酶联免疫吸附试验(ELISA)操作注意事项

4562023酶联免疫吸附试验操作中的注意事项邹子云光泽县动物疫病预防控制中心福建光泽354100摘要结合兽医实验室的日常操作,对酶联免疫吸附(ELI SA)试验中存在的细节问题和注意事项进行阐述,包括试验前样品、试剂盒准备及试验中的各个操作步骤等。

为兽医实验室人员提供参考和帮助,避免人为因素对试验结果的准确性造成影响。

关键词ELI SA试验步骤细节因素注意事项文献标识码:B文章编号:1003-4331(2023)06-0055-02ELI SA是兽医实验室中最普遍使用的试验种类之一,具有良好的准确性和灵敏性,操作步骤简单,不易产生试验环境污染。

因此,被广泛用于猪瘟、口蹄疫、小反刍兽疫和猪繁殖与呼吸综合征抗体实验室检测项目中。

根据日常操作和试验步骤中细节问题的处理,总结分析ELI SA试验中常见的细节问题,以减少试验过程中由主观因素造成的误差,从而提高试验的准确性。

1试验前准备注意事项1.1样品样品在采集、制备、保存过程中,要注意以下几点。

首先,采集的每份样品应保证之后试验、复检、留样的使用数量;其次,采集完的样品竖直向上摆放,避免剧烈震荡,如果出现严重溶血现象,后期难以清洗干净,容易出现假阳性;最后,样品保存时不能反复冻融,2~8℃保存3d,-20℃可长期保存。

此外,使用前须将样品轻柔地上下颠倒混匀,保证离心管中各个位置抗体浓度一致,不可剧烈晃动混匀。

1.2试剂盒试剂盒在使用前需平衡至室温(20~ 25℃),若放置于实验室中自然回温,耗时较长且各组件回温程度不均匀。

建议将试剂盒各组件放在恒温箱中回温,包括配制洗涤液使用的纯净水。

恒温箱温度设定在25℃,内部放置温度计,确保箱内温度能准确达到25℃,每一步使用时将所要用到的试剂组件取出。

不同批次的试剂不可混合使用。

试剂盒严格按照要求保存,放在冰箱中应避免靠在冰箱内壁上,以免造成结冰。

未使用完的反应板要保存在放有干燥剂的密封袋内。

2试验操作过程注意事项2.1加样在加入第一个样品与最后一个样品之间存在时间差,因此,每个样品与孔板接触和反应的时间就存在细微差异。

实验三酶联免疫吸附试验（ELISA）一、实验目的了解ELISA的基本原理，掌握间接ELISA方法的原理与操作步骤。

二、实验原理将抗原或抗体固化于某种载体的表面，并保持其免疫活性，加入待检血清（抗体），然后加入与其相对应的既有酶活性又有免疫活性的酶标抗体或抗原，它们之间反应后，通过洗涤去掉未结合的标记物。

加入酶反应的底物后，底物被酶催化变为有色产物，酶的降解底物和呈现的色泽在一定条件下是呈正比的，故可根据颜色反应的深浅进行定性或定量分析，因此可用分光光度计进行测定，计算出参加反应的抗原或抗体的含量，从而达到测定抗原或抗体的目的。

常用酶及底物常用酶底物加终止液前颜色加终止液后颜色辣根过氧化物酶（HRP）RZ>3.1碱性磷酸酶（AP）邻苯二胺（OPD）四甲基联苯胺（TMB）对硝基苯磷酸酯（p-NPP）橙黄色蓝色黄色棕黄色黄色黄色根据试剂的来源和标本的性状以及检测的具备条件，可设计出各种不同类型的检测方法。

常用的三种类型：1、间接法测抗体（间接ELISA）间接法用于测定抗体。

它的原理是将已知抗原连接在固相载体上，待测抗体与抗原结合后再与酶标二抗结合，形成抗原-待测抗体-酶标二抗的复合物，复合物的形成量与待测抗体量成正比，属非竞争性反应类型。

2、双抗体夹心法（双抗夹心ELISA）双抗体夹心法用于检测抗原。

它是利用待测抗原上的两个抗原决定簇A和B分别与固相载体上的抗体A和酶标记抗体B结合，形成抗体A-待测抗原-酶标抗体B复合物，复合物的形成量与待测抗原含量成正比，属非竞争性反应类型。

操作：将抗体吸附于固相表面；加抗原，形成抗原-抗体复合物；加酶标抗体；加底物。

底物的降解量＝抗原量。

3、竞争ELISA竞争法既可用于检测抗原又可用于检测抗体。

它是用酶标抗原（抗体）与待测的非标记抗原（抗体）竞争性的与固相载体上的限量抗体（抗原）结合，待测抗原（抗体）多，则形成非标记复合物多，酶标抗原与抗体结合就少，也就是酶标记复合物少，因此，显色程度与待测物含量成反比。

酶联免疫吸附试验（ELISA）作者：发布日期：(2009-05-31) 浏览次数：7次酶联免疫吸附试验（enzyme linked immunosorbent assay，ELISA）是一种固相酶免疫测定技术。

它的基础是抗原或抗体的固相化及抗原或抗体的酶标记。

结合在固相载体表面的抗原或抗体仍保持其免疫学活性，酶标记的抗原或抗体既保留其免疫学活性，又保留酶的活性。

在测定时，受检标本（测定其中的抗体或抗原）与固相载体表面的抗原或抗体起反应。

用洗涤的方法使固相载体上形成的抗原抗体复合物与液体中的其他物质分开。

再加入酶标记的抗原或抗体，也通过反应而结合在固相载体上。

此时固相上的酶量与标本中受检物质的量呈一定的比例。

加入酶反应的底物后，底物被酶催化成为有色产物，产物的量与标本中受检物质的量直接相关，故可根据呈色的深浅进行定性或定量分析。

ELISA的主要类型有双抗体夹心法、间接法、竞争法、捕获法等。

试剂准备1．包被液（碳酸盐缓冲液pH9.6）：Na2CO3 1.59g；NaHCO3 2.93g；加800ml水溶解，定容至1000ml加0.02%NaN3，0.22μm膜过滤，4℃保存。

2．洗涤缓冲液（PBST）：NaCl 9g；KCl 0.25g；Na2HPO4 3.63g；KH2PO4 0.25g；加水溶解，定容至1000ml加0.2% Tween20混匀。

3．封闭液：10%小牛血清（1ml小牛血清加到9ml 1×PBS中混匀）。

4．底物缓冲液（磷酸盐-柠檬酸缓冲液pH6.0）：Na2HPO4 56.77g；柠檬酸5.6g；加水800ml溶解，定容至1000ml，过滤0.22μm膜，4℃保存。

5．终止液：1mol/L H2SO4。

一、双抗体夹心法检测抗原双抗体夹心法用于检测抗原。

它是利用待测抗原上的两个抗原决定簇A和B分别与固相载体上的抗体A和酶标记抗体B结合，形成抗体A-待测抗原-酶标抗体B复合物，复合物的形成量与待测抗原含量成正比。

酶联免疫吸附试验（ELISA）注意事项作者：任小龑来源：《新校园·上旬刊》2015年第07期摘要：本文主要探讨了酶联免疫吸附试验（ELISA）中常见的影响因素，对学生实验中常出现的问题进行原因分析，并总结解决办法。

ELISA试验操作中的各个环节对试验的检测效果影响较大，有可能导致显色不全、假阴性或假阳性结果。

关键词：酶联免疫;吸附试验;满版实验室常用固相酶免疫测定方法在1971年最初建立，称为酶联免疫吸附测定（Enzyme linked immunsorbent assay），简称ELISA。

原理为抗原抗体特异性结合和抗原抗体的酶标记，以酶催化底物显色来判断结果。

影响酶联免疫测定的因素较多，如标本的采集保存、试剂的准备、加样的技术、温度的控制、洗涤反应板的方式、显色反应时间的控制等，均可能对试验结果产生很大影响。

只有避免这些因素，才能保证试验结果的准确性和可靠性。

一、移液枪的使用我院免疫实验室常用手动单道移液器。

注意事项：（1）吸样前要保证枪头和液体处于相同温度;（2）若容量瓶中的液体太少，可倒入ep管中，方便吸取;（3）严格精确调节方法;（4）安装枪头要垂直插入，左右轻微转动上紧，上下敲击会引起内部的零部件因瞬间强烈撞击而松散;（5）垂直吸液，枪头吸嘴尖端需浸入液面2～4mm以下，一般液体，正向吸液1～2档，粘稠液可反向吸液2～1档，缓慢吸取，控制好弹簧的伸缩速度，太快会产生反冲和气泡，吸取后将移液枪提离液面，停顿1秒钟，观察是否有液滴流出，若有流出，说明有漏气现象;（6）放液时将吸嘴贴到容器内壁并保持10～400倾斜，平稳把按钮压到1档，停约一秒钟到2档，排出剩余液体。

吸取液体时一定要缓慢平稳地松开拇指，不能突然松开，以防溶液吸入过快而冲入枪体内腐蚀柱塞造成漏气。

移液枪应轻拿轻放，不能将已吸有液体的移液枪平放或倒置。

不要将按钮旋转出量程，否则会卡住内部机修装置而损坏;长时间不用时建议将刻度调至最大量程，让弹簧恢复原形，可延长使用寿命;定期对移液枪校准。

酶联免疫吸附（ELISA）试验的标准操作规程（编号：002）1.目的该SOP是利用抗原抗体特异性结合的原理，将待检抗体/抗原和酶标抗原/抗体按不同的步骤与固相载体表面的抗原/抗体起反应。

加入酶反应的底物后，底物被酶催化变为有色产物，产物的量与标本中受检物质的量直接相关，利用颜色反应放大反应效果从而定性或定量分析，从而使测定方法达到很高的敏感度。

2.适用范围该SOP适用于测定抗原抗体的匹配程度，血清中的抗体滴度，利用已知抗体判定未知蛋白的生物学特性等。

3.主要仪器酶标仪、洗板机、酶联条、微量移液器4.试剂0.05 M pH 9.6碳酸盐缓冲液、0.15 M pH 7.4 PBST、稀释液、封闭液、0.2M Na2HPO4、0.1 M 柠檬酸、0.1 M EDTA、底物反应液A、底物反应液B、终止液（2 M H2SO4）具体的制备步骤见附件。

5.操作步骤5.1 酶联免疫吸附试验（ELISA）常规操作5.1.1将重组蛋白用包被缓冲液按1:100、1:200、1:400、1:800、1:1600稀释后，每孔加100μL，设两排平行孔和阴性对照孔，4℃过夜包被（12-18h）或37℃包被5h。

5.1.2 次日用封闭液 37℃封闭1h，PBST洗涤3次，每次2min。

5.1.3 加入100μL用稀释液1:1000稀释的一抗，37℃温育30min，再用PBST洗涤后，每次2min。

5.1.4 加入100μL 1:1000稀释的HRP标记的二抗兔抗马IgG，37℃温育15min，洗涤后分别加入ELISA显色A液和B液，各50μL，5min后再加入50μL终止液，最后测定其A450nm，以测定孔与阴性对照孔A450nm＞2.1判为阳性。

5.2 其他模式酶联免疫吸附试验（ELISA）步骤5。

ELISA测定操作中的注意事项ELISA（酶联免疫吸附试验）是一种常用的工具，用于测定病毒、细菌、蛋白质和其他生物分子在生物样本中的存在量。

ELISA检测方法操作相对简单，但仍然需要遵循一定的操作步骤和注意事项。

以下是ELISA测定操作中需要注意的几个关键点：1.准备工作：在进行ELISA测定之前，必须仔细准备实验室，并确保所有需要的试剂和仪器设备都得到妥善处理。

所有试剂应按照说明书储存和使用，并检查试剂有效期。

2.样品处理：样品的处理方法会因样品类型的不同而异。

无论是血清、尿液、细胞上清液还是其他类型的样品，都需要进行预处理以提取目标分析物。

必须注意避免样品污染和误导，以避免结果扭曲。

3.标准曲线制备：标准品的浓度应按照所需浓度系列依次配制。

标准曲线对于测量未知样品中目标物质的浓度至关重要。

应准确测量并稀释标准品，以保证标准品在适宜阶段内。

4.试板板块的涂覆：试板板块在试验中起到一个基础角色，对于测定结果至关重要。

在涂布之前，应完全清洗和干燥，以确保涂覆的均匀。

涂覆的目标抗体或抗原浓度也应该掌握好，以便获得准确的结果。

5.反应时间和温度：在试验进行过程中，应遵循说明书上的指导，严格控制每个反应的时间和温度。

反应时间和温度的变化可能会导致结果不准确或可读性差。

6.洗涤的重要性：洗涤步骤是ELISA测定中用来去除未结合的试剂或物质的重要步骤。

洗涤过程必须彻底，在每次洗涤中使用足够的洗涤缓冲液来确保彻底去除未结合物质。

7.底物的选择和反应停止：底物的选择对于结果的解读和显示至关重要。

不同的底物可能在不同的波长下显示颜色。

在选择底物时应确认设计好测定的波长。

同时，在底物反应后需要及时停止反应，使反应停止时间相对一致。

8.数据分析：9.消毒与废液处理：10.质量控制：为了确保ELISA测定的结果准确可靠，应进行质量控制。

包括使用质控样品、校准标准品和内部参比物来保证所得结果的精确性和可重复性。

总结起来，ELISA测定是一种有效的生化实验方法，但在操作过程中需要注意细节和实验操作的准确性。

酶联免疫吸附试验注意事项一、前言酶联免疫吸附试验（ELISA）是一种常见的生物学实验技术，用于检测抗体或抗原的存在。

在进行ELISA实验时，需要注意许多细节，以确保实验结果准确可靠。

本文将详细介绍ELISA实验中需要注意的事项。

二、试剂准备1. 标准品的制备：标准品是ELISA实验中非常重要的一个组成部分，它通常用于建立标准曲线，从而确定未知样本中抗体或抗原的浓度。

在制备标准品时，应该按照厂家提供的说明书严格操作，并注意其保存方式和有效期。

2. 酶标板的处理：在使用酶标板之前，应该先进行预处理。

通常情况下，酶标板需要用PBS（磷酸盐缓冲液）或其他缓冲液洗涤数次才能去除表面上可能存在的污染物。

此外，在使用酶标板之前还应该对其进行预热处理。

3. 酶联试剂盒中其他试剂的制备：除了标准品和酶标板之外，ELISA试剂盒中还包括其他试剂如探针、底物、停止液、缓冲液等。

在制备这些试剂时，应该按照说明书中的要求进行操作，并注意其保存方式和有效期。

三、样本处理1. 样本的收集和保存：在进行ELISA实验之前，需要先收集样本并储存起来。

对于血清或血浆样本，应该使用无菌的容器进行收集，并在室温下离心去除细胞残留物。

此外，在储存样本时应该避免反复冻融，以免影响实验结果。

2. 样本的稀释：在ELISA实验中，通常需要将样本稀释到一定浓度才能进行检测。

稀释倍数应该根据实验需要和样品浓度确定，并严格按照说明书中的要求进行操作。

四、实验操作1. 洗板步骤：洗板是ELISA实验中非常重要的一个步骤，它用于去除不特异性结合物质以及未结合试剂等。

在洗板时应该注意以下几点：（1）洗涤次数：通常情况下，每个孔洗涤3-5次即可。

（2）洗涤缓冲液：不同的试剂盒可能需要使用不同的洗涤缓冲液，应该按照说明书中的要求进行操作。

（3）洗涤时间：洗板时间应该控制在适当的范围内，过长或过短都可能影响实验结果。

2. 加样步骤：在加样时应该注意以下几点：（1）加样量：加样量应该根据实验需要和样品浓度确定，并严格按照说明书中的要求进行操作。

酶联免疫吸附（ELISA）实验具体步骤及详细说明酶联免疫吸附（ELISA）可以：（1）免疫酶染色各种细胞内成份的定位。

（2）研究抗酶抗体的合成。

（3）显现微量的免疫沉淀反应。

（4）定量检测体液中抗原或抗体成份。

本法首先也是用特异性抗体包被于固相载体，经洗涤后加入含有抗原之待测样品，如待检样品中有相应抗原存在，即可与包被于固相载体上的特异性抗体结合，经保温孵育洗涤后，即可加入酶标记特异性抗体，再经孵育洗涤后，加底物显色进行测定，底物降解的量即为欲测抗原的量。

这种方法欲测的抗原必须有两个可以与抗体结合的部位，因为其一端要包被于固相载体上的抗体作用，而另一端则要与酶标记特异性抗体作用。

因此，不能用于分子量小于5000的半抗原之类的抗原测定。

我们用在霍乱肠毒素的测定。

HbSAg及HbS的测定。

具体步骤一、包被抗体：用包被缓冲液稀释特异性抗体球蛋白至最适浓度（1～10 ug /ml），每凹孔加0.3 ml，4℃过夜，或37℃水浴3小时，贮存冰箱。

二、洗涤：移去包被液，凹孔用洗涤缓冲液（含0.05%吐温-20）洗3次，每次5分钟。

三、每凹孔加入0.2 ml用稀释缓冲液稀释的含抗原的被检标本，37℃作用1～2小时。

四、洗涤：移去包被液，凹孔用洗涤缓冲液（含0.05%吐温-20）洗3次，每次5分钟。

五、加入0.2 ml用稀释缓冲液稀释的酶标记特异性抗体溶液，37℃作用1～2小时或由预试实验确定作用时间。

六、洗涤：移去包被液，凹孔用洗涤缓冲液（含0.05%吐温-20）洗3次，每次5分钟。

七、加入0.2ml底物溶液于每个凹孔(OPD或OT)，室温作用30分钟（另作一空白对照，0.4 ml底物加0.1 ml终止剂）。

八、加终止剂：每凹孔加2M H2SO4或2 M柠檬酸0.05 ml。

九、观察记录结果：目测或用酶标比色计测定（OPD用492nm）OD值。

注意事项1.可溶性抗原或抗体吸附于固相载体而成为不溶形式，这是进行酶标记测定的基本条件。

酶联免疫吸附试验（ELISA）操作要点优质的试剂，良好的仪器和正确的操作是保证ELISA检测结果准确可靠的必要条件。

1 标本的采取和保存可用作ELISA测定的标本十分广泛，体液、分泌物和排泄物）等均可作标本以测定其中某种抗体或抗原成份。

有些标本可直接进行测定（如血清、尿液），有些则需经预处理（如粪便和某些分泌物）。

大部分ELISA检测均以血清为标本。

血浆中除尚含有纤维蛋白原和抗凝剂外，其他成份均同等于血清。

制备血浆标本需借助于抗凝剂，而血清标本只要待血清自然凝固、血块收缩后即可取得。

除特殊情况外，在医学检验中均以血清作为检测标本。

在ELISA中血浆和血清可同等应用。

血清标本可按常规方法采集，应注意避免溶血，红细胞溶解时会释放出具有过氧化物酶活性的物质，以HRP为标记的ELISA测定中，溶血标本可能会增加非特异性显色。

血清标本宜在新鲜时检测。

如有细菌污染，菌体中可能含有内源性HRP，也会产生假阳性反应。

如在冰箱中保存过久，其中的可发生聚合，在间接法ELISA中可使本底加深。

一般说来，在5天内测定的血清标本可放置于4℃，超过一周测定的需低温冰存。

冻结血清融解后，蛋白质局部浓缩，分布不均，应充分混匀宜轻缓，避免气泡，可上下颠倒混和，不要在混匀器上强烈振荡。

混浊或有沉淀的血清标本应先离心或过滤，澄清后再检测。

反复冻融会使抗体效价跌落，所以测抗体的血清标本如需保存作多次检测，宜少量分装冰存。

保存血清自采集时就应注意无菌操作，也可加入适当防腐剂。

2 试剂的准备按试剂盒说明书的要求准备实验中需用的试剂。

ELISA中用的蒸馏水或去离子水，包括用于洗涤的，应为新鲜的和高质量的。

自配的缓冲液应用pH计测量较正。

从冰箱中取出的试验用试剂应待温度与室温平衡后使用。

试剂盒中本次试验不需用的部分应及时放回冰箱保存。

3 加样在ELISA中一般有3次加样步聚，即加标本，加酶结合物，加底物。

加样时应将所加物加在LEISA板孔的底部，避免加在孔壁上部，并注意不可溅出，不可产生气泡。

福建畜牧兽医第42卷第3期2020年酶联免疫吸附试验应注意的几点事项张慧瑛宁德市蕉城区畜牧兽医站福建宁德352100摘要因ELISA方法具有灵敏度高、特异性强等优点,使其成为基层兽医实验室常见的检测手段之一,但其对操作者的要求较高、需要注意的细节较多。

本文就ELISA试验中应注意的几点事项进行探讨,以供参考。

关键词ELISA检测注意事项文献标识码:B文章编号:1003-4331(2020)03-0041-02酶联免疫吸附试验简称为ELISA,具有灵敏度高、特异性强、快速简便、准确等优点。

ELISA是基层兽医实验室最为常见的一种检测技术,但该试验对操作要求比较高,一些细节操作不当就会对试验结果的准确性造成很大的影响。

笔者以多年来从事基层兽医实验室检测工作的经验,就ELISA试验中应注意的几点事项作如下探讨,以供同行参考。

1试验前的准备1.1样品ELISA试验中使用较多的是血清样品。

在全血采集时,采血过程要求无菌,同时避免出现溶血现象。

离心后的血清,短期可置于4℃保存;短时间内无法及时检测的,应置于-20℃保存,避免反复冻融。

1.2试剂所有试剂、反应板在使用之前应恢复至室温。

回温前,应先查看试剂盒是否在有效期内;此外,还需检查试剂的状态是否正常,如TMD底物是否已经显色变质。

使用过期或变质的试剂会影响检测结果。

1.3试验操作当前基层兽医实验室为了保证结果的准确性,所使用的试剂盒除了国产外,还有使用进口试剂盒。

试剂品种较多,因生产厂家不同,从而操作方法不同;有的同一厂家同一病种不同批号的试剂盒,操作方法亦有不同。

因此,试验前一定要先熟悉步骤,避免因操作错误而导致试验失败,或因不熟悉步骤,操作时间过慢而影响试验结果。

1.4试剂配制每个试剂盒对试剂的配制要求不同,有的需要配制样品稀释液,稀释阴阳性血清、被检样品和洗液,有的只需要稀释洗液,稀释前检查溶液是否有结晶析出,若有需用水浴锅或恒温培养箱融化,再根据说明书上要求的稀释倍数进行稀释,配制试剂应现配现用。

酶联免疫吸附试验的注意事项
酶联免疫吸附试验（Enzyme-linked immunosorbent assay，ELISA）是一种常用的实验方法，用于检测特定抗原或抗体的
存在。

在进行酶联免疫吸附试验时，需要注意以下事项：
1. 严格遵守实验室安全规范：实验室应具备适当的生物安全措施，如佩戴防护手套、实验室外套和眼镜等。

遵循正确的废弃物处置程序，以防止交叉感染。

2. 严格控制实验条件：在进行试验之前，要确保实验室温度、湿度和洁净度等条件符合要求。

避免因外界因素的干扰引起结果误差。

3. 选择合适的试剂和材料：尽可能选择高纯度的试剂和材料，以确保实验的准确性和可重复性。

4. 严格按照实验步骤操作：按照试剂和材料的添加顺序和比例，按照实验步骤进行操作。

在各个步骤中严格控制反应时间和温度。

5. 注意交叉污染的可能性：使用洁净台和洁净仪器，避免试剂和样品之间的交叉污染，尽量避免试剂间的接触。

6. 保证质量控制的合理性：在每次实验中设置适当的对照组，如阴性对照和阳性对照。

这有助于确保实验结果的准确性，并
监控试剂和仪器的性能。

7. 仔细读取和解读结果：根据试验结果进行正确的结果解读，应注意避免主观判断和误解。

8. 记录实验过程和结果：记录试验过程中的操作细节和实验结果，包括试剂名称、批号、使用日期等信息，以备将来进行结果分析和复查。

总之，要严格遵守实验操作规范和安全措施，保证实验条件的稳定和准确性，同时注意样品和试剂的交叉污染情况，并进行质量控制，严谨地进行实验操作和结果解读，以获得可靠的酶联免疫吸附试验结果。

酶联免疫吸附测定试验（ELISA）的操作要点1标本的收集和保存（1）要注意避免出现严重溶血。

血红蛋白中含有血红素基团，其有类似过氧化物的活性，因此，在以辣根过氧化物酶（HRP）为标记酶的ELISA测定中，如血清标本中血红蛋白浓度较高，则其就很容易在温育过程中吸附于固相，从而与后面加入的HRP底物反应显色，从而产生非特异性发应。

（2）样本的采集及血清分离中要注意尽是避免细菌污染，一则细菌的生长，其所分泌的一些酶可能会对抗原抗体等蛋白产生分解作用；二则对用相应酶作标记的测定方法产生非特异性干扰。

（3）血清标本宜在新鲜时检测，放置时间过长均可产生假阳性反应，如在冰箱中保存过久，可发生聚合，在间接法中可使本底加深。

血清标本如是以无菌操作分离，则可以在2-8℃下保存一周，如为有菌操作，则建议冰冻保存。

样本的长时间保存，应在-70℃以下。

（4）冰冻保存的标本须注意避免因停电等造成的反复冻融。

标本的反复冻融所产生的机械剪切力将对标本中的蛋白等分子产生破坏作用，从而引起假阴性结果。

此外，冻结样本溶解后，蛋白质局部浓缩、分布不均，应充分混匀、轻缓、避免气泡，可上下颠倒混合，不要在混匀器上强烈振荡。

（5）标本在保存中如出现细菌污染所致的混浊或絮状物时，应离心沉淀后取上清检测。

反复冻融会使抗体效价跌落，所以测抗体的血清标本如需保存作多次检测，宜少量分装冰存。

保存血清自采集时就应注意无菌操作，也可以加入适当防腐剂。

2试剂的准备（1）在实验开始前，将试剂盒先从冰箱中取出，在室温下放置30分钟以上后，再进行测定，以使试剂盒在使用前与室温平衡。

这样做的目的，主要是为了缩短升温时间，使反应微孔内的温度能较快地达到所要求的高度，以满足测定要求。

（2）目前的ELISA试剂盒中的洗涤液均需在使用时对所提供的浓缩液稀释配制，因此稀释时所用的蒸馏水或去离子水应保证质量。

（3）当试剂盒以OPD为底物时，则底物溶液应在反应显色前临时配制。

3加样本及反应试剂在ELISA中一般有3次加样步骤，即加标本、加酶结合物、加底物。