酶联免疫吸附实验ELISA操作规则(新手适用)资料

ELISA操作规程
标题：ELISA操作规程
引言概述：ELISA（酶联免疫吸附实验）是一种常用的生物化学分析技术，用于检测特定蛋白质、抗体或者其他生物份子的存在和浓度。

正确的操作规程对于获得准确可靠的实验结果至关重要。

一、实验前准备
1.1 准备实验室基本设备：ELISA板阅读器、洗板机、移液器等。

1.2 准备实验试剂：包括底物、酶标记的抗体、洗涤缓冲液等。

1.3 根据实验方案准备样本：如血清、细胞上清液等。

二、板涂覆
2.1 将试剂均匀涂覆在ELISA板上。

2.2 封闭未被试剂覆盖的部份，防止非特异性结合。

2.3 将板在4℃下保存一段时间，促使试剂充分吸附。

三、样本加样
3.1 样本需按照实验方案稀释，避免过高或者过低浓度。

3.2 每孔加样量要准确，避免交叉污染。

3.3 混匀样本后，避免气泡产生。

四、洗板
4.1 使用洗板机进行洗板，确保每孔洗涤充分。

4.2 每次洗板后用吸头吸去残留液，避免残留物干扰实验结果。

4.3 洗板缓冲液的配制与使用要按照规定比例和方法进行。

五、显色和读板
5.1 加入底物后，保持暗处孵育一段时间。

5.2 在适当波长下读板，记录吸光值。

5.3 根据实验方案计算样本浓度，注意结果的解读和分析。

结语：ELISA操作规程的正确执行对于实验结果的准确性至关重要。

惟独严格按照规程操作，才干获得可靠的实验数据，为科研工作提供有力支持。

希翼本文提供的ELISA操作规程能够对您的实验工作有所匡助。

ELISA操作规程引言概述ELISA（酶联免疫吸附试验）是一种常用的实验技术，用于检测特定蛋白质或其他分子在生物样本中的存在和浓度。

本文将详细介绍ELISA的操作规程，包括实验前的准备工作、样本处理、试剂配制、板上实验步骤和结果分析等内容。

一、实验前的准备工作1.1 样本准备：收集样本时应注意避免污染和交叉污染，避免冻融次数过多。

样本应在规定时间内处理，避免长时间存放。

1.2 试剂准备：根据实验方案准备所需的试剂，如稀释缓冲液、洗涤缓冲液、底物液等，确保试剂的质量和稳定性。

1.3 仪器准备：准备好ELISA板阅读器和洗板机等设备，确保仪器的正常运行和校准。

二、样本处理2.1 样本稀释：根据实验需求将样本进行适当的稀释，以确保浓度在标准曲线的线性范围内。

2.2 样本处理：对于血清或血浆样本，应先离心去除悬浮物，避免干扰因子的影响。

2.3 样本保存：处理完样本后，应储存于-20℃或更低的温度下，避免多次冻融。

三、试剂配制3.1 稀释缓冲液：根据实验方案准确称取试剂，按照比例稀释，确保最终浓度符合实验要求。

3.2 洗涤缓冲液：配制洗板机所需的洗涤缓冲液，保证洗板的干净程度。

3.3 底物液：根据实验方案配制底物液，确保底物液的质量和稳定性。

四、板上实验步骤4.1 包被：将包被抗体加入到板上，孵育一定时间后洗涤，使包被抗体固定在板上。

4.2 加样本：加入样本和标准品，孵育一定时间后洗涤，去除未结合的物质。

4.3 加底物：加入底物液，孵育一定时间后停止反应，加入停止液终止反应。

五、结果分析5.1 读板：使用ELISA板阅读器测定吸光度值，绘制标准曲线并计算样本的浓度。

5.2 数据处理：根据实验方案进行数据处理，包括样本浓度的计算和结果的统计分析。

5.3 结果解释：根据实验结果进行数据解释，得出结论并撰写实验报告。

总结：ELISA操作规程是一项重要的实验技。

ELISA操作规程一、引言ELISA（酶联免疫吸附试验）是一种常用的免疫学实验技术，用于检测特定抗原或者抗体的存在和浓度。

本文将介绍ELISA的操作规程，包括试剂准备、样品处理、板上反应、洗涤、检测和数据分析等步骤。

二、试剂准备1. 缓冲液的配制：根据实验需求，选择适当的缓冲液配方。

常用的缓冲液有PBS、TBST等。

按照配方将所需试剂溶解于适当的体积的去离子水中，并进行调节和混合。

确保所有试剂的pH值和浓度符合实验要求。

2. 标准曲线的制备：准备一系列已知浓度的标准样品，按照实验设计的需求进行稀释。

标准样品的浓度应该覆盖实验样品的范围，并且至少包含一个空白对照。

3. 酶标板的涂覆：根据实验需要，选择合适的酶标板（如96孔板），将需要检测的抗原或者抗体溶解在适当的缓冲液中，按照要求的浓度将其加入到酶标板的孔中。

尽量避免气泡的产生，并确保涂覆均匀。

三、样品处理1. 样品采集：根据实验目的，选择合适的样品类型（如血清、尿液、细胞上清等），并进行采集。

确保样品的采集过程符合规范，避免污染和损坏。

2. 样品稀释：根据实验要求，将样品进行适当的稀释。

通常，样品的初始浓度较高，需要进行多次稀释以使其浓度在标准曲线范围内。

3. 预处理：根据实验需求，对样品进行预处理，如去除杂质、离心沉淀等。

确保样品的处理过程不会影响到所需的分析结果。

四、板上反应1. 标准样品的加入：将标准样品按照实验设计的要求加入到酶标板的孔中。

每一个标准样品应该有至少两个孔进行重复测量，以提高结果的可靠性。

2. 样品的加入：将稀释后的样品加入到酶标板的孔中。

同样，每一个样品应该有至少两个孔进行重复测量。

3. 阳性和阴性对照的加入：为验证实验的准确性，加入阳性和阴性对照。

阳性对照顾该包含所需的抗原或者抗体，而阴性对照则不含。

4. 孔板的封闭：将酶标板封闭，避免样品的蒸发和污染。

可以使用密封膜或者盖板进行封闭。

五、洗涤1. 洗涤缓冲液的配制：根据实验要求，配制适当的洗涤缓冲液。

精选全文完整版酶联免疫吸附试验（ELISA）的程序第一节间接ELISA试验一用可溶性抗原的ELISA：1、纯化抗原：用包被液稀释至1—20ug/ml；2、以50—100ul/孔量加入酶标板孔中；3、置4（度）过夜或37（度）吸附3h；4、PBST洗三次；5、每孔200ulPBS/NCS 4（度）过夜封闭或37（度）封闭3h；6、PBST洗5次，每次1min（包被板可—20（度）或许（度）保存备用）7、每孔加50—100ul第一抗体，同时设阳性、阴性对照。

若杂交瘤筛选，每孔加杂交瘤培养上清；8、37（度）孵育2h9、PBST洗5次，每次5min10、每孔加50—100ul酶标第二抗体；若杂交瘤筛选，每孔加HRP 标记的抗小鼠（IgG+IgM）抗体；11、37（度）孵育2h12、PBST洗5次，每次数5分钟；13、每孔加OPD 或TMBS底物100ul14、37（度）避光作用；（OPD为10—20）分钟，TMBS为40分钟）；15以50ul2MH2SO4终止反应，在酶联免疫阅读仪上读取OD值（OPD底物选用490nm滤光片，TMBS底物选用450nm滤:光片）；16结果判定：（1）P/N≥2.1 为阳性(2) P≥N+3SD 为阳性成功范例:NDV单抗检测，粘附素单抗检测，H单抗检测亚类鉴定和鸡白痢检疫等。

二、用全菌抗原的ELISA法（一）GA法1、新鲜培养的细菌用蒸馏水悬浮，光密度法或比浊法调整细菌浓度至1X10（6）个/ml。

注意：沙门氏菌等人畜共患病原体，使用前必须灭活或采用市售的灭活诊断菌液；2、酶标板中加200ul/孔，5%戊二醛（GA）溶液（0.1M NaHCO4 95ml+25%DNY戊二醛溶液5ml）;37(度);2小时3、蒸馏水洗5次;4、加细菌悬浮液,50ul/孔;5、37(度)温箱内过液,干燥吸附(20—24h)6、加PBS/NCS 220ul/孔37（度）封闭3小时或4（度）过夜封闭；7、PBST洗5次（—20（度）或4（度））存放备用；8、以下步骤同一。

ELISA操作规程一、引言ELISA（酶联免疫吸附试验）是一种常用的实验技术，用于检测和测量生物样品中特定抗原或抗体的存在。

本操作规程旨在提供详细的操作步骤，确保ELISA 实验的准确性和可重复性。

二、实验材料和设备1. 96孔ELISA板2. 微量移液器和相应的移液器头3. 洗板缓冲液4. 样品（抗原或抗体）5. 标准曲线样品6. 酶标记的二抗7. 底物液8. 停止液9. ELISA板洗涤器10. 阅读器三、实验步骤1. 准备ELISA板a. 将96孔ELISA板放置在工作台上。

b. 使用微量移液器向每个孔中加入100μL洗板缓冲液。

c. 轻轻振动ELISA板，使洗板缓冲液均匀分布，并将其静置5分钟。

d. 倒出洗板缓冲液，然后用纸巾轻轻拍干ELISA板。

2. 加入样品和标准曲线样品a. 将待测样品和标准曲线样品分别加入不同的孔中，每个孔加入100μL。

b. 覆盖ELISA板，并在室温下孵育一定时间（根据实验需要）。

3. 洗涤ELISA板a. 将ELISA板放入ELISA板洗涤器中。

b. 加入足够的洗板缓冲液，启动洗涤器进行洗涤。

重复此步骤3次。

c. 倒出洗板缓冲液，用纸巾轻轻拍干ELISA板。

4. 加入酶标记的二抗a. 使用微量移液器向每个孔中加入100μL酶标记的二抗。

b. 覆盖ELISA板，并在室温下孵育一定时间。

5. 洗涤ELISA板a. 重复步骤3中的洗涤步骤。

6. 加入底物液a. 使用微量移液器向每个孔中加入100μL底物液。

b. 覆盖ELISA板，并在室温下孵育一定时间。

7. 加入停止液a. 使用微量移液器向每个孔中加入50μL停止液。

8. 测量吸光度a. 将ELISA板放入阅读器中，设置波长和吸光度测量模式。

b. 测量每个孔的吸光度值，并记录下来。

四、数据处理和分析1. 绘制标准曲线a. 使用标准曲线样品的吸光度值绘制标准曲线图。

b. 利用标准曲线计算待测样品中特定抗原或抗体的浓度。

ELISA原理－－操作规则（新手适用）酶联免疫吸附实验 ELISA一．实验目的酶联免疫吸附测定(enzyme-linked immunosorbent assay 简称ELISA)是在免疫酶技术(immunoenzymatic techniques)的基础上发展起来的一种新型的免疫测定技术,ELISA过程包括抗原(抗体)吸附在固相载体上称为包被，加待测抗体(抗原), 再加相应酶标记抗体(抗原),生成抗原(抗体)--待测抗体(抗原)--酶标记抗体的复合物，再与该酶的底物反应生成有色产物。

借助分光光度计的光吸收计算抗体(抗原)的量。

待测抗体(抗原)的定量与有色产生成正比。

二．实验原理用于免疫酶技术的酶有很多，如过氧化物酶，碱性磷酸酯酶，β－Ｄ－半乳糖苷酶，葡萄糖氧化酶，碳酸酐酶，乙酰胆碱酯酶，6－磷酸葡萄糖脱氧酶等。

常用于ELISA法的酶有辣根过氧化物酶，碱性磷酸酯酶等，其中尤以辣根过氧化物酶为多。

由于酶摧化的是氧化还原反应，在呈色后须立刻测定，否则空气中的氧化作用使颜色加深，无法准确地定量。

辣根过氧化物酶（HRP）是一种糖蛋白，每个分子含有一个氯化血红素(protonhemin)区作辅基。

酶的浓度和纯度常以辅基的含量表示。

氯化血红素辅基的最大吸收峰是403nm，HRP酶蛋白的最大吸收峰是275nm，所以酶的浓度和纯度计算式是（已知HRP的A(1cm 403nm 1%)＝25，式中1％指HRP百分浓度为100ml含酶蛋白1g，即10mg/ml，所以，酶浓度以 mg/ml 计算是HRP的A(1cm 403nm mg/ml=2.5)HRP纯度(RZ)=A403nm/A275nm纯度RZ（Ｒeinheit Zahl）值越大说明酶内所含杂质越少。

高纯度HRP的RZ值在3.0左右，最高可达3.4。

用于ELISA 检测的HRP的RZ值要求在3.0以上。

ELISA的基本原理有三条：（1）抗原或抗体能以物理性地吸附于固相载体表面，可能是蛋白和聚苯乙烯表面间的疏水性部分相互吸附，并保持其免疫学活性；（2）抗原或抗体可通过共价键与酶连接形成酶结合物，而此种酶结合物仍能保持其免疫学和酶学活性；（3）酶结合物与相应抗原或抗体结合后，可根据加入底物的颜色反应来判定是否有免疫反应的存在，而且颜色反应的深浅是与标本中相应抗原或抗体的量成正比例的，因此，可以按底物显色的程度显示试验结果。

ELISA操作规程一、引言ELISA（酶联免疫吸附测定）是一种常用的实验技术，用于检测和定量分析抗原或抗体的存在和浓度。

本操作规程旨在提供一套标准化的ELISA实验操作步骤，确保实验结果的准确性和可重复性。

二、实验材料1. 微孔板：96孔或其他规格，耐酸碱性能好。

2. 酶标板洗涤缓冲液：含有洗涤液的缓冲液。

3. 标准品：已知浓度的抗原或抗体。

4. 待测样品：需要检测的抗原或抗体样品。

5. 酶标记的二抗：与待测样品中的抗体相应的二抗。

6. 酶标记底物：用于检测酶活性的底物。

7. 停止液：用于停止酶反应的液体。

三、实验步骤1. 准备工作a. 将微孔板标记编号，确保正确记录每个孔的样品信息。

b. 准备所需的试剂和材料，确保其完整性和质量。

c. 预热酶标仪至适当的温度。

2. 涂覆抗原或抗体a. 向微孔板的每个孔中加入适量的抗原或抗体溶液。

b. 将微孔板置于4℃的冰箱中，孵育一夜或适当时间。

3. 洗涤步骤a. 倒掉微孔板中的液体，用酶标板洗涤缓冲液洗涤孔板。

b. 重复上述步骤3次，确保洗涤干净。

4. 加入待测样品和标准品a. 向微孔板中的相应孔中加入待测样品和标准品，每个孔的体积相同。

b. 将微孔板覆盖，并在适当温度下孵育一段时间。

5. 洗涤步骤a. 倒掉微孔板中的液体，用酶标板洗涤缓冲液洗涤孔板。

b. 重复上述步骤3次，确保洗涤干净。

6. 加入酶标记的二抗a. 向微孔板中的每个孔中加入适量的酶标记的二抗溶液。

b. 将微孔板覆盖，并在适当温度下孵育一段时间。

7. 洗涤步骤a. 倒掉微孔板中的液体，用酶标板洗涤缓冲液洗涤孔板。

b. 重复上述步骤3次，确保洗涤干净。

8. 加入酶标记底物a. 向微孔板中的每个孔中加入适量的酶标记底物。

b. 将微孔板覆盖，并在适当温度下孵育一段时间。

9. 反应停止a. 向每个孔中加入适量的停止液，停止酶反应。

b. 使用酶标仪读取吸光度值。

四、数据分析1. 绘制标准曲线：根据已知浓度的标准品的吸光度值，绘制标准曲线。

ELISA操作规程一、引言ELISA（酶联免疫吸附试验）是一种常用的免疫学实验技术，用于检测特定抗原或抗体在样本中的存在量。

本操作规程旨在提供详细的ELISA实验步骤，确保实验的准确性和可重复性。

二、材料和试剂准备1. 微孔板：96孔或其他规格的微孔板。

2. 抗原或抗体：根据实验需求选择适当的抗原或抗体。

3. 样本：待测样本，如血清、尿液等。

4. 酶标记抗体：选择与待测抗原或抗体特异性结合的酶标记抗体。

5. 酶标记底物：选择适当的酶标记底物，如TMB（3,3',5,5'-四甲基联苯胺）。

6. 停止液：选择适当的停止液，如硫酸。

三、实验步骤1. 预处理a. 将微孔板的孔洗净，并将待测样本、阳性对照和阴性对照分别加入孔中。

b. 将微孔板密封或覆盖，孵育一定时间，使抗原或抗体与样本中的特定成分结合。

c. 弃去孔中液体，将孔洗净。

2. 添加酶标记抗体a. 将酶标记抗体加入每个孔中，使其与已结合在孔中的抗原或抗体结合。

b. 将微孔板密封或覆盖，孵育一定时间，使酶标记抗体与抗原或抗体结合。

3. 洗涤a. 弃去孔中液体，将孔洗净，重复2-3次，以去除未结合的酶标记抗体。

4. 添加酶标记底物a. 将酶标记底物加入每个孔中，使其与酶标记抗体结合。

b. 将微孔板密封或覆盖，孵育一定时间，使底物与酶反应产生显色。

5. 反应停止a. 加入适量的停止液，停止底物与酶的反应，防止进一步显色。

b. 使用酶标仪测量吸光度，记录各孔的光密度值。

6. 数据分析a. 根据实验设计和标准曲线，计算待测样本中特定抗原或抗体的浓度。

b. 统计数据并进行统计学分析，如平均值、标准差、t检验等。

四、实验注意事项1. 所有操作都应在洁净的实验室环境中进行，避免污染。

2. 严格按照实验步骤和操作规程进行，确保实验的准确性和可重复性。

3. 注意使用适当的阴性对照和阳性对照，以验证实验结果的准确性。

4. 注意控制实验条件，如温度、时间等，以保证实验结果的可比性。

ELISA操作规程一、实验目的本实验旨在通过酶联免疫吸附试验（ELISA）的操作，检测目标物质的存在与浓度，以实现对生物样本中特定抗原或抗体的定量分析。

二、实验材料1. 96孔ELISA板2. 目标抗原或抗体样本3. 特异性一抗和二抗4. 辅助试剂：洗涤缓冲液、稀释缓冲液、底物和停止液5. 高精度微量移液器和相应的移液器头6. 高精度电子天平7. 显微镜和酶标仪三、实验步骤1. 预处理：将96孔ELISA板放置在实验台上，加入稀释缓冲液，轻轻震荡混合，然后倒掉液体。

重复此步骤3次。

2. 样本添加：将待测样本加入96孔ELISA板中，每孔加入相同体积的样本。

3. 孵育：将ELISA板盖上密封膜，置于恒温箱中孵育一定时间，使样本中的抗原或抗体与固相特异性一抗结合。

4. 洗涤：将洗涤缓冲液加入96孔ELISA板中，轻轻震荡混合，然后倒掉液体。

重复此步骤3次，以洗去未结合的物质。

5. 二抗结合：将特异性二抗加入96孔ELISA板中，轻轻震荡混合，然后盖上密封膜，继续孵育一定时间，使二抗与固相特异性一抗结合。

6. 洗涤：重复步骤4。

7. 底物添加：将底物加入96孔ELISA板中，轻轻震荡混合，然后暗处孵育一定时间，使底物与二抗结合的酶发生反应。

8. 反应停止：加入停止液，终止底物与酶的反应。

9. 测量：将96孔ELISA板放入酶标仪中，根据实验要求选择相应波长进行测量。

记录各孔的吸光度值。

10. 数据分析：根据实验目的，利用标准曲线或其他方法，计算出目标物质的浓度。

四、实验注意事项1. 实验前需准备好所有试剂和材料，确保实验环境清洁和无尘。

2. 操作过程中需佩戴手套，避免污染样本和试剂。

3. 洗涤步骤中，确保洗涤缓冲液充分覆盖每个孔，且每次洗涤液倒掉后，孔内无残留液体。

4. 孵育和暗处孵育步骤中，需控制好时间和温度，以确保反应的充分进行。

5. 底物和停止液需按照说明书的要求配制和使用，避免使用过期或变质的试剂。

ELISA操作规程引言概述：ELISA（酶联免疫吸附试验）是一种常用的实验技术，用于检测和定量分析生物样本中的特定分子，如抗体、抗原、蛋白质等。

ELISA操作规程是进行ELISA 实验的关键，它确保实验的准确性和可重复性。

本文将详细介绍ELISA操作规程的内容。

正文内容：1. 准备实验材料1.1 准备试剂和标准品：根据实验需要，准备适当的试剂和标准品，如抗体、底物、酶标记物等。

确保试剂的保存条件符合要求，标准品的浓度准确。

1.2 准备样本：收集样本后，按照实验要求进行处理和储存。

确保样本的质量和数量满足实验需求。

2. 准备实验设备2.1 洗板机：清洗洗板机，确保洗板机的清洁度，避免交叉污染。

2.2 酶标仪：校准酶标仪，确保测量结果的准确性。

2.3 微量移液器：校准微量移液器，确保样品的准确加入。

2.4 96孔板：准备好96孔板，标记好每个孔的内容。

3. 进行实验步骤3.1 固定抗原：将待测抗原加入96孔板中，使其吸附在孔壁上。

3.2 阻断：加入阻断剂，阻断非特异性吸附位点。

3.3 添加抗体：加入特异性抗体，与抗原结合。

3.4 添加酶标记物：加入酶标记的二抗或底物，与抗体结合。

3.5 洗涤：用洗涤缓冲液洗涤孔壁，去除未结合的物质。

3.6 反应底物：加入底物，使酶催化反应发生。

3.7 终止反应：加入终止液，停止酶催化反应。

4. 测量和数据处理4.1 使用酶标仪测量吸光度值，记录每个孔的读数。

4.2 绘制标准曲线：根据标准品的吸光度值，绘制标准曲线。

4.3 计算样本浓度：根据样本的吸光度值，通过标准曲线计算样本的浓度。

5. 实验注意事项5.1 严格按照操作规程进行操作，避免实验误差。

5.2 保持实验环境的清洁和无菌，避免污染。

5.3 注意实验材料的保存和使用期限，确保实验结果的准确性。

总结：ELISA操作规程是进行ELISA实验的重要指南。

准备实验材料和设备、按照规定的步骤进行实验、正确测量和处理数据以及注意实验细节是保证实验结果准确性和可重复性的关键。

ELISA操作规程一、引言ELISA（酶联免疫吸附试验）是一种常用的免疫学实验技术，用于检测和定量分析抗原或抗体的存在。

该操作规程旨在提供一个标准化的操作流程，确保实验结果的准确性和可重复性。

二、实验材料1. 酶标板：96孔酶联免疫吸附板。

2. 抗原或抗体：待检测的抗原或抗体样品。

3. 阻断缓冲液：用于阻断非特异性结合位点。

4. 洗涤缓冲液：用于洗涤酶标板孔。

5. 一抗：与待检测抗原或抗体反应的第一抗体。

6. 二抗：与一抗反应的酶标记的第二抗体。

7. 底物：用于检测酶标记的第二抗体的底物。

8. 停止液：用于终止底物的反应。

三、实验步骤1. 酶标板涂覆a. 取出所需数量的酶标板，并在每个孔中加入待测抗原或抗体。

b. 将酶标板置于4℃的冰箱中，静置过夜或至少2小时，使抗原或抗体充分吸附在孔壁上。

c. 倒出孔内未吸附的抗原或抗体，并用洗涤缓冲液洗涤孔3次。

2. 阻断a. 加入阻断缓冲液至每个孔中，覆盖整个孔底。

b. 将酶标板密封，并在室温下孵育1小时，以防止非特异性结合。

3. 加入一抗a. 倒出阻断缓冲液，并加入稀释后的一抗至每个孔中。

b. 将酶标板密封，并在室温下孵育1小时，使一抗与待检测抗原或抗体发生特异性结合。

c. 用洗涤缓冲液洗涤孔3次。

4. 加入二抗a. 倒出洗涤缓冲液，并加入稀释后的二抗至每个孔中。

b. 将酶标板密封，并在室温下孵育1小时，使二抗与一抗发生特异性结合。

c. 用洗涤缓冲液洗涤孔3次。

5. 底物反应a. 倒出洗涤缓冲液，并加入底物至每个孔中。

b. 将酶标板密封，并在室温下孵育一定时间，使底物与酶发生反应。

c. 根据实验要求，控制反应时间，避免过度反应。

6. 反应终止a. 加入停止液至每个孔中，终止底物的反应。

b. 使用酶标仪测量各孔的吸光度，记录实验结果。

四、质量控制1. 阳性对照：使用已知含有特定抗原或抗体的样品作为阳性对照，确保实验的准确性和可重复性。

2. 阴性对照：使用不含特定抗原或抗体的样品作为阴性对照，排除非特异性结合的干扰。

ELISA操作规程一、引言ELISA（酶联免疫吸附试验）是一种常用的免疫学实验技术，用于检测和定量分析生物样本中的特定抗原或者抗体。

本操作规程旨在提供详细的步骤和指导，确保ELISA实验的准确性和可重复性。

二、实验材料准备1. 缓冲液：根据实验需求选择合适的缓冲液，如PBS（磷酸盐缓冲液）或者TBS（三氯甲烷缓冲液）。

2. 抗原或者抗体：根据实验目的选择合适的抗原或者抗体，并进行适当的稀释。

3. 酶标记的二抗：根据实验需求选择合适的酶标记的二抗，如HRP（辣根过氧化物酶）或者AP（碱性磷酸酶）。

4. 底物：选择合适的底物，如TMB（3,3',5,5'-四甲基联苯胺）或者ABTS（2,2'-联氨基二乙基三乙酸）。

5. 住手液：根据实验需求选择合适的住手液，如2M硫酸或者2M盐酸。

三、ELISA实验步骤1. 板涂覆a. 取ELISA板，将每一个孔加入适量的抗原或者抗体，通常为100-200ng/mL。

b. 将板封闭剂（如BSA或者牛血清白蛋白）加入每一个孔中，封闭非特异性结合位点。

c. 在4℃下孵育过夜，或者在室温下孵育2小时。

2. 样本处理a. 采集待测样本，如血清或者细胞上清。

b. 根据实验需求对样本进行适当的稀释。

c. 加入样本到孔中，每一个孔加入适量的样本，通常为50-100 μL。

d. 在室温下孵育1小时。

3. 二抗结合a. 弃去孔中的样本，并用洗涤缓冲液洗涤孔3次，每次洗涤时间为1-2分钟。

b. 加入酶标记的二抗到每一个孔中，每一个孔加入适量的二抗，通常为100-200 ng/mL。

c. 在室温下孵育1小时。

4. 底物反应a. 弃去孔中的二抗，并用洗涤缓冲液洗涤孔3次。

b. 加入适量的底物到每一个孔中，通常为100-200 μL。

c. 在室温下孵育适当的时间，观察颜色的发展。

5. 反应终止a. 加入适量的住手液到每一个孔中，通常为50-100 μL。

b. 轻轻摇晃板，确保住手液均匀混合。

酶联免疫吸附实验的操作指南酶联免疫吸附实验（Enzyme-linked immunosorbent assay，简称ELISA），是一种常用的免疫学实验技术，用于检测和定量分析目标物（例如抗体、抗原、蛋白质等）的存在与浓度。

本文将为您详细介绍如何进行酶联免疫吸附实验的操作步骤和注意事项。

一、试剂准备1.1 缓冲液的配制根据实验需求，选择适当的缓冲溶液。

常用的缓冲液包括PBS（磷酸盐缓冲液）、TBS（三甲基氨基甲烷盐缓冲液）等。

按照说明书的要求配制缓冲溶液，并确保其pH值调整合理。

1.2 酶标板的涂布抗原或抗体根据实验要求，在96孔酶标板的每个孔中，加入特定的抗原或抗体。

将酶标板密封存放于4℃的冰箱中，充分使抗原或抗体与酶标板壁结合，一般需在4℃下孵育过夜。

1.3 酶标记抗体的标记酶标记抗体是ELISA实验的关键部分。

常用的标记酶有辣根过氧化物酶（HRP）、碱性磷酸酶（AP）等。

根据标记抗体的种类和生产厂家提供的说明书，按照要求进行酶标记。

二、样品处理2.1 样品收集与保存收集样品时要注意，避免污染和损伤。

根据实验需要，可以收集血清、尿液、细胞上清等各种生物样品。

样品收集后，如果不能立即进行实验，应尽快储存于低温（4℃或-20℃）条件下，避免冻融过程对样品质量的影响。

2.2 样品稀释根据实验要求和实验样品的预期浓度，选择适当的稀释倍数。

注意，过高或过低的样品稀释倍数都会影响实验结果。

一般来说，采用2-4倍的稀释倍数，可获得较为准确的结果。

三、实验操作3.1 酶标板的孔板预处理将酶联免疫吸附试验盘从冰箱取出，并且按照孔板的编号，在正常室温下放置10-20分钟，保证孔板达到室温。

3.2 样品加入和孵育将稀释好的样品加入酶标板的每个孔中，并轻轻震荡或拍击孔板，使液体充分混合。

接下来，将孔板盖板和密封膜封上，置于摇床或恒温箱中，在适当的温度下进行孵育，一般为37℃，时间根据实验要求而定。

3.3 洗涤步骤孵育时间结束后，将酶标板倒扣在架子上，用洗涤缓冲液洗涤孔板，每孔200-300μl，每孔停留时间约30秒，每孔至少洗涤3次。

ELISA操作规程一、引言ELISA（酶联免疫吸附试验）是一种常用的实验技术，用于检测和定量分析生物样本中的特定分子，如蛋白质、抗体、激素等。

本操作规程旨在提供一套标准的ELISA实验操作步骤，确保实验结果的准确性和可重复性。

二、实验材料1. 96孔ELISA板2. 微量移液器和相应的移液头3. 洗板缓冲液4. 样品和标准品5. 酶标记的抗体或底物6. 酶标记底物反应停止液7. 阻断缓冲液8. 洗板机或多道洗涤器9. 酶标仪或分光光度计三、实验步骤1. 准备工作a. 将96孔ELISA板标记编号，确保每个孔的标识清晰可辨。

b. 准备洗板缓冲液，并将其加入洗板机或多道洗涤器中。

c. 准备样品和标准品，按照实验要求进行稀释。

d. 将酶标记的抗体或底物根据实验要求进行稀释。

2. 涂覆抗原或抗体a. 将涂覆抗原或抗体加入96孔ELISA板的相应孔中。

b. 将ELISA板封闭并在4℃冷藏过夜，或在室温下孵育1-2小时。

3. 洗板a. 将ELISA板倒扣在吸水纸上，轻轻敲打以除去残留液体。

b. 使用洗板机或多道洗涤器进行洗板，每孔洗涤3-5次，每次使用洗板缓冲液洗涤。

4. 阻断a. 加入阻断缓冲液到每个孔中，确保完全覆盖。

b. 封闭ELISA板并在室温下孵育1小时。

5. 加样a. 倒掉阻断缓冲液，将稀释好的样品和标准品加入相应的孔中。

b. 封闭ELISA板并在室温下孵育1-2小时。

6. 洗板a. 重复步骤3中的洗板步骤。

7. 添加酶标记的抗体或底物a. 加入酶标记的抗体或底物到每个孔中。

b. 封闭ELISA板并在室温下孵育30分钟至1小时。

8. 反应停止a. 加入酶标记底物反应停止液到每个孔中，停止反应。

b. 使用酶标仪或分光光度计测量各孔的吸光度值。

9. 数据分析a. 根据实验要求，使用适当的数据分析方法计算样品中目标分子的浓度。

b. 统计和记录实验结果，绘制适当的图表和曲线。

四、实验注意事项1. 严格按照实验步骤操作，避免交叉污染。

ELISA操作规程一、引言ELISA（酶联免疫吸附实验）是一种常用的免疫学实验技术，用于检测特定抗原或者抗体的存在。

本操作规程旨在提供一个详细的步骤指南，以确保ELISA实验的准确性和可重复性。

二、实验材料1. 微孔板：96孔的高吸附微孔板。

2. 缓冲液：含有适当浓度的PBS（磷酸缓冲盐溶液）和BSA（牛血清白蛋白）的缓冲液。

3. 标准品：包含已知浓度的抗原或者抗体的标准品。

4. 样品：待测的抗原或者抗体样品。

5. 探针：与待测物相对应的酶标记抗体。

6. 底物：适当的酶底物。

7. 住手液：住手底物反应的液体。

三、实验步骤1. 准备工作a. 将微孔板标记好，以便识别每一个孔。

b. 准备所需的缓冲液，并将其加热至适当的温度。

c. 将标准品和样品稀释至适当的浓度。

2. 涂覆抗原或者抗体a. 向微孔板中加入适量的抗原或者抗体溶液。

b. 将微孔板密封，并在4℃下孵育一夜。

c. 倒掉孵育液，用PBS洗涤孔板。

3. 阻断非特异性结合位点a. 向微孔板中加入适量的缓冲液。

b. 将微孔板密封，并在室温下孵育1小时。

c. 倒掉孵育液，用PBS洗涤孔板。

4. 加入探针a. 向微孔板中加入适量的探针溶液。

b. 将微孔板密封，并在室温下孵育1小时。

c. 倒掉孵育液，用PBS洗涤孔板。

5. 应用底物a. 向微孔板中加入适量的底物溶液。

b. 将微孔板密封，并在室温下孵育适当的时间。

c. 加入适量的住手液住手反应。

6. 测量吸光度a. 使用ELISA阅读器测量每一个孔的吸光度值。

b. 记录吸光度值，并进行数据分析。

四、数据分析1. 标准曲线绘制a. 使用已知浓度的标准品制作一系列稀释液。

b. 测量每一个稀释液的吸光度值。

c. 将吸光度值绘制成标准曲线。

2. 计算样品浓度a. 使用标准曲线确定样品的浓度。

b. 根据实验需求，可以使用线性回归或者其他适当的计算方法。

五、实验注意事项1. 所有操作应在洁净的实验室环境下进行，以避免污染。

ELISA 原理－－操作规则（新手适用）一．实验目的酶联免疫吸附测定（enzyme-linked immunosorbent assay 简称ELISA）是在免疫酶技术（immunoenzymatic techniques ）的基础上发展起来的一种新型的免疫测定技术,ELISA 过程包括抗原（抗体）吸附在固相载体上称为包被，加待测抗体（抗原）, 再加相应酶标记抗体（抗原）, 生成抗原（抗体）－－待测抗体（抗原）－－酶标记抗体的复合物，再与该酶的底物反应生成有色产物。

借助分光光度计的光吸收计算抗体（抗原）的量。

待测抗体（抗原）的定量与有色产物成正比。

二．实验原理用于免疫酶技术的酶有很多，如过氧化物酶，碱性磷酸酯酶，β－Ｄ－半乳糖苷酶，葡萄糖氧化酶，碳酸酐酶，乙酰胆碱酯酶，6－磷酸葡萄糖脱氧酶等。

常用于ELISA 法的酶有辣根过氧化物酶，碱性磷酸酯酶等，其中尤以辣根过氧化物酶为多。

由于酶摧化的是氧化还原反应，在呈色后须立刻测定，否则空气中的氧化作用使颜色加深，无法准确地定量。

辣根过氧化物酶（HRP）是一种糖蛋白，每个分子含有一个氯化血红素（protonhemin ）区作辅基。

酶的浓度和纯度常以辅基的含量表示。

氯化血红素辅基的最大吸收峰是403nm，HRP酶蛋白的最大吸收峰是275nm，所以酶的浓度和纯度计算式是（已知HRP的A（1cm 403nm 1%）＝25，式中1％指HRP百分浓度为100ml 含酶蛋白1g，即10mg/ml，所以，酶浓度以mg/ml 计算是HRP的A（1cm 403nm mg/ml=2.5 ）HRP纯度（RZ）=A403nm/A275nm纯度RZ（Ｒeinheit Zahl ）值越大说明酶内所含杂质越少。

高纯度HRP的RZ值在 3.0 左右，最高可达 3.4 。

用于ELISA 检测的HRP的RZ值要求在 3.0 以上。

ELISA 的基本原理有三条：（1）抗原或抗体能以物理性地吸附于固相载体表面，可能是蛋白和聚苯乙烯表面间的疏水性部分相互吸附，并保持其免疫学活性；（2）抗原或抗体可通过共价键与酶连接形成酶结合物，而此种酶结合物仍能保持其免疫学和酶学活性；（3）酶结合物与相应抗原或抗体结合后，可根据加入底物的颜色反应来判定是否有免疫反应的存在，而且颜色反应的深浅是与标本中相应抗原或抗体的量成正比例的，因此，可以按底物显色的程度显示试验结果。

ELISA操作规程引言概述：ELISA（酶联免疫吸附试验）是一种常用的生物化学实验技术，广泛应用于医学、生物学和生物化学等领域。

本文将详细介绍ELISA操作规程，并按照一、二、三、四、五这样的顺序，分为五个部份进行阐述。

一、试剂准备1.1 根据实验需要，准备ELISA板、酶标板液、洗涤缓冲液、样本稀释液等试剂。

1.2 检查试剂的有效期和储存条件，确保试剂的质量。

1.3 根据实验方案，按照规定的比例和方法，将试剂进行稀释和配制。

二、样本处理2.1 采集样本，并根据实验要求进行标记和编号。

2.2 根据实验方案，对样本进行预处理，如离心、稀释等。

2.3 确保样本的质量和数量符合实验要求，并进行必要的记录和标记。

三、板涂覆3.1 将ELISA板放置在工作台上，并按照实验方案要求，在每一个孔中加入特定抗原或者抗体。

3.2 保持ELISA板在适当的温度下孵育一段时间，以确保抗原或者抗体的吸附。

3.3 将孔中的液体倒出，并用洗涤缓冲液洗涤孔，以去除未吸附的物质。

四、标记物检测4.1 准备酶标记的抗体或者抗原，并按照实验方案要求进行稀释和标记。

4.2 将标记物加入到ELISA板的每一个孔中，并在适当的温度下孵育一段时间，使标记物与抗原或者抗体结合。

4.3 将孔中的液体倒出，并用洗涤缓冲液洗涤孔，以去除未结合的标记物。

五、结果分析5.1 加入底物溶液，使酶标记物发生可见的颜色反应。

5.2 在适当的时间内住手反应，并用酶标仪或者其他仪器测量吸光度。

5.3 根据实验方案和标准曲线，计算样本中目标物质的浓度或者活性。

总结：ELISA操作规程是进行ELISA实验的基本指南。

通过试剂准备、样本处理、板涂覆、标记物检测和结果分析等五个部份的详细阐述，可以确保实验的准确性和可重复性。

在操作过程中，需要严格遵守实验室的安全操作规范，并根据实验方案进行操作。

惟独正确操作，才干获得准确可靠的实验结果。

实验二酶联免疫吸附实验（ELISA）一、实验目的熟练掌握ELISA 技术二、实验原理酶联免疫吸附实验（ELISA）是目前应用最多的免疫酶技术, 它是使抗原或抗体吸附于固相载体, 使随后进行的抗原抗体反应均在载体表面进行, 从而简化了分离步骤, 提高了灵敏度, 即可检测抗原, 也可检测抗体。

实验方法包括间接法、夹心法及竞争法。

为了检测抗原可用夹心法。

将特异性抗体吸附在固相载体（聚苯乙烯制成的小管、小盘或小孔）上, 然后加被测溶液, 倘样品中有相应抗原, 则与抗体在载体表面形成复合物。

洗涤后加入酶标记的特异性抗体, 后者通过抗原也结合到载体的表面。

洗去过剩的标记抗体, 加入酶的底物, 在一定时间内经酶催化产生的有色产物的量与溶液中抗原含量成正比, 可用肉眼观察或分光光度计测定。

为了检测抗体可用间接法。

使抗原吸附于载体上, 然后加入被测血清, 如有抗体, 则与抗原在载体上形成复合物。

洗涤后加酶标记的抗球蛋白（抗抗体）与之反应。

洗涤后加底物显色, 有色产物的量与抗体的量成正比。

本实验使用的乙型肝炎病毒表面抗体诊断试剂盒是采用双抗原夹心法检测抗-HBs, 即采用纯化HBsAg 包被反应板, 加入待测标本, 同时加入HBsAg-HRP, 当标本中存在抗-HBs 时,该抗-HBs 与包被HBsAg 结合并与酶结合物形成HBsAg-抗-HBs-HBsAg-HRP 复合物, 加入TMB 底物产生显色反应, 反之则无显色反应。

三、实验仪器和试剂1.仪器设备: 微量移液器、恒温箱2.试剂和材料（1）蒸馏水（2）人血清样品（3）乙型肝炎病毒表面抗体检测试剂盒四、实验步骤和注意事项1.实验准备: 从冷藏环境中取出试剂盒, 在室温下平衡30 分钟, 同时将浓缩洗涤液作1: 20 稀释。

2.加待测标本: 加入待测标本每孔0.05 毫升, 并设抗-HBs 阳性对照2 孔, 抗-HBs 阴性对照2 孔, 空白对照1 孔。

（试剂使用前应摇匀, 并弃去1-2 滴后垂直滴加, 注意均匀用力）3.加酶结合物: 每孔0.05 毫升, 空白对照孔不加, 充分混匀, 置37℃孵育30 分钟。

酶联免疫吸附测定法（ELISA）标准操作规程一、适用范围适用于实验室从事ELISA实验的实验技术人员和研究生。

二、操作规程1、标准品的配制：使用前在标准品中加入适量的去离子水，配成10ng/ml的母液，设标准品八管，第一管加入标本稀释液900ul，第二管至第八管加入标本稀释液500ul，在第一管中加入10ng/ml的标准品溶液100ul混匀后用加样器吸出500ul，移至第二管。

如此反复作对比稀释，从第七管中吸出500ul,弃出，第八管为空白对照。

2、检测程序：1）加样：每孔各加入标准品或待测样品100ul，将反应物充分混匀后置37℃120分钟。

2）洗板：用洗涤液将反应板充分洗涤4-6次，向滤纸上印干。

3）每孔中加入第一抗工作液100ul，将反应板充分混匀后置37℃60分钟。

4）洗板，同前。

5）每孔加酶标抗体工作液100ul。

将反应板置37℃30分钟。

6）洗板，同前。

7）每孔加入底物工作液100ul，置37℃暗处反应15分钟。

8）每孔加入100ul终止液混匀。

9）30分钟内用酶标仪在450nm处测吸光值。

3、结构计算与判断：1）所有OD值都应扣除空白后在进行计算。

2）以标准品浓度为横坐标，OD值为纵坐标，在坐标纸上作图，画出标准曲线。

3）根据样品OD值在该曲线上查出相应的样品含量。

4、注意事项：1) 以上标准孔及样品空均建议做复孔，每次测定时均应做标准曲线。

2) 洗涤过程很关键，洗涤不充分将导致精确度误差及OD值错误升高。

3) 板条开封后剩余板条要密封好，保持剩余板条的干燥。

4) 本试剂盒应在4℃保存，仅用于科研，不用于临床。

5) 以上标准曲线的制作和加样流程仅供参考，具体检测时请按试剂盒说明书进行。