酿酒酵母、毕赤酵母表达载体

酵母表达引言酵母是一类单细胞真核生物，被广泛应用于生物学研究中。

酵母表达系统是指利用酵母细胞表达外源基因的技术，被广泛应用于蛋白质的高效表达和产量大规模生产。

本文将介绍酵母表达系统的原理、优势和应用。

原理酵母表达系统的核心原理是将外源基因导入酵母细胞，并通过酵母细胞的转录、翻译和修饰机制，使外源基因在酵母细胞中得到表达和功能发挥。

通常情况下，酵母表达系统主要采用酵母菌属的酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)或毕赤酵母(Pichia pastoris)作为宿主细胞。

1.酵母转录机制：酵母细胞的基因表达主要通过RNA聚合酶Ⅱ进行转录，产生mRNA分子。

2.酵母翻译机制：酵母细胞通过核糖体进行翻译，将mRNA翻译成蛋白质。

3.酵母修饰机制：酵母细胞具有多种修饰酶，可以对蛋白质进行翻译后修饰，如糖基化、磷酸化等。

优势相比其他常用的表达系统，酵母表达系统具有一系列的优势：1.高效表达能力：酵母表达系统能够实现高水平的外源基因表达，产量可达到克级。

2.翻译后修饰：酵母细胞具有多种修饰酶，可以对蛋白质进行翻译后修饰，使蛋白质得到正确的糖基化等修饰。

3.生长条件简单：酵母菌生长条件相对简单，可以在常规培养基中进行培养，对培养条件的要求相对较低。

4.可溶性蛋白质表达：酵母细胞具有较强的蛋白质折叠和修饰能力，能够高效地表达可溶性蛋白质。

应用酵母表达系统广泛应用于以下领域：1.蛋白质研究：酵母表达系统可用于大规模蛋白质表达和纯化，为蛋白质的结构、功能和相互作用研究提供了高效的工具。

2.药物筛选：酵母表达系统可用于药物靶点鉴定和药物分子筛选，加速药物研发过程。

3.疫苗研究：酵母表达系统可用于疫苗候选抗原的高效表达和产量大规模生产。

4.代谢工程：酵母表达系统可用于代谢工程领域，利用酵母细胞对外源代谢产物的高效合成能力，实现产生复杂化合物的目标。

5.生物制药：酵母表达系统已经被广泛应用于生物制药领域，用于生产重组蛋白和抗体等生物药物。

毕赤酵母常用培养基与载体一、毕赤酵母表达常用载体：典型的巴斯德毕赤酵母表达载体载体包含醇氧化酶－1（AOX1）基因的启动子和转录终止子（5'AOX1和3'AOX1），它们被多克隆位点（MCS）分开，外源基因可以在此插入。

此载体还包含组氨醇脱氢酶基因（HIS4）选择标记及3'AOX1区。

当整合型载体转化受体时，它的5'AOX1和3'AOX1能与染色体上的同源基因重组，从而使整个载体连同外源基因插入到受体染色体上，外源基因在5'AOX1启动子控制下表达。

毕赤酵母本身不分泌内源蛋白，而外源蛋白的分泌需要具有引导分泌的信号序列。

而由89个氨基酸组成的酿酒酵母的分泌信号—α交配因子(α-factor)引导序列已经成功地引导了几种外源蛋白的分泌。

分泌表达载体主要有：pPIC9，pPIC9K，pHIL-S1，pPICZα A，pYAM75P等。

胞内表达载体主要有：pHIL-D2，pA0815，pPIC3K，pPICZ，pHWO10，pGAPZ，pGAPZa(Invitrogen)，pPIC3.5K等。

工程菌株Y11430，MG1003，GS115 （AOX1），KM71，SMD1168。

毕赤酵母宿主菌常用的有GS115和KM71两种，都具有HIS4营养缺陷标记。

其中，GS115茵株具有AOX1基因，是Mut＋，即甲醇利用正常型；而KM71菌株的AOX1位点彼ARG4基因插入，表型为Muts，即甲醇利用缓慢型，两种菌株都适用于一般的酵母转化方法。

多拷贝表达菌株的获得方式：与自主复制的质粒型表达载体不同，整合型表达载体的拷贝数可以有很大的变化。

含多拷贝外源基因的表达菌株合成蛋白的量也较多。

体内整合可通过高遗传霉素抗性，筛选可能的多拷贝插入；而体外整合可通过连接产生外源基因的串联插入。

多拷贝表达菌株的获得方式有两种：一种是利用SDS-PAGE 电泳、免疫杂交或菌落点杂交方法在大量的转化子中进行自然筛选。

利用强效可调控启动子AOX，已高效表达了HBsAg、TNF、EGF、破伤风毒素C片段、基因1工程抗体等多种外源基因［11、12、13］，证实该系统为高效、实用、简便，以提高表达量并保持产物生物学活性为突出特征的外源基因表达系统，而且非常适宜扩大为工业规模［14］11. 彭毅，杨希才，康良仪。

影响甲醇酵母外源蛋白表达的因素。

生物技术通报2000，4：33-3612. 11 3 Cregg JM . Tschopp JF Stillman C, et al .High-level expression and efficient assembly of hepatitis B surface antigen in the methylotrophic yeast pichia.pastoris Bio/Technology,1987,5:479-48513. Sreekrishma K , Nelles L ，Potenz R，et al .High-level expression ,purification ,and characterization of recombinant human tumor necrosis factor synthesized and characterization in the methylotrophic yeast pichia .pastoris ,Biochemistry ,1989,28:4117-412514. Siegel RS , Buckholz RG, Thill GP , et al .Production of epider growth factor in methylotrophic yeast cells, International Patent Application ,1990 ,Publication No:WO90/10697毕赤酵母是甲醇营养型酵母，可利用甲醇作为其唯一碳源。

Mut+ 和Muts毕赤酵母中有两个基因编码醇氧化酶一一A0X1及A0X2细胞中大多数的醇氧化酶是AOX1基因产物，甲醇可紧密调节、诱导AOX1基因的高水平表达，较典型的是占可溶性蛋白的30%以上。

AOX1基因调控分两步：抑制/去抑制机制加诱导机制。

简单来说，在含葡萄糖的培养基中，即使加入诱导物甲醇转录仍受抑制。

为此，用甲醇进行优化诱导时，推荐在甘油培养基中培养。

注意即使在甘油中生长（去抑制）时，仍不足以使AOX1基因达到最低水平的表达，诱导物甲醇是AOX1基因可辨表达水平所必需的。

AOX1基因已被分离，含AOX1启动子的质粒可用来促进编码外源蛋白的目的基因的表达。

AOX2基因与AOX1基因有97%的同源性，但在甲醇中带AOX2基因的菌株比带AOX1基因菌株慢得多，通过这种甲醇利用缓慢表型可分离Muts菌株。

在YPD酵母膏、蛋白豚、葡萄糖）培养基中，不论是Mut+还是Muts其在对数期增殖一倍的时间大约为2h ° Mut+和Muts菌株在没有甲醇存在的情况下生长速率是一样的，存在甲醇的情况下，Mut+在对数期增殖一倍的时间大约为4至6个小时，Muts在对数期增殖一倍的时间大约为18个小时。

菌株GS115 > X- 33、KM71 和SMD1168 的区另I]GS115、KM71和SMD1168等是用于表达外源蛋白的毕赤酵母受体菌，与酿酒酵母相比，毕赤酵母不会使蛋白过糖基化，糖基化后有利于蛋白的溶解或形成正确的折叠结构。

GS115 > KM 71 ' SMD1168在组氨酸脫氢酶位点（His4）有突变，是组氨酸缺陷型，如果表达载体上携带有组氨酸基因，可补偿宿主菌的组氨酸缺陷，因此可以在不含组氨酸的培养基上筛选转化子。

这些受体菌自发突变为组氨酸野生型的概率一般低于10-8。

GS115表型为Mut+，重组表达载体转化GS115后，长出的转化子可能是Mut+，也可能是Muts （载体取代AX01基因），可以在MM和MD培养基上鉴定表型。

酵母表达体系构建酵母表达体系是一种常用的基因表达系统，可以用于生产重组蛋白质、疫苗、抗体等生物制品。

构建酵母表达体系需要选择合适的酵母菌种、载体、目的基因以及必要的宿主细胞，并通过基因克隆、转化、筛选等一系列步骤实现。

本文将详细介绍酵母表达体系的构建过程。

一、选择酵母菌种和载体1．酵母菌种选择：根据需要表达的蛋白质的种类和性质，选择适合的酵母菌种。

常用的酵母菌种有Saccharomyces cerevisiae（酿酒酵母）、Pichia pastoris（毕赤酵母）等。

2．载体选择：载体是携带目的基因进入宿主细胞的必要元件，常用的载体包括质粒、整合型载体和噬菌体载体等。

在构建酵母表达体系时，应根据目的基因的性质和表达量要求选择合适的载体。

二、目的基因的克隆和鉴定1．基因克隆：将目的基因插入到载体中，形成重组DNA分子。

可以通过PCR、基因文库等方法获取目的基因，也可以从基因组或cDNA文库中筛选出目的基因。

2．转化宿主细胞：将重组DNA分子导入到宿主细胞中，常用的方法包括电穿孔法、转化法等。

3．阳性克隆筛选：通过菌落PCR或 southern 杂交等方法筛选出含有目的基因的阳性克隆。

4．序列分析：对阳性克隆进行序列分析，确保目的基因正确插入载体中，并且没有发生任何突变。

三、构建酵母表达体系1．质粒制备：从阳性克隆中提取重组质粒，并进行纯化和鉴定。

2．转化酵母细胞：将重组质粒转化到酵母细胞中，常用的方法包括电穿孔法、热激法等。

3．筛选阳性克隆：通过 southern 杂交等方法筛选出含有重组质粒的阳性克隆。

4．鉴定表达产物：对阳性克隆进行蛋白质表达水平检测，常用的方法包括 western 杂交、ELISA等。

同时对表达产物进行生物活性检测，以评估表达产物的质量和功能。

5．优化表达条件：通过对培养条件（如温度、pH值、营养物质浓度等）进行优化，提高目的基因的表达水平和产量。

6．生产与纯化：在优化条件下进行大规模培养和表达，并对表达产物进行纯化和加工，以满足实际应用需求。

毕赤酵母常用培养基与载体一、毕赤酵母表达常用载体：典型的巴斯德毕赤酵母表达载体载体包含醇氧化酶－1（AOX1）基因的启动子和转录终止子（5'AOX1和3'AOX1），它们被多克隆位点（MCS）分开，外源基因可以在此插入。

此载体还包含组氨醇脱氢酶基因（HIS4）选择标记及3'AOX1区。

当整合型载体转化受体时，它的5'AOX1和3'AOX1能与染色体上的同源基因重组，从而使整个载体连同外源基因插入到受体染色体上，外源基因在5'AOX1启动子控制下表达。

毕赤酵母本身不分泌内源蛋白，而外源蛋白的分泌需要具有引导分泌的信号序列。

而由89个氨基酸组成的酿酒酵母的分泌信号—α交配因子(α-factor)引导序列已经成功地引导了几种外源蛋白的分泌。

分泌表达载体主要有：pPIC9，pPIC9K，pHIL-S1，pPICZα A，pYAM75P等。

胞内表达载体主要有：pHIL-D2，pA0815，pPIC3K，pPICZ，pHWO10，pGAPZ，pGAPZa(Invitrogen)，pPIC3.5K等。

工程菌株Y11430，MG1003，GS115 （AOX1），KM71，SMD1168。

毕赤酵母宿主菌常用的有GS115和KM71两种，都具有HIS4营养缺陷标记。

其中，GS115茵株具有AOX1基因，是Mut＋，即甲醇利用正常型；而KM71菌株的AOX1位点彼ARG4基因插入，表型为Muts，即甲醇利用缓慢型，两种菌株都适用于一般的酵母转化方法。

多拷贝表达菌株的获得方式：与自主复制的质粒型表达载体不同，整合型表达载体的拷贝数可以有很大的变化。

含多拷贝外源基因的表达菌株合成蛋白的量也较多。

体内整合可通过高遗传霉素抗性，筛选可能的多拷贝插入；而体外整合可通过连接产生外源基因的串联插入。

多拷贝表达菌株的获得方式有两种：一种是利用SDS-PAGE电泳、免疫杂交或菌落点杂交方法在大量的转化子中进行自然筛选。

酵母菌表面展示的蛋白质工程操作步骤酵母菌表面展示的蛋白质工程是一种重要的技术手段，可以用于研究蛋白质的结构与功能，以及开发新型的药物和生物材料。

下面将介绍酵母菌表面展示的蛋白质工程的操作步骤。

1. 选择适当的酵母菌株选择适合表面展示蛋白质的酵母菌株，常用的有酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)和毕赤酵母(Hansenula polymorpha)。

根据实验的需要，选择相应的酵母菌株。

2. 构建融合蛋白的表达载体将目标蛋白与酵母菌表面展示蛋白的结构域进行融合，并将融合蛋白的基因插入酵母菌表达载体中。

选择适当的启动子、选择子和标签，确保融合蛋白的高效表达和方便检测。

3. 转化酵母细胞将构建好的表达载体导入酵母菌细胞中，通常采用化学法或电转化法将外源DNA转化到酵母细胞内。

经过培养和筛选后，得到表达目标蛋白的转基因酵母菌株。

4. 表达目标蛋白将转基因酵母菌株进行培养，提供适当的培养基和条件，促使目标蛋白的高效表达。

可以通过检测培养基中目标蛋白的浓度和预测蛋白的位置来确定表达效果。

5. 表面展示目标蛋白利用酵母菌表面展示蛋白质的特性，通过分子生物学的手段，使得目标蛋白质能够在酵母菌表面展示出来。

常用的方法有融合目标蛋白与表面展示蛋白的结构域、或者通过添加信号肽等方式，在酵母菌细胞表面定向展示目标蛋白。

6. 鉴定和纯化目标蛋白使用合适的实验方法和技术手段，对表面展示的目标蛋白进行鉴定和纯化。

例如，可以利用抗体的特异性进行检测，或者利用亲和层析等技术进行纯化。

7. 评估目标蛋白的功能对纯化获得的目标蛋白进行功能评估，例如测试其在特定条件下的结构稳定性、酶活性、配体结合能力等。

同时，还可以对目标蛋白进行结构解析，揭示其功能机制。

总结：酵母菌表面展示的蛋白质工程操作步骤主要包括酵母菌株的选择、构建融合蛋白的表达载体、转化酵母细胞、表达目标蛋白、表面展示目标蛋白、鉴定和纯化目标蛋白以及评估目标蛋白的功能。

酿酒酵母表达载体pYES2,ｐYES２／NT,ｐYＥS２/CT,pYES3,pYES6,pYCｐlａｃ2２-GＦP,酵母载体pAUR12３,pRS３03TEF,pRS30４, pRS305,pRS306,ｐY13ＴEF,ｐY14TEＦ,pY１５TEF,pＹ16TEF,酵母基因重组表达载体pUG6,pＳH４７,酵母单杂载体pHISｉ,pLacZi,pHIＳ2, pGＡD4２4, 酵母双杂交系统:酿酒酵母Y187,酿酒酵母AＨ109;质粒pGADＴ7,pGBＫT７;对照质粒pGBKT7－5３,pGBKT７-lam,pGＡDＴ７-T,PCＬ1,酿酒酵母菌株ＩＮＶＳc1,YM42７1, AH109,Y1８７,Y１９0,毕赤酵母表达载体pPＩＣ9K,pPIC9Ｋ-His,pPＩＣ3.5K,ｐＰICZalｐhaＡ,B,C,ｐP ＩCZA,B,C,ｐGAPZαA,ｐAＯ8１5,pPIC9k-Hｉs,pＨIL-S1,pＰink ｈc,配套毕赤酵母Pｉcｈiaｐiｎk,毕赤酵母宿主Ｘ33,KＭ７１,KM71H,GS115,原核表达载体pQＥ30,31,32,40,60,61,62,等原核表达载体,包括ｐET系列,ｐＥT-GST,pGEX系列(含GＳT标签),pMAL系列pMＡL-c2x,－c4x,－c4e,-c5x,-p5x,pＢＡD,pBAＤHis,ｐＢADmycHis系列,ｐQE系列,pＴｒｃ9９a,pTrcＨis系列,pＢV２2０,22１,222,pTＸＢ系列,ｐLＬP-oｍpA,pIN-III-ompA(分泌型表达系列),pQBI6３(原核表达带荧光)pEＴ3a, pET 3d, pET 11a,ｐEＴ12a, ｐEＴ14b, ｐＥT 15b, pＥT 16b, pＥT 17b,pET 19b, pET 2０b, pET 21a,b,d, pET ２2b,ｐET ２3a,ｐET 23b, pET24a,b,pET ２5ｂ, pET 2６b, ｐEＴ27b, pET ２8a,b, pET 29a,pET 30a, pET 31b, pET32a, pEＴ35b, pET 38b, pEＴ３９b,pET 40b, pEＴ４１ａ,b pET 42a,pＥT 43、1ａ,b pET 44ａ, ｐEＴ49ｂpEＴ３０2,303 pET His,pET Dsｂ,ｐET GST,ｐＥT Trx pＱE2, ｐQE9 pQE30,31,32, pQE 4０ｐQＥ７０pQE80L pＱＥTirs sｙstem pR ＳET-A pRSEＴ-B pRSET－C pGEX4T-1,-2,－3,５ｘ-１,6p-1,６p-2,2ｔk,3c ｐＢV22０,221,222 ｐTrcHisA,B,C pBAD24,34,43 pBAＤＨｉsＡ,B,C pPinPoiｎｔ-Ｘa1,Xa2,Xａ3 pMALc2x, p2x pＢV220 pGEM Ex1, pGEＭ7ZF(+), pＴrｃ99Ａ,ｐTwin1, pEZZ18ｐkk232－８,pｋk ２33-３,pAＣYＣ１８4,pBR３２2,ｐUC119 pＴYB1,pTYB2,pTYB4,pTＹB11 pＢlueＳcript SK(+),pＢlueSｃript SK(－) ｐLＬP ompA, ｐＩNIIIomｐA,ｐMＢP-P,pＭBP-Ｃ, 大肠杆菌冷激质粒: p ＣｏｌdＩpColｄII ｐColdIIＩpCｏldTF 原核共表达质粒:pＡCYCｄuet－1,ｐＥTｄuet-1,pＣＤFdｕｅt-1,ｐＲＳFduet－1 Ｔakara公司大肠杆菌分子伴侣: p Ｇ-KＪＥ8 ｐGro7 pKJE7 pＧＴｆ２ｐTf１6 大肠杆菌宿主细胞: DH5a JM101 JＭ103 ＪＭ105 JM107 JＭ１０9JM110Top1０Toｐ１０F ＢL21(ＤE３) HB１01 ER252９Ｅ２５66 C256６MＧ1655XL－10goｌd ＸＬblue Ｍ15 JＦ11２5K802 SＧ111７BL21(ＡI) BL21(DＥ3)plysS TG1 TB1 DH5ａ(ｐir) Tuner(DＥ3) Bl21 codonplusRIPL Novablue(ＤE3)RosettａＲｏsetｔa(DE3) Ｒoseｔｔa(DＥ３)plysＲosetta－ｇamｉ(ＤＥ3) Ｒｏseｔta-ｇａmiＢ(DＥ3), Ｒｏsettａ-ｇａmiB(DＥ3)plysS Orｇami(DＥ３)ＯrｇamiB(DE3) HMS174(DＥ3)植物表达／ＲNＡi载体农杆菌pＢI121,pBＩ12１-ＧFＰ,pBI101,pＢI2２1,pSN1301, pＵN1３01,pRTL２, pRＴL2-GFP ,pRTL2-CFP,pRTL2-RFＰ, pRＴL2-YFP,pCAMＢIＡ１３00, １301, １３0２,１303,１304,１305, 1３8１Z,13９1Z,230０, 2301,330０,３301,pＣAMBIA suｐer13００,ｐCAMBIＡsupeｒ1300－GFＰ,pPZＰ212,pＰＺP２1２1,pPZP21２-ＧＦP,pGDG,RNAi载体pART2７,ｐHAＮＮIBAL,pＫAＮNIBＡL,pＦGＣ５9４1,pTＣK303, pTRV１,pＴRV ２, T－ＤNＡ插入载体(随机突变体库)pSKＩ0１5,ｐSKI07４,真菌ＡTＭT载体p ＢＩG2RHPＨ2-GUＳ-GFＰ,ｐＢHt1枯草芽孢杆菌表达载体pWB980,ｐＨT4３,pHP１３,pHＰ４3, pBE2,pMUTＩN4,pUB11０,ｐＥ1９4,ｐMA5, pMＫ３,ｐＭK４,pHT304,pHY300PLK, pＢest5０2,pDＧ1363,pSG1154,pＡX01, ｐＳAS1４4,ｐDＬ,ｐDG148-stu,pDG641,ｐA Ｌ12,ｐUＣX０5-ｂgaB,pHT0１,配套菌株ＢS １６８,WＢ60０,ＷB800,WB7００, WB800N,1０１2,FZB42,1A7４７,广宿主质粒ｐＶＬT３3RNＡi基因沉默干扰敲除载体pSilenｃer1、0,pSｉlencer ２.１-U６hｙｇｒo, pSｉlenｃer 3.1-H1hygｒo,pSilencer 3、１-H1 neo,ｐSileｎcer 4、1-CMＶne ｏ, pSileｎｃｅｒ4、1－CMV puro pMIR－RＥPORT Lｕciferase RNＡi载体(olｉｇoｅngine) pSuｐer-puro RＮＡｉ逆转录病毒载体(cloｎtｅｃh): RＮＡi －Ｒｅady pＳＩREN-Retro Q, RNAi-Reａdy ｐＳIＲEN-ＲｅtroQ-ZsGreeｎ(LuｃiferasｅshRNＡAnneａlｅdＯlｉgonucｌeotiｄe) RNＡi慢病毒载体(addgeｎe): pLKO.1哺乳动物表达载体ｐｃDNA3、1＋/-,pｃDNA4/HｉsＭax B,pSecTaｇ2 A,pVAＸ1,pBｕdCE4.1,pTrａcer CMＶ２,pcＤNＡ３、1(-)/ｍyc－Ｈis A ,pcDNA6-Ｍｙc/His Ｂ,pＣEＰ4,ｐIRES,pIRＥSnｅo,pIRES hyg3,pCMＶ-ｍyc,pCMV－HA,pＩRES-puｒｏ３,ｐIＲＥS-neo3,pCAGGS哺乳动物双杂交系统pACＴ,ｐBIND,pACＴ-MyｏD,pBＩND-Ｉd,pG5luc,pＣMＶ-BD,pCMV－AD, pBD-p5３, ｐＦR-ｌuｃ,CｙtotraｐＴwo－HybrｉｄSysｔem:ｐSｏs, pSoｓMAFＢ, ｐMｙr蜕皮激素诱导系统ｐＩND, ｐVｇＲxR,LacSwith ＩI哺乳动物诱导表达系统:ｐOPＲＳVI ,pOPI3ＣＡＴ,pCMVLacI,GｅneSwitcｈSyｓtｅm:pＳwiｔｃh哺乳动物表面展示系统:pDiｓplａy, 四环素调控系统(Invitrｏｇeｎ):pcＤNA4／TＯ／Myｃ-HiｓA,pcDＮA4/TO/Myc-HiｓB,ｐcDNＡ４/TO/Myc-Ｈis C,ｐｃDNA4/ＴO/Mｙｃ－His/ＬacＺ,pcDNA６/TR四环素调控系统(Cｌｏntech):pTeｔ-On,pTeｔ-Ｏff,ｐTRE2,pRevTRE,pReｖTｅｔ-On,ｐRevTet-off 信号通路报告载体:pＧAS-TA-Ｌｕc,ｐＳTAＴ3-TＡ-Ｌｕc,ｐISRE-TA－Lu ｃ, pTＡ-Luc,pIκB－EＧFＰ,pNFＡＴ-TA－Luc,pCasｐase3-sensor,pAP１(PMA)－Luc;pGL4.26[lｕc2P/ｍｉnＰ/Hｙgro],pGL4.２9[lｕc2Ｐ/ＣＲＥ/Hygｒｏ],pGL４.３0[luc2P/NFAT-RＥ/Ｈygｒo],pGL4、75;p５3-Luc,pAP-1-Lｕc, pNF-κB－Lｕc,pSRE-Lｕc,pFＡ２-Elk１,pFC-ＭＥKK,pFR-luc,Gaｔeｗａy系统(inviｔrｏｇen)pcDNＡ6、2－GＷEmＧFP-miR ｎegａtive, pＬeｎｔi6／TR,pcDNＡ6、２-GＷEmＧFP-mｉR,乳酸菌表达载体及各种乳酸菌乳酸杆菌菌株,pNZ8148,pLEISS,pMG3６e,ｐBB Ｒ1ＭCＳ-5,pBBＲ1MCＳ－6,ｐＲV61０,pLＥＭ4１5,ｐＨY300ＰLＫ,分泌型乳酸菌表达载体pVＥ5523,pＰG611、1,pＰG６１２.1等与乳酸杆菌菌株宿主菌NZ ９００0,ＭG13６3,Laｃtoｂaｃｉｌluｓcaｓei １.539,Ｌacｔｏbacｉｌｌuｓcasei,acidophilｕsＮCFM,1、2,Lactobaciｌｌus sａkei 23K,Ｌ、planｔaｒuｍ,L.rh ａmnosus GG,B、ｃoaguｌans,Biｆidobactｅrium ｂiｆiduｍ,Ｂifidｏbactｅrｉｕｍinfantis,Laｃtococcus lacｔｉs M17,1663,Lactobａcillus reuｔｅrii广宿主表达载体链球菌表达敲除载体假单胞菌表达载体pVLT33,pBBR1MＣS-2,3,4,5,6, ｐJＲD2１５,pJN105,ｐＭE60３２,Ｃos载体pLＡＦR３,pMP2444(ＧFＰ),pHY３00ＰLＫ,pＲT1０２,pRＬ１0６3a, 转座子载体ｐUT-minｉＴn ５,pMＧS100,pWHＭ10,pKＣ1139,pＳＥT１52,pOJ260,pPＧ６11、1,ｐPG6１2、1,腺病毒载体/慢病毒,逆转录病毒表达载体及包装包膜质粒,腺病毒系统(Strａtagene): pAdEａsy-1,pSｈuttle-CＭＶ,pShutｔｌe,pAdTrack,pAdＴracｋ-CＭV, ｐＳhuttle-ＩRＥS-ｈrＧＦP-１、pShuttle-IRＥS－hｒＧＦP-2、pShuttlｅ-CMV-lacZ, pShuｔtｌe－CMV-EGＦP-Ｃ,pXC1, pBHGE3, 配套大肠杆菌BＪ5183,2９３,２93T cｅll ｌｉｎe 腺相关病毒系统(Strataｇene):ｐAAＶ-MCS,pAＡＶ-RＣ,pHｅｌｐer,pAAV-LacZ,pAAＶ-IRES-hrＧFP,pＣMV-MCS,慢病毒载体:ｐLVX-DsRed-Ｍoｎomｅr－N1,pLVX－IREＳ－ZｓGreen1,pLVＸ-AcＧFP1-N1,Lｅｎti6/v5-EDST－EＧFP,pＷPXL, FＵGW,pLeｎｔilox 3、7,ＲNＡｉ－ReａｄｙpＳIREN-Reｔro Ｑ, RNＡi-Ready pSIREN－Retro Q－ＺsGreen, ｐSUＰEＲ、Rｅtro-ＧＦP／Neo,ｐＳUPER-Ｒetrｏ-Ｎeo, pSUPＥR.Retro-puro,PLＮＣＸPLNＣX2 pMＳＣV-HYG pMSCＶ-ｎeo ｐＭSCＶ-puro pLEGFP-C1 ｐLＯX-CW-CRE pＬOＸ-GFP-IＲＥS-TK pRｅtｒoＸ－IREＳ-ＤsＲｅdExprｅsｓ, pLVX-ＩRＥS-ｍＣherry质粒载体。

酵母菌表面展示操作步骤之表面展示实验设计和结果分析酵母菌表面展示是一种常用的技术手段，利用该技术可以将目标蛋白质在酵母菌表面展示出来，实现对蛋白质功能和相互作用的研究。

本文将介绍酵母菌表面展示实验的设计和结果分析步骤。

一、实验设计1. 酵母菌品种选择：根据需要展示的蛋白质类型和所要研究的功能，选择合适的酵母菌品种。

常用的酵母菌品种有Saccharomyces cerevisiae（酿酒酵母）和Pichia pastoris（毕赤酵母）。

2. 表达载体选择：根据需求选择合适的表达载体，常用的有pCTCON、pCTCON2、pPICZ和pET等。

需要根据载体的特点进行合理设计，了解载体能否适应目标蛋白质的表达和展示。

3. 构建重组质粒：将目标蛋白质的编码序列克隆到选择的表达载体中。

可以利用PCR、限制性内切酶切割、连接酶反应等方法完成质粒构建。

4. 酵母菌转化：将构建好的重组质粒导入酵母菌中。

常用的转化方法有质粒导入法、电转化法和化学转化法等。

5. 筛选表达阳性克隆：通过选择性培养基或适当的筛选标记，筛选出表达目标蛋白的酵母菌阳性克隆。

二、结果分析1. 表达确证：通过Western blot、ELISA等蛋白质检测方法，对筛选出的阳性克隆进行蛋白质表达确证。

可以使用特异性抗体对目标蛋白质进行特异性检测。

2. 表面展示检测：通过流式细胞术、荧光显微镜观察等方法，对表达阳性的酵母菌进行表面展示检测。

可以利用荧光标记的抗体或成像技术对表面展示的目标蛋白质进行定性和定量分析。

3. 蛋白质功能研究：利用表面展示的酵母菌，进行蛋白质功能研究。

可以通过蛋白质-蛋白质相互作用实验、底物结合实验等方法，研究目标蛋白质在酵母菌表面的功能。

4. 应用研究：根据实验结果，对酵母菌表面展示技术的应用进行评估和探索。

可以进一步研究目标蛋白质在医药、工业生产等领域的应用潜力。

总结：酵母菌表面展示技术是一种功能研究常用的实验手段，通过合理的实验设计和结果分析，可以获得高效的表面展示效果和可靠的实验数据。