PH1138 过氧化物酶染色液联苯胺法实验方法

过氧化物酶染色Washburn法1.实验原理粒细胞和部分单核细胞的溶酶体颗粒中含有过氧化物酶，pox能分解H2O2释放出新生氧，使四甲基联苯胺氧化成联苯胺蓝，后者与亚硝基铁氰化钠结合，再进一步氧化形成稳定的蓝色物质，沉淀于酶活性的细胞质内。

2.标本采集2.1病人准备：了解病人是否对局麻药有过敏史。

凝血因子严重缺陷引起的出血性疾病，穿刺部位有炎症或有畸形，晚期妊娠妇女作骨髓穿刺时要慎重。

2.2标本种类：新鲜抽取的骨髓穿刺液2.3标本采集要求2.3.1高压消毒的穿刺针，一次性无菌手套和抽取骨髓液的无菌注射器。

2.3.2临床上首选穿刺部位为髂后上棘；翻身困难，需多部位穿刺患者可选择髂前上棘为穿刺部分。

小于3岁的小儿还可选择胫骨头内侧为穿刺部位。

3.标本储存：室温避光处保存，若不能及时测定，可采用95％乙醇固定2分钟，可保存数天。

4.标本运输：室温运输5.标本拒收的标准：溶血、稀释标本不能作测定。

6.试剂6.1试剂名称：血细胞pox染色试剂6.2试剂生产厂家：上海太阳生物技术公司6.3试剂组成试剂1：poxⅠ液（紫红色）2℃-8℃避光保存，有效期六个月。

试剂2：poxⅡ液（无色）2℃-8℃避光保存，有效期六个月。

试剂3：95％乙醇，室温避光保存。

试剂4：瑞氏染液，室温避光保存。

7.操作步骤7.1新鲜涂片滴加Ⅰ液数滴（覆盖血膜为宜），室温放置1分钟，勿冲洗即滴加Ⅱ液数滴，混合后室温放置5分钟，流水冲洗。

7.2滴加95％乙醇脱色，水洗后瑞氏染色，复染后镜检观察结果。

8.结果判断8.1阳性—细胞内出现棕黄或蓝黑色颗粒沉淀物质，定位于胞质。

8.2阴性—细胞内无棕黄色或蓝黑色颗粒。

9.临床意义9.1粒细胞系统呈集中状粗颗粒强阳性反应，单核细胞系统呈弥散状颗粒弱阳性反应，部分原始单核细胞可呈阴性反应。

网状细胞及吞噬细胞有不同程度的阳性。

9.2淋巴细胞系、红细胞系、巨核细胞系、浆细胞系等均为阴性反应。

10.操作性能：快速简便，特异性强，灵敏度高。

过氧化物酶(POD)同工酶聚丙烯酰胺凝胶电泳一、目的1、了解聚丙烯酰胺凝胶电泳原理。

2、了解聚丙烯酰胺凝胶的制作过程。

3、了解过氧化物酶同工酶电泳过程。

二、实验原理：1、聚丙烯酰胺凝胶电泳原理及影响电泳的主要因素带电粒子在电场中向与其自身带相反电荷的电极移动，这种现象称为电泳。

用电泳技术分离、分析蛋白质、酶、核酸等生物大分子，有较高的分辨率，目前已成为生物科学研究中必不可少的手段之一。

带电离子在电场中的泳动速度（1）和迁移率（泳动度）（2）由（2）式可以看出，凡能影响溶液粘度η的因素如温度，影响分子带电量q及解离度a的因素如pH的改变，都会对迁移率产生影响。

因此，电泳应尽可能在恒温条件下进行。

并选用一定pH的缓冲液。

同时，所选用的pH以能扩大各种被分离物质所带电荷量的差异为好，以利于分离各种成分。

迁移率与粒子的大小（r）有关，非球形粒子（如DNA）在电泳过程中会受到更大的阻力，即粒子的移动速度还与粒子形状有关。

另外，迁移率还受电渗现象的影响。

所谓电渗是指在电场中，液体对于固体支持物的相对移动。

例如在纸电泳中，由于滤纸（纤维素）上带有负电荷，因感应相吸而使与滤纸相接触的水溶液带正电荷，从而使液体向负极移动，带动着本来是向负极泳动的物质以更快的速度移动。

因此，电泳时应避免用高电渗物质作支持介质。

聚丙烯酰胺凝胶结构中不带电荷，在电场中电渗现象极为微小。

这些特点，使得聚丙烯酰胺凝胶适合作区带电泳的支持介质。

最后，要考虑选用离子强度适宜的溶液。

一般低离子强度比较合适，因为此时导电性低，产生的热量较少。

同时可使被分离的带电离子对电流贡献最大从而加快电泳速度。

但也不能过低，它必须可以缓冲被分离样品中带电离子对凝胶pH的影响，且过低的离子强度易导致蛋白质凝聚。

一般最适的离子强度在0.01～0.1mol/L之间。

最常见的为0.05。

在稀溶液中，离子强度Ⅰ可用下式计算：Ⅰ＝1/2ΣmiZi2 (3)（3)式中，mi为离子的摩尔浓度，Zi为离子的价数。

过氧化物酶染色标准操作程序1.检验目的通过对血细胞内过氧化物酶的染色测定，可用于白血病细胞的鉴别与分型。

2.检测原理血细胞内过氧化物酶（POX）能将无色的二氨基联苯胺的氢原子转移给过氧化氢，使前者变为有色染料沉积在细胞质酶所在部位。

1.标本新鲜的骨髓细胞涂片及血液细胞涂片。

2.试剂联苯胺液(A液)、H2O2(B液) 、瑞姬氏染液(C液) 、磷酸盐缓冲液(D液) 3.环境和安全5.1环境温度要求：2~8℃保存,有效期12个月。

5.2安全控制：工作中所有与病人的样本接触或有潜在性接触可能的样本都视为污染物。

在操作时有必要穿戴保护性的工作服、外套和手套。

在处理废弃样本时不可触摸废弃物，一定戴手套和护目镜以避免直接接触。

如果操作人员不小心接触血液、试剂、废弃物/皮肤或衣物上沾到了样本、试剂及废液，用大量清水冲洗并适当考虑必要的医疗措施。

4.操作步骤6.1新鲜的涂片滴加A染色液数滴(以覆盖涂片为宜),再滴加B染色液数滴(A 液:B液=1:1),混合后室温染色5~10分钟,流水冲洗2分钟，待干。

6.2然后用瑞姬氏染色(C液)与磷酸盐缓冲液(D液)1:2比例混合，对其染色3~5分钟,流水冲洗,干后镜检。

7.检验结果解释阴性------胞质内无沉淀物（无色）阳性------胞质内出现棕黄或蓝黑色沉淀物8.实验室临床解释8.1粒细胞系统呈集中状颗粒强阳性反应，单核细胞系统呈弥散状颗粒弱阳性反应，部分原始单核细胞可呈阴性反应。

8.2淋巴细胞系、红细胞系、巨核细胞系、浆细胞系等均为阴性反应。

8.3在白血病细胞的鉴别与分型中的应用：强阳性提示：FAB中的M1，M2，M3；部分强阳性与弥散状弱阳性提示：FAB中的M4；弥散状弱阳性提示：FAB中的M5；阴性提示：FAB中的M0，M5，M6，M7，ALL等。

9.变异潜在来源若样本采集后不能及时测定，可采用95%乙醇固定2分钟后，可保存数天。

宜可使用某些抗凝血（肝素、EDTA），样本在未染色前切勿沾有甲醇和氧化剂类试剂，以免细胞内的过氧化物酶被抑制或破坏。

过氧化物酶(POX)染色[原理]粒细胞和单核细胞脑浆内含过氧化物酶，能借助受体(联苯胺)脱氢催化过氧化氢而释放新生氧。

受体被氧化成联苯胺蓝。

再与亚硝基铁氰化钠结合成稳定的蓝色颗粒而沉淀于脑浆内。

[试剂]1．联苯胺溶液：联苯胺0．38，加36％亚硝基铁氰化钠溶液1ml，再取95％乙醇加到100ml，水浴加热助溶。

贮于棕色瓶中，可保存数月。

工作时应小心溶液污染皮肤。

2.稀双氧水：临用前将30％双氧水用蒸馏水1：80稀释。

[操作](1)新鲜干燥血片或骨髓片，加联苯胺液5—8滴，使布满整张涂片，固定1—2分钟。

(2)加等量稀双氧水，用吸球吹吸，使两液混匀，作用4—8分钟。

(3)涂片用流水冲洗。

待干后再用瑞氏染液复染，复染时间约30分钟。

[结果观察]可报告阳性程度或阳性细胞％。

阴性：无蓝色颗粒和蓝色物质。

弱阳性：蓝色颗粒量少且细小，相当于(十)。

阳性：‘蓝色颗粒量多，粗细不一。

相当于(++)。

强阳性：细胞充满粗大紧密蓝色颗粒。

相当于(+++）。

[临床意义](1)粒系统细胞除早期原粒细胞阴性外，晚期原粒细胞及以下各阶段细胞均含有不同程度的蓝色颗粒。

嗜酸性粒细胞颗粒更粗大，呈深蓝色。

嗜碱性细胞为阴性。

(2)单核细胞中，除早期原始阶段外，皆呈弱阳性反应，其颗粒细小稀疏。

(3)某些网状细胞及吞噬细胞可呈不同程度的过氧化物酶阳性反应。

(4)所有淋巴细胞过氧化物酶染色皆为阴性。

(5)该化学染色是区别急性淋巴细胞性白血病和急性非淋巴细胞性白血病的关键化学染色。

FAB分型规定前者阳性率＜3％。

编写：谢平制定日期：2011.12.1[附注](1)联苯胺溶液若明显变色发绿，应重新配制。

(2)亚硝基铁氰化钠溶液也可在临用前取0．368溶解于1ml蒸馏水中，加热助溶后应用。

(3)双氧水浓度若过高，则有抑制酶作用。

双氧水浓度太高、制片太厚、涂片冲洗不净以及粒细胞破坏过多，可造成假阳性。

涂片中粒细胞若看不见阳性颗粒，红细胞呈棕色或绿色，即示双氧水过浓。

项目名称：碱性磷酸酶染色法检验标本：外周血涂片收费标准： 50元检验方法：细胞化学染色原理：在PH9.5时，底物被白细胞的酶水解，释出磷酸根和芳香萘胺，后者与偶氮盐偶合，形成有色沉淀。

试剂：1.固定液（保存于4℃）冰箱2. 0.05缓冲液（PH9.4~9.6）保存于4℃冰箱3.底物4.二甲基甲酰胺5.固紫B操作步骤：1.血片或髓片放置4C固定液中30秒，流水冲洗，空气晾干2.工作液：（1）用二甲基甲酰胺溶解底物后，倒入缓冲液中（2）再加入固紫B混匀3.把固定后的玻璃片放入工作液中，置37C水温箱45分钟4.流水冲洗5.苏木精复染6.流水洗，晾干7.直接油镜观片结果：酶活动处呈亮红颗粒正常参考值：积分10～100分/100个中性分叶核细胞意义：NAP活性增高见于细菌性感染、类白反应、再障、某些肿瘤、急性淋巴细胞白血病、慢性粒细胞白血病急性变等。

NAP活性减低见于慢性粒细胞白血病、急性粒细胞白血病、绿色瘤、红白血病、PNH、病毒感染等。

注意事项：1.外周血涂片标本需新鲜，收到标本后需立即用专用固定液固定。

2.试剂需防在4℃冰箱内，临用前拿出，试剂打开后需立即应用，最长不得超过30min。

项目名称：过氧化物酶染色法检验标本：骨髓涂片收费标准：50元检验方法：细胞化学染色检验原理：过氧化物酶在细胞内的颗粒从H2O2中释放出氧，氧化联苯胺，引起在过氧化酶活性处，沉积棕黑色的化合物。

试剂：1.0.3%联苯胺酒精溶液2.H2O2溶液（3%H2O2+蒸馏水5ml）操作步骤：1.骨髓涂片加0.3%联苯胺酒精溶液10-15滴2.一分钟后，加H2O2溶液10-15滴3.五分钟后，流水冲洗4.再用瑞氏染液复染5.水洗，晒干结果：酶活力处呈棕黑色。

意义：急性白血病中可借过氧化物酶染色区蓓别急淋与急非淋。

急淋POX呈阴性反应，FAB分型规定阳性率＜3%。

急非淋呈阳性反应，阳性率≥3%。

注意事项：1.骨髓涂片标本需新鲜，收到标本后需立即染色。

过氧化物酶染色作业指导书一、原理血细胞内的过氧化物酶分解H2O2，释出初生态氧，使无色联苯胺氧化成蓝色联苯胺，后进一步变成棕黑色化合物，沉着于胞浆内。

二、试剂1、联苯胺染液：联苯胺0.3g ，碱性品红0.3g ，95%乙醇100ml待完全溶解后与亚硝基铁氰化钠饱和水溶液（0.121mol/L）1ml混匀后，置棕色瓶内可室温保存8-10个月。

2、过氧化氢溶液：3%过氧化氢溶液0.3ml ，蒸馏水25ml 此液临用前新鲜配制3、脱色液：95%乙醇4、复染液：瑞氏染液三、操作步骤1、用常法制备骨髓（血）涂片，待干。

2、在新鲜涂片上滴加联苯胺溶液数滴，以覆盖骨髓（血）膜为适，染1min。

3、滴加等量新鲜配制的过氧化氢溶液，轻轻摇动玻片或用洗耳球轻吹液面，使之混匀染色4-5分钟。

4、用流水冲洗1分钟左右。

5、用95%乙醇脱色，脱至红色退尽为止，水洗，待干。

6、用瑞氏染液复染15-20分钟。

7、水洗，待干，镜检。

四、临床意义1、急性粒细胞白血病时，白血病性原始粒细胞可呈阳性反应，阳性颗粒一般较多较粗大，常呈局限性分布；急性淋巴细胞性白血病时，原始淋巴细胞和幼淋巴细胞均呈阴性反应；急性单核细胞白血病时，白血病性原始单核细胞呈阴性反应，有时虽有少数可呈弱阳性反应，但阳性颗粒少而细小，常弥散分布。

2、小型原始粒细胞和原始淋巴细胞不易区别，如果小型原始细胞呈过氧化物酶阳性反应，可确定为小型原始粒细胞。

3、急性早幼粒细胞白血病有时须与急性单核细胞白血病鉴别，如果白血病细胞呈过氧化物酶强阳性反应，应确定为急性早幼粒细胞白血病。

4、成熟中性粒细胞过氧化物酶活性的变化：（1）、活性增高：可见于再生障碍性贫血、感染（特别是化脓菌感染）、急性淋巴细胞性白血病和慢性淋巴细胞性白血病。

（2）、活性减低：可见于急性粒细胞白血病、慢性粒细胞白血病、急性单核细胞白血病、骨髓增生异常综合症、放射病及退化性中性粒细胞。

苏丹黑B（Sudan black B，SB）是一种脂溶性染剂，可溶解于细胞浆内的含脂结构中，使胞质中的脂类物质呈棕黑色或深黑色颗粒。

过氧化物酶染色液(联苯胺法)使用说明货号：G2370有效期：6个月有效。

产品说明：过氧化物酶(Peroxidase，简称POX或MPO)是由微生物或植物所产生的一类能催化很多反应的以过氧化氢为电子受体催化底物氧化的酶氧化还原酶，主要存在于细胞的过氧化物酶体中，以铁卟啉为辅基，可催化过氧化氢氧化酚类和胺类化合物，具有消除过氧化氢和酚类、胺类毒性的双重作用。

过氧化物酶染色液(联苯胺法)是ICSH推荐采用的POX染色液，其原理是细胞内的过氧化物酶能将无色的3,3-二氨基联苯胺(DAB)的氢原子传递给过氧化氢，使前者催化成有色染料沉积在细胞质中的POX所在部位。

该染液可用于血液、骨髓或细胞涂片过氧化物酶染色,POX活性部位呈棕黄色。

自备材料：1、载玻片2、显微镜操作步骤(仅供参考)：1、血液、骨髓或细胞涂片滴加预冷的BFA固定液，4℃固定30～60s，稍水洗。

2、滴加配制好的POX孵育液，室温(20～25℃)避光孵育10～15min，水洗2min。

3、滴加WG染色液，孵育30～60s。

4、直接滴加等量WG buffer，染色10～15min。

5、水洗、晾干、镜检。

染色结果：POX活性部位棕黄色细胞核蓝色粒细胞系除早期原粒细胞阴性外，分化好的原粒细胞以下阶段细胞随细胞成熟而阳性反应增强，衰老中性粒细胞反应程度减弱单核细胞系弱阳性，淋巴细胞系为阴性。

浆细胞及巨核细胞均为阴性。

嗜酸性粒细胞和Auer小体呈强阳性反应。

阳性反应强度的判断：阴性无颗粒弱阳性颗粒小，分布稀疏阳性颗粒粗略。

分布密集强阳性颗粒粗大，呈蓝黑色，充满胞浆临床意义：1、急性粒细胞白血病晚期的原粒细胞呈阳性，颗粒较少且大。

2、急性单核白血病细胞呈阴性或弱阳性，颗粒小且稀疏。

3、单核急性白血病呈阴性或弱阳性。

4、急性早幼粒白血病呈强阳性，某些早幼粒细胞呈阳性，恶性组织细胞呈阴性。

5、急性淋巴细胞白血病呈阴性。

注意事项：1、血液或骨髓涂片应新鲜，薄厚适宜，及时固定，否则会影响酶的活性。