯一碳源。
Mut+ 和Muts毕赤酵母中有两个基因编码醇氧化酶一一A0X1及A0X2细胞中大多数的醇氧化酶是AOX1基因产物，甲醇可紧密调节、诱导AOX1基因的高水平表达，较典型的是占可溶性蛋白的30%以上。
AOX1基因调控分两步：抑制/去抑制机制加诱导机制。
简单来说，在含葡萄糖的培养基中，即使加入诱导物甲醇转录仍受抑制。
为此，用甲醇进行优化诱导时，推荐在甘油培养基中培养。
注意即使在甘油中生长（去抑制）时，仍不足以使AOX1基因达到最低水平的表达，诱导物甲醇是AOX1基因可辨表达水平所必需的。
AOX1基因已被分离，含AOX1启动子的质粒可用来促进编码外源蛋白的目的基因的表达。
AOX2基因与AOX1基因有97%的同源性，但在甲醇中带AOX2基因的菌株比带AOX1基因菌株慢得多，通过这种甲醇利用缓慢表型可分离Muts菌株。
在YPD酵母膏、蛋白豚、葡萄糖）培养基中，不论是Mut+还是Muts其在对数期增殖一倍的时间大约为2h ° Mut+和Muts菌株在没有甲醇存在的情况下生长速率是一样的，存在甲醇的情况下，Mut+在对数期增殖一倍的时间大约为4至6个小时，Muts在对数期增殖一倍的时间大约为18个小时。
菌株GS115 > X- 33、KM71 和SMD1168 的区另I]GS115、KM71和SMD1168等是用于表达外源蛋白的毕赤酵母受体菌，与酿酒酵母相比，毕赤酵母不会使蛋白过糖基化，糖基化后有利于蛋白的溶解或形成正确的折叠结构。
GS115 > KM 71 ' SMD1168在组氨酸脫氢酶位点（His4）有突变，是组氨酸缺陷型，如果表达载体上携带有组氨酸基因，可补偿宿主菌的组氨酸缺陷，因此可以在不含组氨酸的培养基上筛选转化子。
这些受体菌自发突变为组氨酸野生型的概率一般低于10-8。
GS115表型为Mut+，重组表达载体转化GS115后，长出的转化子可能是Mut+，也可能是Muts （载体取代AX01基因），可以在MM和MD培养基上鉴定表型。
酵母表达体系构建酵母表达体系是一种常用的基因表达系统，可以用于生产重组蛋白质、疫苗、抗体等生物制品。
构建酵母表达体系需要选择合适的酵母菌种、载体、目的基因以及必要的宿主细胞，并通过基因克隆、转化、筛选等一系列步骤实现。
本文将详细介绍酵母表达体系的构建过程。
一、选择酵母菌种和载体1．酵母菌种选择：根据需要表达的蛋白质的种类和性质，选择适合的酵母菌种。
常用的酵母菌种有Saccharomyces cerevisiae（酿酒酵母）、Pichia pastoris（毕赤酵母）等。
2．载体选择：载体是携带目的基因进入宿主细胞的必要元件，常用的载体包括质粒、整合型载体和噬菌体载体等。
在构建酵母表达体系时，应根据目的基因的性质和表达量要求选择合适的载体。
二、目的基因的克隆和鉴定1．基因克隆：将目的基因插入到载体中，形成重组DNA分子。
可以通过PCR、基因文库等方法获取目的基因，也可以从基因组或cDNA文库中筛选出目的基因。
2．转化宿主细胞：将重组DNA分子导入到宿主细胞中，常用的方法包括电穿孔法、转化法等。
3．阳性克隆筛选：通过菌落PCR或 southern 杂交等方法筛选出含有目的基因的阳性克隆。
4．序列分析：对阳性克隆进行序列分析，确保目的基因正确插入载体中，并且没有发生任何突变。
三、构建酵母表达体系1．质粒制备：从阳性克隆中提取重组质粒，并进行纯化和鉴定。
2．转化酵母细胞：将重组质粒转化到酵母细胞中，常用的方法包括电穿孔法、热激法等。
3．筛选阳性克隆：通过 southern 杂交等方法筛选出含有重组质粒的阳性克隆。
4．鉴定表达产物：对阳性克隆进行蛋白质表达水平检测，常用的方法包括 western 杂交、ELISA等。
同时对表达产物进行生物活性检测，以评估表达产物的质量和功能。
5．优化表达条件：通过对培养条件（如温度、pH值、营养物质浓度等）进行优化，提高目的基因的表达水平和产量。
6．生产与纯化：在优化条件下进行大规模培养和表达，并对表达产物进行纯化和加工，以满足实际应用需求。
毕赤酵母常用培养基与载体一、毕赤酵母表达常用载体：典型的巴斯德毕赤酵母表达载体载体包含醇氧化酶－1（AOX1）基因的启动子和转录终止子（5'AOX1和3'AOX1），它们被多克隆位点（MCS）分开，外源基因可以在此插入。
此载体还包含组氨醇脱氢酶基因（HIS4）选择标记及3'AOX1区。
当整合型载体转化受体时，它的5'AOX1和3'AOX1能与染色体上的同源基因重组，从而使整个载体连同外源基因插入到受体染色体上，外源基因在5'AOX1启动子控制下表达。
毕赤酵母本身不分泌内源蛋白，而外源蛋白的分泌需要具有引导分泌的信号序列。
而由89个氨基酸组成的酿酒酵母的分泌信号—α交配因子(α-factor)引导序列已经成功地引导了几种外源蛋白的分泌。
分泌表达载体主要有：pPIC9，pPIC9K，pHIL-S1，pPICZα A，pYAM75P等。
胞内表达载体主要有：pHIL-D2，pA0815，pPIC3K，pPICZ，pHWO10，pGAPZ，pGAPZa(Invitrogen)，pPIC3.5K等。
工程菌株Y11430，MG1003，GS115 （AOX1），KM71，SMD1168。
毕赤酵母宿主菌常用的有GS115和KM71两种，都具有HIS4营养缺陷标记。
其中，GS115茵株具有AOX1基因，是Mut＋，即甲醇利用正常型；而KM71菌株的AOX1位点彼ARG4基因插入，表型为Muts，即甲醇利用缓慢型，两种菌株都适用于一般的酵母转化方法。
多拷贝表达菌株的获得方式：与自主复制的质粒型表达载体不同，整合型表达载体的拷贝数可以有很大的变化。
含多拷贝外源基因的表达菌株合成蛋白的量也较多。
体内整合可通过高遗传霉素抗性，筛选可能的多拷贝插入；而体外整合可通过连接产生外源基因的串联插入。
多拷贝表达菌株的获得方式有两种：一种是利用SDS-PAGE电泳、免疫杂交或菌落点杂交方法在大量的转化子中进行自然筛选。
酵母菌表面展示的蛋白质工程操作步骤酵母菌表面展示的蛋白质工程是一种重要的技术手段，可以用于研究蛋白质的结构与功能，以及开发新型的药物和生物材料。
下面将介绍酵母菌表面展示的蛋白质工程的操作步骤。
1. 选择适当的酵母菌株选择适合表面展示蛋白质的酵母菌株，常用的有酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)和毕赤酵母(Hansenula polymorpha)。
根据实验的需要，选择相应的酵母菌株。
2. 构建融合蛋白的表达载体将目标蛋白与酵母菌表面展示蛋白的结构域进行融合，并将融合蛋白的基因插入酵母菌表达载体中。
选择适当的启动子、选择子和标签，确保融合蛋白的高效表达和方便检测。
3. 转化酵母细胞将构建好的表达载体导入酵母菌细胞中，通常采用化学法或电转化法将外源DNA转化到酵母细胞内。
经过培养和筛选后，得到表达目标蛋白的转基因酵母菌株。
4. 表达目标蛋白将转基因酵母菌株进行培养，提供适当的培养基和条件，促使目标蛋白的高效表达。
可以通过检测培养基中目标蛋白的浓度和预测蛋白的位置来确定表达效果。
5. 表面展示目标蛋白利用酵母菌表面展示蛋白质的特性，通过分子生物学的手段，使得目标蛋白质能够在酵母菌表面展示出来。
常用的方法有融合目标蛋白与表面展示蛋白的结构域、或者通过添加信号肽等方式，在酵母菌细胞表面定向展示目标蛋白。
6. 鉴定和纯化目标蛋白使用合适的实验方法和技术手段，对表面展示的目标蛋白进行鉴定和纯化。
例如，可以利用抗体的特异性进行检测，或者利用亲和层析等技术进行纯化。
7. 评估目标蛋白的功能对纯化获得的目标蛋白进行功能评估，例如测试其在特定条件下的结构稳定性、酶活性、配体结合能力等。
同时，还可以对目标蛋白进行结构解析，揭示其功能机制。
总结：酵母菌表面展示的蛋白质工程操作步骤主要包括酵母菌株的选择、构建融合蛋白的表达载体、转化酵母细胞、表达目标蛋白、表面展示目标蛋白、鉴定和纯化目标蛋白以及评估目标蛋白的功能。
酿酒酵母表达载体pYES2,ｐYES２／NT,ｐYＥS２/CT,pYES3,pYES6,pYCｐlａｃ2２-GＦP,酵母载体pAUR12３,pRS３03TEF,pRS30４, pRS305,pRS306,ｐY13ＴEF,ｐY14TEＦ,pY１５TEF,pＹ16TEF,酵母基因重组表达载体pUG6,pＳH４７,酵母单杂载体pHISｉ,pLacZi,pHIＳ2, pGＡD4２4, 酵母双杂交系统:酿酒酵母Y187,酿酒酵母AＨ109;质粒pGADＴ7,pGBＫT７;对照质粒pGBKT7－5３,pGBKT７-lam,pGＡDＴ７-T,PCＬ1,酿酒酵母菌株ＩＮＶＳc1,YM42７1, AH109,Y1８７,Y１９0,毕赤酵母表达载体pPＩＣ9K,pPIC9Ｋ-His,pPＩＣ3.5K,ｐＰICZalｐhaＡ,B,C,ｐP ＩCZA,B,C,ｐGAPZαA,ｐAＯ8１5,pPIC9k-Hｉs,pＨIL-S1,pＰink ｈc,配套毕赤酵母Pｉcｈiaｐiｎk,毕赤酵母宿主Ｘ33,KＭ７１,KM71H,GS115,原核表达载体pQＥ30,31,32,40,60,61,62,等原核表达载体,包括ｐET系列,ｐＥT-GST,pGEX系列(含GＳT标签),pMAL系列pMＡL-c2x,－c4x,－c4e,-c5x,-p5x,pＢＡD,pBAＤHis,ｐＢADmycHis系列,ｐQE系列,pＴｒｃ9９a,pTrcＨis系列,pＢV２2０,22１,222,pTＸＢ系列,ｐLＬP-oｍpA,pIN-III-ompA(分泌型表达系列),pQBI6３(原核表达带荧光)pEＴ3a, pET 3d, pET 11a,ｐEＴ12a, ｐEＴ14b, ｐＥT 15b, pＥT 16b, pＥT 17b,pET 19b, pET 2０b, pET 21a,b,d, pET ２2b,ｐET ２3a,ｐET 23b, pET24a,b,pET ２5ｂ, pET 2６b, ｐEＴ27b, pET ２8a,b, pET 29a,pET 30a, pET 31b, pET32a, pEＴ35b, pET 38b, pEＴ３９b,pET 40b, pEＴ４１ａ,b pET 42a,pＥT 43、1ａ,b pET 44ａ, ｐEＴ49ｂpEＴ３０2,303 pET His,pET Dsｂ,ｐET GST,ｐＥT Trx pＱE2, ｐQE9 pQE30,31,32, pQE 4０ｐQＥ７０pQE80L pＱＥTirs sｙstem pR ＳET-A pRSEＴ-B pRSET－C pGEX4T-1,-2,－3,５ｘ-１,6p-1,６p-2,2ｔk,3c ｐＢV22０,221,222 ｐTrcHisA,B,C pBAD24,34,43 pBAＤＨｉsＡ,B,C pPinPoiｎｔ-Ｘa1,Xa2,Xａ3 pMALc2x, p2x pＢV220 pGEM Ex1, pGEＭ7ZF(+), pＴrｃ99Ａ,ｐTwin1, pEZZ18ｐkk232－８,pｋk ２33-３,pAＣYＣ１８4,pBR３２2,ｐUC119 pＴYB1,pTYB2,pTYB4,pTＹB11 pＢlueＳcript SK(+),pＢlueSｃript SK(－) ｐLＬP ompA, ｐＩNIIIomｐA,ｐMＢP-P,pＭBP-Ｃ, 大肠杆菌冷激质粒: p ＣｏｌdＩpColｄII ｐColdIIＩpCｏldTF 原核共表达质粒:pＡCYCｄuet－1,ｐＥTｄuet-1,pＣＤFdｕｅt-1,ｐＲＳFduet－1 Ｔakara公司大肠杆菌分子伴侣: p Ｇ-KＪＥ8 ｐGro7 pKJE7 pＧＴｆ２ｐTf１6 大肠杆菌宿主细胞: DH5a JM101 JＭ103 ＪＭ105 JM107 JＭ１０9JM110Top1０Toｐ１０F ＢL21(ＤE３) HB１01 ER252９Ｅ２５66 C256６MＧ1655XL－10goｌd ＸＬblue Ｍ15 JＦ11２5K802 SＧ111７BL21(ＡI) BL21(DＥ3)plysS TG1 TB1 DH5ａ(ｐir) Tuner(DＥ3) Bl21 codonplusRIPL Novablue(ＤE3)RosettａＲｏsetｔa(DE3) Ｒoseｔｔa(DＥ３)plysＲosetta－ｇamｉ(ＤＥ3) Ｒｏseｔta-ｇａmiＢ(DＥ3), Ｒｏsettａ-ｇａmiB(DＥ3)plysS Orｇami(DＥ３)ＯrｇamiB(DE3) HMS174(DＥ3)植物表达／ＲNＡi载体农杆菌pＢI121,pBＩ12１-ＧFＰ,pBI101,pＢI2２1,pSN1301, pＵN1３01,pRTL２, pRＴL2-GFP ,pRTL2-CFP,pRTL2-RFＰ, pRＴL2-YFP,pCAMＢIＡ１３00, １301, １３0２,１303,１304,１305, 1３8１Z,13９1Z,230０, 2301,330０,３301,pＣAMBIA suｐer13００,ｐCAMBIＡsupeｒ1300－GFＰ,pPZＰ212,pＰＺP２1２1,pPZP21２-ＧＦP,pGDG,RNAi载体pART2７,ｐHAＮＮIBAL,pＫAＮNIBＡL,pＦGＣ５9４1,pTＣK303, pTRV１,pＴRV ２, T－ＤNＡ插入载体(随机突变体库)pSKＩ0１5,ｐSKI07４,真菌ＡTＭT载体p ＢＩG2RHPＨ2-GUＳ-GFＰ,ｐＢHt1枯草芽孢杆菌表达载体pWB980,ｐＨT4３,pHP１３,pHＰ４3, pBE2,pMUTＩN4,pUB11０,ｐＥ1９4,ｐMA5, pMＫ３,ｐＭK４,pHT304,pHY300PLK, pＢest5０2,pDＧ1363,pSG1154,pＡX01, ｐＳAS1４4,ｐDＬ,ｐDG148-stu,pDG641,ｐA Ｌ12,ｐUＣX０5-ｂgaB,pHT0１,配套菌株ＢS １６８,WＢ60０,ＷB800,WB7００, WB800N,1０１2,FZB42,1A7４７,广宿主质粒ｐＶＬT３3RNＡi基因沉默干扰敲除载体pSilenｃer1、0,pSｉlencer ２.１-U６hｙｇｒo, pSｉlenｃer 3.1-H1hygｒo,pSilencer 3、１-H1 neo,ｐSileｎcer 4、1-CMＶne ｏ, pSileｎｃｅｒ4、1－CMV puro pMIR－RＥPORT Lｕciferase RNＡi载体(olｉｇoｅngine) pSuｐer-puro RＮＡｉ逆转录病毒载体(cloｎtｅｃh): RＮＡi －Ｒｅady pＳＩREN-Retro Q, RNAi-Reａdy ｐＳIＲEN-ＲｅtroQ-ZsGreeｎ(LuｃiferasｅshRNＡAnneａlｅdＯlｉgonucｌeotiｄe) RNＡi慢病毒载体(addgeｎe): pLKO.1哺乳动物表达载体ｐｃDNA3、1＋/-,pｃDNA4/HｉsＭax B,pSecTaｇ2 A,pVAＸ1,pBｕdCE4.1,pTrａcer CMＶ２,pcＤNＡ３、1(-)/ｍyc－Ｈis A ,pcDNA6-Ｍｙc/His Ｂ,pＣEＰ4,ｐIRES,pIRＥSnｅo,pIRES hyg3,pCMＶ-ｍyc,pCMV－HA,pＩRES-puｒｏ３,ｐIＲＥS-neo3,pCAGGS哺乳动物双杂交系统pACＴ,ｐBIND,pACＴ-MyｏD,pBＩND-Ｉd,pG5luc,pＣMＶ-BD,pCMV－AD, pBD-p5３, ｐＦR-ｌuｃ,CｙtotraｐＴwo－HybrｉｄSysｔem:ｐSｏs, pSoｓMAFＢ, ｐMｙr蜕皮激素诱导系统ｐＩND, ｐVｇＲxR,LacSwith ＩI哺乳动物诱导表达系统:ｐOPＲＳVI ,pOPI3ＣＡＴ,pCMVLacI,GｅneSwitcｈSyｓtｅm:pＳwiｔｃh哺乳动物表面展示系统:pDiｓplａy, 四环素调控系统(Invitrｏｇeｎ):pcＤNA4／TＯ／Myｃ-HiｓA,pcDＮA4/TO/Myc-HiｓB,ｐcDNＡ４/TO/Myc-Ｈis C,ｐｃDNA4/ＴO/Mｙｃ－His/ＬacＺ,pcDNA６/TR四环素调控系统(Cｌｏntech):pTeｔ-On,pTeｔ-Ｏff,ｐTRE2,pRevTRE,pReｖTｅｔ-On,ｐRevTet-off 信号通路报告载体:pＧAS-TA-Ｌｕc,ｐＳTAＴ3-TＡ-Ｌｕc,ｐISRE-TA－Lu ｃ, pTＡ-Luc,pIκB－EＧFＰ,pNFＡＴ-TA－Luc,pCasｐase3-sensor,pAP１(PMA)－Luc;pGL4.26[lｕc2P/ｍｉnＰ/Hｙgro],pGL4.２9[lｕc2Ｐ/ＣＲＥ/Hygｒｏ],pGL４.３0[luc2P/NFAT-RＥ/Ｈygｒo],pGL4、75;p５3-Luc,pAP-1-Lｕc, pNF-κB－Lｕc,pSRE-Lｕc,pFＡ２-Elk１,pFC-ＭＥKK,pFR-luc,Gaｔeｗａy系统(inviｔrｏｇen)pcDNＡ6、2－GＷEmＧFP-miR ｎegａtive, pＬeｎｔi6／TR,pcDNＡ6、２-GＷEmＧFP-mｉR,乳酸菌表达载体及各种乳酸菌乳酸杆菌菌株,pNZ8148,pLEISS,pMG3６e,ｐBB Ｒ1ＭCＳ-5,pBBＲ1MCＳ－6,ｐＲV61０,pLＥＭ4１5,ｐＨY300ＰLＫ,分泌型乳酸菌表达载体pVＥ5523,pＰG611、1,pＰG６１２.1等与乳酸杆菌菌株宿主菌NZ ９００0,ＭG13６3,Laｃtoｂaｃｉｌluｓcaｓei １.539,Ｌacｔｏbacｉｌｌuｓcasei,acidophilｕsＮCFM,1、2,Lactobaciｌｌus sａkei 23K,Ｌ、planｔaｒuｍ,L.rh ａmnosus GG,B、ｃoaguｌans,Biｆidobactｅrium ｂiｆiduｍ,Ｂifidｏbactｅrｉｕｍinfantis,Laｃtococcus lacｔｉs M17,1663,Lactobａcillus reuｔｅrii广宿主表达载体链球菌表达敲除载体假单胞菌表达载体pVLT33,pBBR1MＣS-2,3,4,5,6, ｐJＲD2１５,pJN105,ｐＭE60３２,Ｃos载体pLＡＦR３,pMP2444(ＧFＰ),pHY３00ＰLＫ,pＲT1０２,pRＬ１0６3a, 转座子载体ｐUT-minｉＴn ５,pMＧS100,pWHＭ10,pKＣ1139,pＳＥT１52,pOJ260,pPＧ６11、1,ｐPG6１2、1,腺病毒载体/慢病毒,逆转录病毒表达载体及包装包膜质粒,腺病毒系统(Strａtagene): pAdEａsy-1,pSｈuttle-CＭＶ,pShutｔｌe,pAdTrack,pAdＴracｋ-CＭV, ｐＳhuttle-ＩRＥS-ｈrＧＦP-１、pShuttle-IRＥS－hｒＧＦP-2、pShuttlｅ-CMV-lacZ, pShuｔtｌe－CMV-EGＦP-Ｃ,pXC1, pBHGE3, 配套大肠杆菌BＪ5183,2９３,２93T cｅll ｌｉｎe 腺相关病毒系统(Strataｇene):ｐAAＶ-MCS,pAＡＶ-RＣ,pHｅｌｐer,pAAV-LacZ,pAAＶ-IRES-hrＧFP,pＣMV-MCS,慢病毒载体:ｐLVX-DsRed-Ｍoｎomｅr－N1,pLVX－IREＳ－ZｓGreen1,pLVＸ-AcＧFP1-N1,Lｅｎti6/v5-EDST－EＧFP,pＷPXL, FＵGW,pLeｎｔilox 3、7,ＲNＡｉ－ReａｄｙpＳIREN-Reｔro Ｑ, RNＡi-Ready pSIREN－Retro Q－ＺsGreen, ｐSUＰEＲ、Rｅtro-ＧＦP／Neo,ｐＳUPER-Ｒetrｏ-Ｎeo, pSUPＥR.Retro-puro,PLＮＣＸPLNＣX2 pMＳＣV-HYG pMSCＶ-ｎeo ｐＭSCＶ-puro pLEGFP-C1 ｐLＯX-CW-CRE pＬOＸ-GFP-IＲＥS-TK pRｅtｒoＸ－IREＳ-ＤsＲｅdExprｅsｓ, pLVX-ＩRＥS-ｍＣherry质粒载体。
酵母菌表面展示操作步骤之表面展示实验设计和结果分析酵母菌表面展示是一种常用的技术手段，利用该技术可以将目标蛋白质在酵母菌表面展示出来，实现对蛋白质功能和相互作用的研究。
本文将介绍酵母菌表面展示实验的设计和结果分析步骤。
一、实验设计1. 酵母菌品种选择：根据需要展示的蛋白质类型和所要研究的功能，选择合适的酵母菌品种。
常用的酵母菌品种有Saccharomyces cerevisiae（酿酒酵母）和Pichia pastoris（毕赤酵母）。
2. 表达载体选择：根据需求选择合适的表达载体，常用的有pCTCON、pCTCON2、pPICZ和pET等。
需要根据载体的特点进行合理设计，了解载体能否适应目标蛋白质的表达和展示。
3. 构建重组质粒：将目标蛋白质的编码序列克隆到选择的表达载体中。
可以利用PCR、限制性内切酶切割、连接酶反应等方法完成质粒构建。
4. 酵母菌转化：将构建好的重组质粒导入酵母菌中。
常用的转化方法有质粒导入法、电转化法和化学转化法等。
5. 筛选表达阳性克隆：通过选择性培养基或适当的筛选标记，筛选出表达目标蛋白的酵母菌阳性克隆。
二、结果分析1. 表达确证：通过Western blot、ELISA等蛋白质检测方法，对筛选出的阳性克隆进行蛋白质表达确证。
可以使用特异性抗体对目标蛋白质进行特异性检测。
2. 表面展示检测：通过流式细胞术、荧光显微镜观察等方法，对表达阳性的酵母菌进行表面展示检测。
可以利用荧光标记的抗体或成像技术对表面展示的目标蛋白质进行定性和定量分析。
3. 蛋白质功能研究：利用表面展示的酵母菌，进行蛋白质功能研究。
可以通过蛋白质-蛋白质相互作用实验、底物结合实验等方法，研究目标蛋白质在酵母菌表面的功能。
4. 应用研究：根据实验结果，对酵母菌表面展示技术的应用进行评估和探索。
可以进一步研究目标蛋白质在医药、工业生产等领域的应用潜力。
总结：酵母菌表面展示技术是一种功能研究常用的实验手段，通过合理的实验设计和结果分析，可以获得高效的表面展示效果和可靠的实验数据。
酵母菌表面展示构建的步骤酵母菌表面展示是一种重要的生物技术方法，可用于展示、表达和分析多种蛋白质、多肽以及其他生物分子。
通过在酵母菌表面展示目标分子，不仅可以实现其高效表达和纯化，还可以研究其功能、相互作用以及在药物研发和生物工程中的潜在应用。
以下是酵母菌表面展示构建的一般步骤：1. 选择合适的酵母菌株：酵母菌株的选择是展示构建的首要步骤。
常用的酵母菌株包括酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)和毕赤酵母(Pichia pastoris)等。
选择菌株需考虑其生长特性、易于操作性以及背景蛋白质的表达水平等因素。
2. 构建表达载体：表达载体是实现酵母菌表面展示的关键。
通常，表达载体由三个主要部分组成：信号序列、目标蛋白质和酵母菌表面展示蛋白质。
信号序列用于将目标蛋白质导向到酵母菌的内质网，并通过囊泡转运机制将其定向到细胞表面。
酵母菌表面展示蛋白质用于将目标蛋白质固定在细胞表面，常用的展示蛋白质有酵母菌表面酯酶(Agα1p)和人间贸易站蛋白(Agα2p)等。
3. 进行基因克隆和重组：将目标基因或DNA片段插入表达载体中，通常采用 PCR 扩增和限制性内切酶消化等方法。
确保目标基因的正确插入并验证其序列。
4. 转化酵母菌细胞：将构建好的表达载体转化到酵母菌细胞中。
转化方法可以是化学法、电击法或凝胶法等。
转化后，通过选择性培养基筛选带有表达载体的酵母菌细胞。
5. 表达和纯化目标蛋白质：转化后的酵母菌细胞在培养基中进行培养，并通过诱导表达目标蛋白质。
常用的诱导方法包括加入特定化合物、调节温度和控制培养时间等。
表达完成后，可通过离心和裂解细胞等方法将目标蛋白质从细胞内获得。
6. 目标蛋白质的展示和检测：通过表面展示蛋白质将目标蛋白质固定在酵母菌的细胞表面。
展示蛋白质通常包括融合标签，如His 标签、GST 标签等，以便于后续的检测和纯化。
展示蛋白质的表达水平和固定效果可以通过免疫荧光染色、流式细胞术等方法进行检测和分析。
毕赤酵母表达（pichia pastoris expression ）实验手册2010-07-15 10:54:56| 分类：毕赤酵母| 标签：|字号大中小订阅一．毕赤酵母表达常用溶液及缓冲液的配制二．毕赤酵母表达的培养基配制三．主要试验环节的操作 3.1 酵母菌株的分离纯化 3.2 pPICZαA原核宿主菌TOP10F’的活化培养 3.3毕赤酵母表达的试验方法 3.4 毕赤酵母电转化方法 3.5 Pichia酵母表达直接PCR鉴定重组子的方法 3.6 毕赤酵母基因组提取方法 3.7 Mut+表型重组酵母的诱导表达实验关键词：酵母实验毕赤酵母表达 pichia pastoris expression 毕赤酵母酵母菌株大肠杆菌表达系统最突出的优点是工艺简单、产量高、周期短、生产成本低。
然而，许多蛋白质在翻译后，需经过翻译后的修饰加工，如磷酸化、糖基化、酰胺化及蛋白酶水解等过程才能转化成活性形式。
大肠杆菌缺少上述加工机制，不适合用于表达结构复杂的蛋白质。
另外，蛋白质的活性还依赖于形成正确的二硫键并折叠成高级结构，在大肠杆菌中表达的蛋白质往往不能进行正确的折叠，是以包含体状态存在。
包含体的形成虽然简化了产物的纯化，但不利于产物的活性，为了得到有活性的蛋白，就需要进行变性溶解及复性等操作，这一过程比较繁琐，同时增加了成本。
大肠杆菌是用得最多、研究最成熟的基因工程表达系统，当前已商业化的基因工程产品大多是通过大肠杆菌表达的，其主要优点是成本低、产量高、易于操作。
但大肠杆菌是原核生物，不具有真核生物的基因表达调控机制和蛋白质的加工修饰能力，其产物往住形成没有活性的包涵体，需要经过变性、复性等处理，才能应用。
近年来，以酵母作为工程菌表达外源蛋白日益引起重视，原因是与大肠杆菌相比，酵母是低等真核生物，除了具有细胞生长快，易于培养，遗传操作简单等原核生物的特点外，又具有真核生物时表达的蛋白质进行正确加工，修饰，合理的空间折叠等功能，非常有利于真核基因的表达，能有效克服大肠杆菌系统缺乏蛋白翻译后加工、修饰的不足。
毕赤酵母多拷贝表达载体试剂盒毕赤酵母多拷贝表达载体试剂盒用于在含多拷贝基因的毕赤酵母菌中表达并分离重组蛋白综述：基本特征：作为真核生物，毕赤酵母具有高等真核表达系统的许多优点：如蛋白加工、折叠、翻译后修饰等。
不仅如此，操作时与E.coli及酿酒酵母同样简单。
它比杆状病毒或哺乳动物组织培养等其它真核表达系统更快捷、简单、廉价，且表达水平更高。
同为酵母，毕赤酵母具有与酿酒酵母相似的分子及遗传操作优点，且它的外源蛋白表达水平是后者的十倍以至百倍。
这些使得毕赤酵母成为非常有用的蛋白表达系统。
与酿酒酵母相似技术：许多技术可以通用：互补转化基因置换基因破坏另外，在酿酒酵母中应用的术语也可用于毕赤酵母。
例如：His4 基因都编码组氨酸脱氢酶；两者中基因产物有交叉互补；酿酒酵母中的一些野生型基因与毕赤酵母中的突变基因相互补，如His4、Leu2、Arg4、TR11、Ura3 等基因在毕赤酵母中都有各自相互补的突变基因。
毕赤酵母是甲醇营养型酵母：毕赤酵母是甲醇营养型酵母，可利用甲醇作为其唯一碳源。
甲醇代谢的第一步是：醇氧化酶利用氧分子将甲醇氧化为甲醛，还有过氧化氢。
为避免过氧化氢的毒性，甲醛代谢主要在一个特殊的细胞器－过氧化物酶体－里进行，使得有毒的副产物远离细胞其余组分。
由于醇氧化酶与O2 的结合率较低，因而毕赤酵母代偿性地产生大量的酶。
而调控产生醇过氧化物酶的启动子也正是驱动外源基因在毕赤酵母中表达的启动子。
两种醇氧化酶蛋白：毕赤酵母中有两个基因编码醇氧化酶－AOX1 及AOX2。
细胞中大多数的醇氧化酶是AOX1 基因产物。
甲醇可紧密调节、诱导AOX1 基因的高水平表达，较典型的是占可溶性蛋白的30%以上。
AOX1 基因已被分离，含AOX1 启动子的质粒可用来促进编码外源蛋白的目的基因的表达。
AOX2 基因与AOX1 基因有97%的同源性，但在甲醇中带AOX2 基因的菌株比带AOX1 基因菌株慢得多，通过这种甲醇利用缓慢表型可分离Muts 菌株。
酿酒酵母表达载体pYES2,pYES2/NT,pYES2/CT,pYES3,pYES6, pYCplac22-GFP,酵母载体pAUR123,pRS303TEF,pRS304, pRS305,pRS306,pY13TEF,pY14TEF，pY15TEF，pY16TEF,酵母基因重组表达载体pUG6, pSH47,酵母单杂载体pHISi,pLacZi,pHIS2, pGAD424, 酵母双杂交系统:酿酒酵母Y187, 酿酒酵母AH109；质粒pGADT7,pGBKT7；对照质粒pGBKT7-53，pGBKT7-lam，pGADT7-T，PCL1，酿酒酵母菌株INVSc1,YM4271, AH109,Y187,Y190,毕赤酵母表达载体pPIC9K,pPIC9K-His,pPIC3.5K,pPICZalphaA,B,C,pPICZA,B,C,pGAPZαA,pAO815,pPIC9k-His,pHIL-S1,pPink hc，配套毕赤酵母Pichiapink,毕赤酵母宿主X33，KM71，KM71H，GS115，原核表达载体pQE30,31,32,40,60,61,62,等原核表达载体,包括pET系列，pET-GST，pGEX系列（含GST标签），pMAL系列pMAL-c2x,-c4x,-c4e,-c5x,-p5x,pBAD,pBADHis,pBADmycHis系列，pQE系列,pTrc99a,pTrcHis系列，pBV220,221,222,pTXB系列，pLLP-ompA,pIN-III-ompA （分泌型表达系列）,pQBI63（原核表达带荧光）pET3a, pET 3d, pET 11a, pET 12a, pET 14b, pET 15b, pET 16b, pET 17b, pET 19b, pET 20b, pET 21a,b,d, pET 22b, pET 23a, pET 23b, pET 24a,b, pET 25b, pET 26b, pET 27b, pET 28a,b, pET 29a, pET 30a, pET 31b, pET 32a, pET 35b, pET 38b, pET 39b, pET 40b, pET 41a,b pET 42a, pET 43.1a,b pET 44a, pET 49b pET302,303 pET His,pET Dsb,pET GST,pET Trx pQE2, pQE9 pQE30,31,32, pQE 40 pQE70 pQE80L pQETirs system pRSET-A pRSET-B pRSET-C pGEX4T-1,-2,-3,5x-1,6p-1,6p-2,2tk,3c pBV220,221,222 pTrcHisA,B,C pBAD24,34,43 pBAD HisA,B,C pPinPoint-Xa1,Xa2,Xa3 pMALc2x, p2x pBV220 pGEM Ex1, pGEM7ZF（+）, pTrc99A, pTwin1, pEZZ18 pkk232-8,pkk233-3,pACYC184,pBR322,pUC119 pTYB1,pTYB2,pTYB4,pTYB11 pBlueScript SK （+）,pBlueScript SK（-）pLLP ompA, pINIIIompA, pMBP-P ,pMBP-C, 大肠杆菌冷激质粒： pColdI pColdII pColdIII pColdTF 原核共表达质粒：pACYCduet-1,pETduet-1,pCDFduet-1，pRSFduet-1 Takara公司大肠杆菌分子伴侣： pG-KJE8 pGro7 pKJE7 pGTf2 pTf16 大肠杆菌宿主细胞： DH5a JM101 JM103JM105 JM107 JM109 JM110 Top10 Top10F BL21（DE3）HB101 ER2529 E2566 C2566 MG1655 XL-10gold XL blue M15 JF1125 K802 SG1117 BL21（AI）BL21（DE3）plysS TG1 TB1 DH5a（pir）Tuner（DE3）Bl21 codonplusRIPL Novablue （DE3）Rosetta Rosetta（DE3）Rosetta（DE3）plys Rosetta-gami（DE3）Rosetta-gamiB（DE3）, Rosetta-gamiB（DE3）plysS Orgami（DE3）OrgamiB（DE3）HMS174（DE3）植物表达/RNAi载体农杆菌pBI121,pBI121-GFP,pBI101,pBI221,pSN1301,pUN1301,pRTL2 , pRTL2-GFP , pRTL2-CFP, pRTL2-RFP , pRTL2-YFP,pCAMBIA 1300, 1301, 1302,1303,1304,1305, 1381Z,1391Z,2300, 2301,3300,3301,pCAMBIA super1300,pCAMBIAsuper1300-GFP,pPZP212,pPZP2121,pPZP212-GFP,pGDG,RNAi载体pART27,pHANNIBAL,pKANNIBAL, pFGC5941,pTCK303, pTRV1,pTRV2,T-DNA插入载体（随机突变体库）pSKI015,pSKI074,真菌ATMT载体pBIG2RHPH2-GUS-GFP,pBHt1枯草芽孢杆菌表达载体pWB980,pHT43,pHP13,pHP43,pBE2,pMUTIN4,pUB110,pE194,pMA5, pMK3,pMK4,pHT304,pHY300PLK,pBest502,pDG1363,pSG1154,pAX01, pSAS144,pDL,pDG148-stu,pDG641,pAL12,pUCX05-bgaB,pHT01，配套菌株BS 168,WB600,WB800,WB700,WB800N,1012,FZB42,1A747,广宿主质粒pVLT33RNAi基因沉默干扰敲除载体pSilencer1.0，pSilencer 2.1-U6 hygro， pSilencer 3.1-H1 hygro，pSilencer 3.1-H1 neo， pSilencer 4.1-CMV neo， pSilencer 4.1-CMV puro pMIR-REPORT Luciferase RNAi载体（oligoengine）pSuper-puro RNAi逆转录病毒载体（clontech）: RNAi-Ready pSIREN-Retro Q， RNAi-ReadypSIREN-RetroQ-ZsGreen（Luciferase shRNA Annealed Oligonucleotide）RNAi慢病毒载体（addgene）: pLKO.1哺乳动物表达载体pcDNA3.1+/-,pcDNA4/HisMax B，pSecTag2 A，pVAX1，pBudCE4.1,pTracer CMV2，pcDNA3.1（-）/myc-His A ，pcDNA6-Myc/His B，pCEP4， pIRES，pIRESneo，pIRES hyg3，pCMV-myc，pCMV-HA，pIRES-puro3，pIRES-neo3,pCAGGS哺乳动物双杂交系统pACT，pBIND，pACT-MyoD，pBIND-Id，pG5luc,pCMV-BD, pCMV-AD, pBD-p53, pFR-luc,Cytotrap Two-Hybrid System:pSos, pSos MAFB, pMyr蜕皮激素诱导系统pIND, pVgRxR,LacSwith II哺乳动物诱导表达系统:pOPRSVI ，pOPI3CAT，pCMVLacI,GeneSwitch System:pSwitch哺乳动物表面展示系统:pDisplay, 四环素调控系统（Invitrogen）：pcDNA4/TO/Myc-His A，pcDNA4/TO/Myc-His B，pcDNA4/TO/Myc-His C，pcDNA4/TO/Myc-His/LacZ，pcDNA6/TR四环素调控系统（Clontech）：pTet-On，pTet-Off，pTRE2,pRevTRE，pRevTet-On，pRevTet-off信号通路报告载体:pGAS-TA-Luc，pSTAT3-TA-Luc, pISRE-TA-Luc, pTA-Luc，pIκB-EGFP，pNFAT-TA-Luc，pCaspase3-sensor，pAP1（PMA）-Luc;pGL4.26[luc2P/minP/Hygro],pGL4.29[luc2P/CRE/Hygro],pGL4.30[luc2P/NFA T-RE/Hygro]，pGL4.75;p53-Luc，pAP-1-Luc， pNF-κB-Luc，pSRE-Luc，pFA2-Elk1，pFC-MEKK，pFR-luc,Gateway系统（invitrogen）pcDNA6.2-GWEmGFP-miR negative, pLenti 6/TR,pcDNA 6.2-GW EmGFP-miR，乳酸菌表达载体及各种乳酸菌乳酸杆菌菌株，pNZ8148,pLEISS,pMG36e,pBBR1MCS-5,pBBR1MCS-6,pRV610,pLEM415,pHY3 00PLK,分泌型乳酸菌表达载体pVE5523，pPG611.1,pPG612.1等和乳酸杆菌菌株宿主菌NZ9000,MG1363,Lactobacillus casei 1.539,Lactobacillus casei,acidophilus NCFM,1.2,Lactobacillus sakei 23K,L.plantarum,L.rhamnosusGG,B.coagulans,Bifidobacterium bifidum,Bifidobacterium infantis,Lactococcus lactis M17,1663,Lactobacillus reuterii广宿主表达载体链球菌表达敲除载体假单胞菌表达载体pVLT33,pBBR1MCS-2,3,4,5,6, pJRD215,pJN105,pME6032,Cos载体pLAFR3,pMP2444（GFP）, pHY300PLK,pRT102,pRL1063a, 转座子载体pUT-miniTn5,pMGS100, pWHM10,pKC1139,pSET152,pOJ260,pPG611.1,pPG612.1，腺病毒载体/慢病毒，逆转录病毒表达载体及包装包膜质粒，腺病毒系统（Stratagene）: pAdEasy-1,pShuttle-CMV,pShuttle,pAdTrack, pAdTrack-CMV, pShuttle-IRES-hrGFP-1、pShuttle-IRES-hrGFP-2、pShuttle-CMV-lacZ,pShuttle-CMV-EGFP-C,pXC1, pBHGE3, 配套大肠杆菌BJ5183,293,293T cellline 腺相关病毒系统（Stratagene）： pAAV-MCS，pAAV-RC，pHelper，pAAV-LacZ，pAAV-IRES-hrGFP，pCMV-MCS，慢病毒载体:pLVX-DsRed-Monomer-N1,pLVX-IRES-ZsGreen1,pLVX-AcGFP1-N1,Lenti6/v 5-EDST-EGFP,pWPXL, FUGW,pLentilox 3.7,RNAi-Ready pSIREN-Retro Q,RNAi-Ready pSIREN-Retro Q-ZsGreen,pSUPER.Retro-GFP/Neo,pSUPER-Retro-Neo, pSUPER.Retro-puro,PLNCX PLNCX2 pMSCV-HYG pMSCV-neo pMSCV-puro pLEGFP-C1 pLOX-CW-CRE pLOX-GFP-IRES-TK pRetroX-IRES-DsRedExpress, pLVX-IRES-mCherry质粒载体。
酵母菌表面展示操作步骤概述酵母菌表面展示是一种生物学研究和应用领域常用的技术，它通过将目标蛋白质在酵母菌表面进行展示，使其易于高效地表达、分离和纯化。
本文将对酵母菌表面展示的操作步骤进行概述，以帮助读者了解和掌握该技术。
步骤一：构建目标蛋白质基因的表达载体首先，需要将目标蛋白质的基因克隆到适当的酵母菌表达载体中。
常用的载体包括酿酒酵母（Saccharomyces cerevisiae）和毕赤酵母（Pichia pastoris）。
在构建载体时，应确保目标蛋白质的基因序列正确无误，并与载体正确连接。
步骤二：转化酵母菌将构建好的表达载体转化到酵母菌中。
转化可以使用电穿孔法、乙醇法、锂酸法等多种方法进行。
转化后的酵母菌需要在适当的培养基上进行培养，以确保其正常生长和表达目标蛋白质。
步骤三：筛选表达蛋白质的阳性克隆经过一段时间的培养后，可以进行表达蛋白质阳性克隆的筛选。
一种常用的筛选方法是通过使用特定抗体或其他与目标蛋白质的结合能力相关的探针进行免疫检测或筛选。
步骤四：表达蛋白质的定性和定量分析对阳性克隆进行表达蛋白质的定性和定量分析，以确定其表达水平和活性。
常用的方法包括Western blot、ELISA、流式细胞术等。
步骤五：优化表达条件根据定性和定量分析的结果，可以进行表达条件的优化。
优化表达条件包括培养基成分的调整、温度、pH值、诱导剂的浓度和诱导时间等因素的优化，以提高目标蛋白的表达效率和活性。
步骤六：表达蛋白质的分离和纯化经过优化的表达条件后，可以进行目标蛋白质的分离和纯化。
常用的方法包括亲和层析、离子交换层析、为基础的层析等。
根据目标蛋白质的特性和需求，选择合适的纯化方法进行分离和纯化。
步骤七：确认目标蛋白质的展示效果经过分离和纯化后，需要确认目标蛋白质在酵母菌表面的展示效果。
常用的方法包括免疫荧光染色、流式细胞术等。
通过这些方法可以确定目标蛋白质是否成功地在酵母菌表面进行了展示。
总结：酵母菌表面展示是一种常用的生物学研究和应用技术，通过将目标蛋白质在酵母菌表面进行展示，以方便其高效表达、分离和纯化。
毕赤酵母是甲醇营养型，甲醇代谢的第一步是:醇氧化酶利用氧分子将甲醇氧化为甲醛和过氧化氢.为避免过氧化氢的毒性，甲醛代谢主要在过氧化物酶体里进行，使得有毒的副产物远离细胞其余组分。
由于醇氧化酶与O2 的结合率较低，因而毕赤酵母代偿性地产生大量的酶。
而调控产生醇氧化物酶的启动子也正是驱动外源基因在毕赤酵母中表达的启动子。
毕赤酵母含有两种醇氧化物酶，AOX1 AOX2。
细胞中大多数的醇氧化酶是AOX1 基因产物。
甲醇可紧密调节、诱导 AOX1 基因的高水平表达，为Mut+菌株,可占可溶性蛋白的 30％以上。
AOX2 基因与 AOX1 基因有 97％的同源性，但在甲醇中带 AOX2 基因的菌株比带 AOX1 基因菌株慢得多,通过这种甲醇利用缓慢表型可分离 Muts 菌株。
毕赤酵母表达外源蛋白：分泌型和胞内表达。
利用含有α因子序列的分泌型载体即可。
翻译后修饰:酿酒酵母与毕赤酵母大多数为 N—连接糖基化高甘露糖型，毕赤酵母中蛋白转录后所增加的寡糖链长度(平均每个支链 8-14 个甘露糖残基）比酿酒酵母中的(50—150 个甘露糖残基）短得多。
菌株:GS115 （ Mut+, Muts)和 KM71（Muts）分泌型载体:pPICZα A,B,and C(5’AOX1启动子,紧密型调节,甲醇诱导表达，α分泌信号介导的分泌表达,Zeocin抗性基因，C端含有6XHis标签）胞内表达型载体：pPICZ A，B，and C，一：分子克隆1。
设计引物分泌型载体图谱：见酵母表达说明书（p13—pPICZ A，p14-pPICZ B，p15—pPICZ C)2.PCR扩增基因PCR反应体系（50μl）模板DNA 1μlForward Primer（10μM）1μlReverse Primer（10μM）1μldNTP Mixture（各2mM）：4μl5×PrimerSTAR buffer（Mg2+ plus）10μlPrimerSTAR DNA Polymerase 0。
