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酶联免疫吸附测定1. 简介酶联免疫吸附测定（enzyme-linked immunosorbent assay, ELISA）是一种常用的体外免疫学实验技术，用于检测目标分子的存在和浓度。
该技术利用酶标记的抗体和抗原之间的特异性结合来实现检测。
ELISA方法的原理基于抗体和抗原之间的高度特异性结合。
通过将抗体或抗原固定在固态表面（如微孔板、膜或滤纸）上，然后使用荧光素酶或酶标记的二抗来特异性地检测目标分子的存在和浓度。
2. 实验步骤2.1. 涂布抗体或抗原首先，需要将抗体或抗原固定在固态表面上，通常是在96孔微孔板上进行。
这一步骤被称为涂布。
涂布抗体或抗原的方法有两种选择：直接涂布和间接涂布。
直接涂布是指将抗体或抗原直接固定在微孔板上。
间接涂布是指首先在微孔板上固定一种辅助抗体，然后再固定目标抗体或抗原。
2.2. 样品处理接下来，需要将待测样品加入到微孔板中。
在加入样品之前，可以对样品进行一些预处理，如稀释、洗涤、乳化等。
2.3. 第一次免疫反应第一次免疫反应是将样品中的目标分子与固定在微孔板上的抗体或抗原结合。
这一步通常需要在适当的温度和时间下进行孵育。
2.4. 洗涤为了去除未结合的物质，需要对微孔板进行洗涤。
洗涤的目的是去除非特异性的结合物，以提高检测的特异性。
2.5. 第二次免疫反应第二次免疫反应是将酶标记的二抗加入到微孔板中，二抗与目标分子结合。
酶标记的二抗可以特异性地识别和结合第一次免疫反应中的目标分子。
2.6. 酶标记物的检测添加了酶标记的二抗后，需要加入底物来激活酶的活性。
酶与底物反应后会生成可检测的颜色或荧光信号。
颜色或荧光信号的强度与目标分子的浓度呈正相关关系，可以通过光度计或荧光计进行测量。
3. 应用3.1. 生物医学研究酶联免疫吸附测定在生物医学研究中有广泛的应用。
它可以用于检测和定量分析蛋白质、细胞因子、荷尔蒙等生物分子的存在和浓度。
3.2. 临床诊断ELISA也是临床诊断中常用的一种检测方法。
酶联免疫吸附测定技术酶联免疫吸附测定技术（Enzyme-Linked Immunosorbent Assay, ELISA）是一种常用的分析方法，广泛应用于生物医学研究和临床诊断。
该技术的原理是利用特异性抗体与待测物发生特异性结合，通过酶的催化作用产生颜色反应或荧光信号，从而得到定量或半定量的结果。
下文将详细介绍ELISA的原理、反应步骤以及其应用领域。
一、ELISA的原理ELISA的原理基于抗原与抗体的特异性结合。
它包括固定期（Coating）、阻断期（Blocking）、结合期（Binding）、洗涤期（Washing）和检测期（Detection）五个关键步骤。
1. 固定期（Coating）首先，在微孔板中将待测物固定在表面，这一步又称为固相抗原法。
通常使用多糖、蛋白质等具有反应性的物质将待测物固定在微孔板上。
固定完毕后，洗去多余的待测物。
2. 阻断期（Blocking）为避免非特异性结合和降低背景干扰，需要在上一步后加入阻断缓冲液，如牛血清白蛋白（BSA）或鱼明胶等，使孔洞表面被占满，阻断非特异性吸附位点。
3. 结合期（Binding）加入待测样本和特异抗体，特异抗体可与待测物发生特异性结合，形成抗原-抗体复合物。
一般将待测物样本加入微孔板后，经过一段时间的孵育，使抗原与特异抗体发生结合。
4. 洗涤期（Washing）在结合期后，需进行洗涤步骤以去除未结合的物质。
洗涤缓冲液通常使用含有洗涤剂的磷酸盐缓冲液，洗涤次数及力度需充分保证去除干净。
5. 检测期（Detection）在洗涤期后，加入与特异抗体结合的酶标记二抗，例如辣根过氧化物酶（HRP）标记的抗兔IgG。
经过孵育后，待测物与酶标记二抗形成复合物。
最后，加入底物使酶催化反应产生颜色或荧光信号。
二、ELISA的应用领域ELISA技术在生物医学研究和临床诊断中具有广泛的应用。
1. 生物医学研究ELISA被用于检测生物样本中的特定蛋白质、肽、抗体和核酸等。
酶联免疫吸附试验实验报告一、实验目的。
本实验旨在通过酶联免疫吸附试验（ELISA）检测目标蛋白或抗原的存在与浓度，以及对特定抗体的识别和结合情况。
通过本实验，我们可以了解到酶联免疫吸附试验的原理和操作步骤，以及在生物医学研究和临床诊断中的应用。
二、实验原理。
酶联免疫吸附试验是一种利用酶和抗体的特异性结合来检测抗原或抗体的方法。
其原理是将待检测的抗原或抗体吸附在微孔板表面，然后加入特异性抗体，并通过酶标记的二抗或底物来检测特异性结合的信号。
当待测物与特异性抗体结合后，通过底物的酶反应产生可定量的颜色反应，从而测定待测物的浓度。
三、实验材料和方法。
1. 实验材料，微孔板、待测抗原或抗体、特异性抗体、酶标记的二抗、底物溶液等。
2. 实验步骤，将待测抗原或抗体加入微孔板孔中，加入特异性抗体，洗涤孔板，加入酶标记的二抗，再次洗涤孔板，加入底物溶液，停止反应，测定吸光度。
四、实验结果。
通过本次实验，我们成功检测出待测物的存在与浓度，并观察到特异性抗体与待测物的结合情况。
根据实验结果，我们可以得出待测物的浓度，并进一步分析其在生物学过程中的作用和意义。
五、实验结论。
酶联免疫吸附试验是一种高度敏感和特异性的实验方法，广泛应用于生物医学研究和临床诊断领域。
通过本次实验，我们深入了解了酶联免疫吸附试验的原理和操作步骤，掌握了实验技术和数据分析方法，为今后的科研工作和临床诊断提供了重要的参考和支持。
六、实验展望。
酶联免疫吸附试验作为一种重要的生物学实验方法，具有广阔的应用前景。
今后，我们将进一步深入研究酶联免疫吸附试验的原理和技术，开展更多的实验和应用，为生物医学研究和临床诊断提供更多的支持和帮助。
七、参考文献。
1. Smith, J. et al. (2010). Enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA). Methods Mol Biol, 588, 89-94.2. Green, N. M. (2015). Avidin and streptavidin. Methods Enzymol, 184, 51-67.以上就是本次酶联免疫吸附试验的实验报告，谢谢阅读。
酶联免疫吸附测定法（ELISA）1.定义 (3)2.原理 (3)2.1抗原抗体反应 (3)2.2免疫测定在临床检验中的应用 (5)3.ELISA的类型 (5)3.1双抗体夹心法测抗原： (6)3.2双抗原夹心法测抗体 (6)3.3间接法测抗体 (6)3.4竞争法测抗体 (7)3.5竞争性测抗原 (7)3.6捕获包被法测抗体 (7)3.7ABS-ELISA法 (8)4.ELISA试剂的组成 (9)4.1固相载体： (9)4.2包被的方式 (9)4.3包被用抗原：天然抗原、重组抗原、合成多肽抗原。
(10)4.4包被的条件： (10)4.5洗涤液： (10)4.7酶的催化性； (11)4.8结合物的制备 (11)4.9结合物的保存 (12)4.10酶的底物 (12)4.11酶反应终止液 (12)4.12参考标准品 (13)4.13加样： (13)4.14保温 (13)4.15保温方式： (13)4.16室温温育的反应 (13)4.17洗涤 (14)4.18显色 (14)4.19比色 (14)4.20酶标比色仪 (15)4.21结果判定 (15)4.22定量测定 (16)4.23ELISA的操作要点 (16)1.定义酶联免疫吸附测定法（Enzyme Linked ImmunoSorbent Assay），简称ELISA，采用抗原与抗体的特异反应将待测物与酶连接，然后通过酶与底物产生颜色反应，对受检物质进行定性或定量分析的一种检测方法。
2.原理采用抗原与抗体的特异反应将待测物与酶连接，然后通过酶与底物产生颜色反应，可对受检物质的定性或定量分析。
2.1抗原抗体反应2.1.1可逆性抗原与抗体结合形成抗原抗体复合物的过程是一种动态平衡，其反应式为：Ag+Ab→Ag·Ab抗体的亲和力（affinity），可以用平衡常数K表示：K=[Ag·Ab]／[Ag][Ab]，Ag·Ab 的解离程度与K值有关。
酶联免疫吸附试验及其应用2007-01-29 15:43原作者：中国生化工程网一、前言近二十几年来，免疫学分析方法发展很快，特别是在使用标记了的抗原和抗体的分析技术以后，使原来许多经典的分析方法在敏感性和特异性方面都不能相比。
继50年代的免疫荧光（IFA）和60年代的放射免疫(RIA)分析技术之后，在70年代初期又建立了用酶来标记抗原或抗体的分析技术。
由于酶的高效生物催化作用，一个酶分子在数分钟内可以催化几十几百个底物分子发生反应，产生了放大作用，使得原来极其微乎其微的抗原或抗体在数分钟后就可被识别出来，这种技术被称为酶联免疫吸附试验法（Enzyme—Linked Immunosorbent Assay，ELISA），本法自70年代初期由VAN WEEMEN、SCHUARS.ENGVALL及PERLMARN等相继分别报道后，现已引起广泛重视。
ELISA法是免疫诊断中的一项新技术，现已成功地应用于多种病原微生物所引起的传染病、寄生虫病及非传染病等方面的免疫诊断。
也已应用于大分子抗原和小分子抗原的定量测定，根据已经使用的结果，认为ELISA法具有灵敏、特异、简单、快速、稳定及易于自动化操作等特点。
不仅适用于临床标本的检查，而且由于一天之内可以检查几百甚至上千份标本,因此，也适合于血清流行病学调查。
本法不仅可以用来测定抗体，而且也可用于测定体液中的循环抗原，所以也是一种早期诊断的良好方法。
因此ELISA法在生物医学各领域的应用范围日益扩大，可概括四个方面：1、免疫酶染色各种细胞内成份的定位。
2、研究抗酶抗体的合成。
3、显现微量的免疫沉淀反应。
4、定量检测体液中抗原或抗体成份。
二、方法的基本原理和种类ELISA的基本原理有三条：（1）抗原或抗体能以物理性地吸附于固相载体表面，可能是蛋白和聚苯乙烯表面间的疏水性部分相互吸附，并保持其免疫学活性；（2）抗原或抗体可通过共价键与酶连接形成酶结合物，而此种酶结合物仍能保持其免疫学和酶学活性；（3）酶结合物与相应抗原或抗体结合后，可根据加入底物的颜色反应来判定是否有免疫反应的存在，而且颜色反应的深浅是与标本中相应抗原或抗体的量成正比例的，因此，可以按底物显色的程度显示试验结果。
酶联免疫吸附法实验步骤酶联免疫吸附法（Enzyme-Linked Immunosorbent Assay，简称ELISA）是一种常用的实验方法，用于检测样品中特定的抗原或抗体。
以下是ELISA实验的基本步骤。
步骤1：制备试样首先，需要准备样品，可以是血清、细胞上清、尿液等。
样品可能含有目标抗原或抗体，也可能含有其他干扰物质。
样品的准备过程通常包括离心、稀释等步骤，以获得适合实验的样品。
步骤2：涂布固相材料ELISA试验通常使用微孔板（96孔板），每个孔都涂布有特定的抗原或抗体。
涂布的过程包括将抗原或抗体溶液加入每个孔中，并在适当的条件下孵育一段时间，使其吸附在固相材料上。
步骤3：阻断非特异性结合为了降低非特异性背景信号，需要在涂布后阻断孔中未被特异性结合的部分。
常用的阻断剂包括牛血清蛋白（BSA），牛阴离子解脂磷酸酰胆碱（BSA-PIPC），非脂阻断剂（Nonfat blocking reagent）等。
阻断剂溶液通常加入每个孔，孵育一段时间，然后将其倒出。
步骤4：加入样品与控制品经过阻断后，样品和控制品被加入每个孔中，以检测其中的特定抗原或抗体。
每个孔可以添加不同浓度的样品和控制品，以建立浓度-效应曲线。
步骤5：孵育与洗涤样品和控制品孵育的时间和温度因实验设计而异。
在孵育过程中，抗原或抗体与样品中的目标分子发生特异性结合。
完成孵育后，需要进行洗涤以去除未结合的物质，减少背景干扰。
洗涤缓冲液通常用洗板机进行，该步骤重复数次。
步骤6：加入检测抗体经过洗涤后，需要加入与样品中目标分子特异结合的检测抗体。
检测抗体通常与酶（如辣根过氧化物酶HRP）偶联，以便在后续步骤中进行信号放大。
加入的检测抗体需要与目标分子特异性结合，并在适当的条件下孵育。
步骤7：加入底物经过检测抗体孵育后，需要加入底物以触发酶催化反应。
底物的选择取决于所使用的酶和反应类型。
例如，在HRP酶联ELISA中，一种常用的底物为TMB（3,3',5,5'-四甲基苯基胺）。
网络出版时间：2012-03-28 08:27网络出版地址：/kcms/detail/11.4691.R.20120328.0827.004.html技术方法尿调蛋白酶联免疫吸附试验检测方法的建立及应用刘颖1，陈育青1△，周晶晶1，韩佳1，梁彧1，李雪迎2，张宏1（1．北京大学第一医院肾内科，北京大学肾脏疾病研究所，卫生部肾脏疾病重点实验室，北京100034；2．北京大学第一医院医学统计室，北京100034）基金项目：首都医学发展科研基金(2009-2019)和北京大学第一医院院级青年基金支持Supported by the Capital Foundation for Medical Research and Development(2009-2019) and the Research Foundation of Peking University First Hospital△Corresponding author’s e-mail, chenyuqing112@[摘要] 目的：建立尿尿调蛋白的酶联免疫吸附试验（enzyme-linkedimmunosorbent assays, ELISA）检测方法，并对IgA肾病患者的尿尿调蛋白水平监测进行进一步验证。
方法：以多克隆抗体作为包被抗体，单克隆抗体作为检测抗体，建立尿调蛋白的快速双抗夹心检测方法，检测精确性及重复性，并与商品化的试剂盒进行比较，检测166例IgA肾病患者和正常人的尿尿调蛋白水平。
结果：获得的标准曲线为0.78~12.5 g/L，实验室内变异系数为7.5%，实验室间变异系数为7.9%。
商品化试剂盒与本实验方法结果比对，相关系数为r=0.615，P<0.001；166例IgA肾病患者的尿尿调蛋白/尿肌酐比值低于正常人。
结论：尿尿调蛋白的ELISA检测方法灵敏，重复性较好，可运用于大样本的人群检测，IgA肾病患者的尿尿调蛋白分泌低于正常人。
[关键词] 尿调蛋白；酶联免疫吸附试验；肾小球肾炎，IGA[中图分类号] R692.31doi:Measurement of hunman urine uromodulin by enzyme-linked immunosordent assay(ELISA) and urine uromodulin excretion decrease in IgA nephropathyLIU Ying1, CHEN Yu-qing1△, ZHOU Jing-jing1, HAN Jia1, LIANG Yu1, LIXue-ying2, ZHANG Hong1(1. Renal Division, Department of Medicine, Peking University First Hospital; Peking University Institute of Nephrology; Key Laboratory of Renal Disease, Ministry of Health of China; Key Lab of Chronic Kidney Disease Prevention and Treatment, Ministry of Education; Beijing 100034, China; 2. Department of Statistics, Peking University First Hospital, Beijing 100034, China)ABSTRACT Objective:To establish the enzyme-linked immunosordent assay (ELISA) method to measure urine uromodulin and explore the urine uromudulin level in IgA nephropathy. Methods: The rabbit anti-human uromodulin polyclonal antibodies were coated on plates to capture uromodulin and the mouse anti-human uromodulin monoclonal antibody was used as detecting antibody to set up ELISA procure. We then detected the urine uromodulin in IgA nephropathy and normal control with this established method. Results: The detecting range of the method is 0.78-12.5 g/L. The within run coefficient of variation and between run of coefficient of variation were 7.5% and 7.9% respectively. Conclusion: The established method is sensitive and repeatable, and can be used in large sample detection.KEY WORDS Uromodulin; Enzyme-linked immunosorbent assay; Glomerulonephritis, IGA尿调蛋白（uromodulin）又称为Tamm-Horsfall蛋白，最早于1950年由Tamm 和Horsfall于尿中发现[1]，是尿液中含量最丰富的蛋白质，由肾小管髓袢升支粗段的上皮细胞粗面内质网合成，经过高尔基体的加工，分泌到肾小管上皮细胞管腔面的细胞膜上，部分进入尿液，成为构成管型的重要成分[2]。
既往的研究证实尿调蛋白与肾结石和泌尿系感染有关，近几年研究提示尿调蛋白在慢性肾病中可能发挥重要的作用。
有研究发现，尿尿调蛋白的水平与人群中慢性肾病的发生密切相关[3-7]，可能有助于IgA肾病的诊断[8]，因此，建立实用、可靠的检测尿尿调蛋白的方法非常迫切。
文献报道的检测方法操作繁琐、所需时间长、有放射性污染[9-11]，对于大样本人群检测受到限制。
本研究建立了针对尿调蛋白的简便、快速的酶联免疫吸附试验（enzyme-linked immunosorbent assays, ELISA）测定方法，同时对IgA肾病患者进行了尿尿调蛋白的检测，探讨IgA 肾病中尿尿调蛋白含量的变化。
1 资料与方法1.1 材料正常人尿样：取肾功能正常、尿常规检查阴性的正常人所留取的尿液标本，共48例，男27例，女21例，平均年龄（32.8±1.3）岁，估计肾小球滤过率（estimated glomerular filtration rate，eGFR）为(102.3±3.69) mL/min/1.73 m2，留清晨第1次尿液，离心后-80 ℃保存。
IgA肾病患者：选择北京大学第一医院肾内科经肾穿刺确诊为IgA肾病的住院患者166例，除外合并妊娠、泌尿系感染、糖尿病、肿瘤、肝硬化、过敏性紫癜、痛风和肾结石的患者。
患者的年龄(31.5±0.9)岁，男84例，女82例，eGFR为(101.83±1.04) mL/min/1.73 m2。
于肾穿刺当日留取清晨第1次尿液，离心后-80 ℃保存。
所有参与本研究的患者和志愿者均签署了知情同意书。
1.2 试剂本研究应用的主要试剂有兔抗人尿调蛋白多克隆抗体（Biomedical Technoloqies Inc BT-590），小鼠抗人尿调蛋白单克隆抗体（CEDARLANE CL1032AP），辣根酶标记山羊抗小鼠IgG（北京中杉金桥公司ZB-2305），牛血清白蛋白（华美转导生物有限公司BP005），尿调蛋白校准品（Mybiosource MBS36409），尿调蛋白检测试剂盒（加拿大Mdbioproducts产品，货号M036020）。
1.3 免疫组织化学染色取肾肿瘤切除手术时留取的正常肾组织，经石蜡固定后切片，厚4 m，进行常规免疫组织化学染色，分别以兔抗人尿调蛋白多克隆抗体和小鼠抗人尿调蛋白单克隆抗体作为一抗。
1.4 ELISA方法的建立多抗包被：用0.1 mol/mL pH 9.6的碳酸盐缓冲液稀释兔抗人尿调蛋白多克隆抗体，酶标板100 L/孔，37 ℃孵育1 h，0.1%（体积分数）Tween-0.01 mol/L pH 7.4 的PBS液(即PBST)洗3次，置于-80 ℃备用。
封闭：3%牛血清白蛋白（BSA，0.05 mol/L PBS稀释）室温封闭1 h，PBST 洗3次。
加样：Uromodulin标准品从12.5ng/ml开始对比稀释，尿液标本以TEA（0.5% Triton X-100 和20mMEDTA, pH 7.5,）1:200─4000稀释，100ul/孔,37℃孵育2小时，PBST洗3次；检测抗体：小鼠抗人尿调蛋白单克隆抗体用PBST稀释，100ul/孔37℃孵育1小时，PBST洗3次；酶标抗体：辣根酶标记山羊抗小鼠IgG 1: 5000稀释，100ul/孔37℃孵育0.5小时，PBST洗3次；显色：TMB显色，酶联检测仪上读数。
数据处理：以uromodulin校准品浓度绘制标准曲线，当r值在0.99以上方可使用。
批内精密度：相同标本同时检测20次，其值的变化算出实验内的变异系数。
批间精密度：不同日期、相同标本测出的uromodulin数值之间的变异系数。
1.5 尿肌酐检测方法相关标本尿肌酐检测采用碱性苦味酸法，用日本东芝Hisachi 7170 全自动生化分析仪进行检测，此项由北京大学第一医院检验科协助完成。
1.6 统计学分析所有数据均经正态分布检验，描述性数据用均数±标准误表示。
尿调蛋白商品化试剂盒检测结果与本方法检测比较采用配对t检验相关分析，尿尿调蛋白和IgA肾病的相关性采用单因素方差分析，P<0.05为差异有统计学意义。
2 结果2.1 抗体结合特异使用尿调蛋白单克隆抗体和多克隆抗体进行肾组织的免疫组化染色，可看到尿调蛋白特异地表达在部分肾小管上皮细胞，尿调蛋白特异地分布在肾小管髓袢及远曲小管（图1）。
2.2 标准曲线经方阵滴定，得到的最适条件为：多克隆抗体1:4 000以0.1 mol/mL pH 9.6碳酸盐缓冲液稀释、包板；单克隆抗体1:500以PBST稀释；校准品及尿液标本以TEA（即0.5% Triton X-100和20 mmol/L EDTA, pH 7.5）稀释，校准品曲线范围为0.78~12.5 g/L（图2）。
