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检测认证乳粉中克罗诺杆菌属（阪崎肠杆菌）能力验证PCR技术的探索■ 仇平平 田 梦 孙巧巧（济宁市食品药品检验检测研究院）摘 要：为提高实验室检测克罗诺杆菌属（阪崎肠杆菌）的能力，本文依据NIFDC-PT-384乳粉中克罗诺杆菌属（阪崎肠杆菌）检验能力验证作业指导书、GB 4789.40-2016《食品安全国家标准 食品微生物学检验 克罗诺杆菌属（阪崎肠杆菌）检验 》，探索传统生化方法和PCR技术相结合的检测克罗诺杆菌属（阪崎肠杆菌）的方法。
结果表明，样品CODE12未检出克罗诺杆菌属（阪崎肠杆菌），样品CODE19检出克罗诺杆菌属（阪崎肠杆菌），结果均为满意。
本实验室具备检验克罗诺杆菌属（阪崎肠杆菌）的能力，PCR技术很好地印证了传统生化实验的结果。
关键词：乳粉，克罗诺杆菌属（阪崎肠杆菌），能力验证，PCR技术DOI编码：10.3969/j.issn.1002-5944.2023.16.028Exploration of PCR Technique for the Ability Verifi cation of Cronobacter Spp. (Enterobacter Sakazakii) in Milk PowderQIU Ping-ping TIAN Meng SUN Qiao-qiao（Jining Institute for Food and Drug Control）Abstract:To improve the ability of laboratory detection of Cronobacter Sakazakii (Enterobacter Sakazakii), this paper explores a method for the detection of Cronobacter Sakazakii (Enterobacter Sakazakii) by combining traditional biochemical methods with PCR. According to the operation instruction for verification of Cronobacter spp. (Enterobacter Sakazakii) testing ability in milk powder of NIFDC-PT-384 and GB 4789.40-2016 for food safety microbiology test. The results show that Cronobacter spp. (Enterobacter Sakazaki i) was not detected in sample CODE12, and Cronobacter (Enterobacteriaceae) was detected in sample CODE19, the results were satisfactory. Our laboratory has the ability to test Cronobacter spp. (Enterobacter Sakazakii), and PCR has well confi rmed the results of traditional biochemical experiments.Keywords: milk powder, Cronobacter spp. (Enterobacter sakazakii), profi ciency testing, PCR techniquen0 引 言克罗诺杆菌属（Cronobacter spp.）是肠杆菌科内一类短杆状革兰氏阴性菌，1980年以前被称为“产黄色素阴沟肠杆菌（yellow-pigmented Enterobacter cloacae）”，1980 年更名为阪崎肠杆菌（Enterobacter sakazakii），2008年被重新定义为一个新属，即克罗诺杆菌属[1-2]。
阪崎肠杆菌检测方法的研究进展与优化作者：李帆来源：《环球市场信息导报》2014年第09期阪崎肠杆菌（Enterobacter Sakazakii ）是乳制品中近几年新发现的一种致病菌，是肠杆菌科的一种。
目前国际社会上针对该菌的研究无论是在医学还是公共卫生学上都具有极其重要的意义。
阪崎肠杆菌菌型繁多，传统的血清学鉴定、选择性和非选择性增菌等检测方法存在灵敏度低、耗时长等缺点，难以满足食品及临床应用。
国内外学者对阪崎肠杆菌检测技术进行了大量研究，并取得了一定的进展。
检测方法主要分为以免疫学为基础的方法、分子生物学方法、联合方法三类方法。
该文就这三类方法研究进展进行概述。
阪崎肠杆茵的生物学性状及其对人群的健康危害受到人们的关注并被报告。
例如，味全配方奶粉2008年年10月份被检出含有致病菌阪崎肠杆菌。
阪崎肠杆菌是奶粉（乳）制品中新发现的一种致病菌。
由其引发的婴儿、早产儿脑膜炎、败血症及坏死性结肠炎散发和暴发的病例已在全球相继出现。
多份研究报告表明婴儿配方奶粉是当前发现致婴儿、早产儿脑膜炎、败血症和坏死性结肠炎的主要感染渠道，在某些情况下，由阪崎肠杆菌引发疾病而导致的死亡率可达40%～80%。
阪崎肠杆菌已引起世界多国相关部门的重视。
传统的检测方法存在很多缺点，很难满足现代临床快速诊断和治疗，食品检测的需求。
要了解更准确，快速，简便，可靠的方法和技术，科学为此已作了大量的研究，试验方法和识别技术正在不断发展和完善，并在实践中不断取得新的进展，从传统到更敏感的检测方法，比较简单，在发展方向更短的时间。
1 以免疫学为基础的检测方法免疫学相关技术主要内容是抗原和抗体之间的特异性结合的反应，然后通过免疫放大技术来分辨细菌。
由于抗原抗体反应速度快，人们通过这种高灵敏度建立了一系列的检测方法。
已经实践了的方法有很多种，大致分为荧光抗体（免疫荧光法），同位素标记抗体（放射免疫试验），酶标抗体（ELISA）为基础方法。
2 分子生物学方法分子生物学诊断技术是现代分子生物学与分子遗传学取得巨大进步的结晶，是在人们对基因的结构以及基因的表达和调控等生命本质问题的认识日益加深的基础上产生的。
□研究报告□奶粉中阪崎肠杆菌PCR检测方法研究高旗利 张 霞 罗茂凰 张海滨 张海英 姚 霞 张宏伟(天津出入境检验检疫局,天津塘沽,300456) 刘 寅 黄熙泰(南开大学,天津,300071) 摘 要:〔目的〕 建立和提出奶粉中阪崎肠杆菌PCR检测方法。
〔方法〕 利用细菌16S和23S rDNA的保守区作为通用引物,对6株阪崎肠杆菌16S～23S rDNA间区序列(ISR)进行了扩增和测序,在比较阪崎肠杆菌与其近源株16S1～23S rDNA间区序列的基础上,设计了11条阪崎肠杆菌PCR检测引物,组合成30对PCR引物并筛选出一对阪崎肠杆菌PCR检测的特异性引物,建立了奶粉中阪崎肠杆菌PCR检测方法。
〔结果〕 用10株阪崎肠杆菌,18株近源菌验证试验表明,本文所建立的PCR方法特异性强;加菌试验表明,奶粉样品中阪崎肠杆菌检测低限为2.2～5.4cfu/100g,灵敏度高;新建的PCR方法与FDA BAM方法比较试验表明,两种方法的检测结果完全符合。
〔结论〕 本文提出的奶粉中阪崎肠杆菌PCR检测方法填补了国内空白,达到了国际先进水平,可在实际工作中推广。
关键词:奶粉;阪崎肠杆菌;PCRDETECTION OF Enterobacter sakazakii FR OM DEH YDRATE D POWDERE D MI L K B Y PCR G ao Qili,Zhang X ia,Luo Maohuang,Zhang Haibin Zhang Haiying,Y ao X ia,Zhang H ong wei.(T ianjin Exit-Entry Inspection and Quarantine Bureau,T ianjin,300456)Liu Y in,Huang X itai(T ianjin Nankai University,T ianjin,300071) Abstract:[Objective] T o establish a PCR method for detection of Enterobacter sakazakii in dehydrated powdered milk.[Method] The conserved sequences in16S rRNA and23S rRNA genes of bacteria were used as a pair of universal primers to am plify the16S-23S interspacer region of6strains of Enterobacter sakazakii.On the basis of com parative sequence analysis of the16S-23S interspacer regions,11primers were designed and30pairs of these primers were combined s o that a pair of primers specific for Enterobacter sakazakii was screened out.Even2 tually,we established the PCR method for detection of dehydrated powdered milk from dehydrated powdered milk.[R esult] The PCR method established in this article is highly specific and sensitive for detection of Enterobacter sakazakii through the testing of10strains of En2 terobacter sakazakii and18strains of other relative bacteria and artificial inoculation.The sensitivity can reach to2.2～5.4cfu/100g.[Conclu2 sion] This PCR method,which fills the domestic blank and reaches to international advanced level,should be generalized and applied to routine detection.K ey w ords:Dehydrated powdered milk;Enterobacter sakazakii;PCR1 前言阪崎肠杆菌(Enterobacter sakazakii),又名黄色阴沟肠杆菌,为肠杆菌科肠杆菌属的一个种,1980年改名为阪崎肠杆菌[1]。
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奶粉中的健康杀手——克罗诺杆菌属（阪崎肠杆菌）检测标准解读！克罗诺杆菌属（Cronobacterspp.）是由Iversen等人于2008年建议创立的隶属于肠杆菌科的一个新属，该属是寄生在人和动物肠道内的一种有周生鞭毛、能运动、兼性厌氧的革兰氏阴性无芽孢杆菌。
该菌的发展经历了4个时期：１起初该菌因其产生黄色素，被认为是肠杆菌属中阴沟肠杆菌的生物变形种──黄色阴沟肠杆菌；２1989年，Farmer通过DNA杂交、生化反应、黄色素产生及抗生素敏感性等实验，发现该菌与阴沟肠杆菌有所不同，为此更名为“阪崎肠杆菌”；３2008年，Iversen等人通过荧光扩增片段长度多态性、自动核糖体分型、16SrRNA基因测序、DNA-DNA杂交和表型阵列等多种分子生物学技术研究，将该菌由种（阪崎肠杆菌）扩大为属（克罗诺杆菌属），这个新属包括6个种；４2012年，Joseph等利用16SrRNA基因序列分析和多位点测序技术对克罗诺杆菌属进行分类研究，提出将克罗诺杆菌属分为7个种。
克罗诺杆菌属是一种重要的食源性条件致病菌，可通过污染婴幼儿配方奶粉等食品导致新生儿脑膜炎、菌血症和坏死性小肠结肠炎。
其名字“克罗诺”（Cronos）来源于希腊神话，克罗诺是希腊神话中十二个泰坦巨神之一，传说他的每个孩子一出生就被他一口吃掉，其行为表现和该菌的致病特性很吻合，因此“Cronobacterspp.”被译成“克罗诺杆菌属”。
该菌作为引起婴幼儿死亡的重要条件致病菌，对其相关产品的检测及监管尤为重要，常用的检测方法有：另外，2016年12月23日卫计委发布了新标准GB 4789.40-2016《食品安全国家标准食品微生物学检验克罗诺杆菌属（阪崎肠杆菌）检验》，将于2017年6月23日实施，并将代替GB 4789.40-2010、SN/T 1632.1-2013。
该标准与GB 4789.40-2010相比，主要变化有：1.修改了标准名称标准名称中“阪崎肠杆菌检验”改为“克罗诺杆菌属（阪崎肠杆菌）检验”。
食品微生物之检验方法－阪崎肠杆菌之检验1 适用范围：本方法适用于一般食品及奶粉中阪崎肠杆菌之检验。
2 检验方法：2.1 工作环境：工作平台须宽敞、洁净、光线良好，操作平台光度为100呎烛光以上，密闭室内换气良好，尽可能没有灰尘及流动空气。
每15分钟落菌数不得超过15 CFU／培养皿。
2.2 器具及材料：2.2.1 干热灭菌器。
2.2.2 高压灭菌釜。
2.2.3 搅拌均质器（Blender）或铁胃（Stomacher）：适用于无菌操作者。
2.2.4 天平：可称量到2000 g者，灵敏度为0.1 g；可称量到120 g者，灵敏度为1 mg。
2.2.5 冰箱：能维持5 ± 3℃者。
2.2.6 吸管或吸管尖：已灭菌，1 mL吸管应有0.01 mL之刻度；5 mL及10 mL吸管应有0.1 mL 之刻度。
2.2.7 吸管辅助器（Pipette aid）或微量分注器。
2.2.8 稀释瓶：160 mL，玻璃、聚乙烯（polyethylene）、铁弗龙（Teflon）或其它能耐121℃湿热灭菌20分钟以上之塑料材质，附螺旋盖。
2.2.9 培养皿：已灭菌，内径约9 cm，深度约15 mm，底皿之内外面应平坦，无气泡、刮伤或其它缺点。
2.2.10 增菌用容器：附螺旋盖之125 mL、250 mL、2 L三角锥瓶或广口瓶；玻璃、聚乙烯、铁弗龙或其它能耐121℃湿热灭菌20分钟以上之塑料材质。
2.2.11 pH测定仪。
2.2.12 培养箱：能维持内部温度在± 1℃以内者。
2.2.13 温度计：量测温度范围1～55℃，最小刻度0.1℃。
2.2.14 水浴：加盖，具水流循环系统，能维持水温温差在± 0.2℃以内者。
2.2.15 接种针及接种环（直径约3 mm）：镍铬合金、铂铱或铬线材质，或可抛弃式者。
2.2.16 曲玻棒：可灭菌者，直径3～4 mm，涂抹区域45～55 mm。
2.2.17 试管：10 × 100 mm，13 × 100 mm，13 × 120 mm，15 × 150 mm，16 × 150 mm试管，或其它适用者。
*基金项目:国家质量监督检疫总局科研项目(2004IK097)作者单位:中国检验检疫科学研究院食品安全研究所,北京100025作者简介:赵贵明(1963-),男,山西人,研究员,学士,研究方向:食品微生物检验技术研究。
文章编号:1001-0580(2006)02-0207-02 中图分类号:R 378.2 文献标识码:B=实验研究>奶粉中阪崎肠杆菌分离鉴别方法研究*赵贵明,袁飞,陈颖,黄文胜,刘沛,张旭阪崎肠杆菌(Enter obacter sakaz akii )可引发婴儿、早产儿脑膜炎、败血症及坏死性结肠炎,散发和暴发病例在全球范围均有报道11~32。
国际相关组织认为,奶粉中的阪崎肠杆菌与沙门菌一样,是导致幼儿感染、死亡的主要原因,已有报道从婴幼儿配方奶粉中检出阪崎肠杆菌13,42。
因此,有效地从奶粉中分离阪崎肠杆菌,准确鉴别尤为重要,本文根据所有阪崎肠杆菌菌株均产生A -葡萄苷酶的原理152,在营养琼脂中添加5-溴-4-氯-3-吲哚-A -葡萄苷作为底物,月桂基硫酸盐作为抑制剂,制成改良显色培养基,检测80份市售奶粉,同时使用肠杆菌科细菌生化鉴定试剂(AP I20E),对可疑菌株进行鉴别并分析遇到的问题。
现报告如下。
1 材料与方法111 材料 (1)标准菌珠:大肠埃希菌44104,产气肠杆菌45103,阴沟肠杆菌45301,奇异变形杆菌49005,普通变形杆菌49027,鼠伤寒沙门氏菌51315,弗氏柠檬酸杆菌11732,肺炎克雷伯菌46114以及金黄色葡萄球菌6株,表皮葡萄球菌9株,均由中国药品生物制品检定所提供;阪崎肠杆菌AT CC 29544;阪崎肠杆菌样品分离株1~4,分离自奶粉样品中。
(2)试剂与培养:肠杆菌增菌肉汤,结晶紫中性红胆盐葡萄糖琼脂(VRBGA,由北京陆桥公司生产);阪崎肠杆菌显色培养基,胰酪胨大豆胨琼脂(T SA ),由本实验室配制;A PI20E(梅里埃公司)。
研究报告奶粉中阪崎肠杆菌PCR检测方法研究高旗利 张 霞 罗茂凰 张海滨 张海英 姚 霞 张宏伟(天津出入境检验检疫局,天津塘沽,300456) 刘 寅 黄熙泰(南开大学,天津,300071)摘 要: 目的 建立和提出奶粉中阪崎肠杆菌PCR检测方法。
方法 利用细菌16S和23S rDNA的保守区作为通用引物,对6株阪崎肠杆菌16S~23S rDNA间区序列(ISR)进行了扩增和测序,在比较阪崎肠杆菌与其近源株16S1~23S rDNA间区序列的基础上,设计了11条阪崎肠杆菌PCR检测引物,组合成30对PCR引物并筛选出一对阪崎肠杆菌PCR检测的特异性引物,建立了奶粉中阪崎肠杆菌PCR检测方法。
结果 用10株阪崎肠杆菌,18株近源菌验证试验表明,本文所建立的PCR方法特异性强;加菌试验表明,奶粉样品中阪崎肠杆菌检测低限为2.2~5.4cfu/100g,灵敏度高;新建的PCR方法与FDA BAM方法比较试验表明,两种方法的检测结果完全符合。
结论 本文提出的奶粉中阪崎肠杆菌PCR检测方法填补了国内空白,达到了国际先进水平,可在实际工作中推广。
关键词:奶粉;阪崎肠杆菌;PC RDETECTION OF Enterobacter sakazakii FROM D EHYDRATED POWDERED MILK BY PCRGao Qili,Zhang Xia,Luo M aohuang,Zhang Haibin Zhang Haiying,Yao Xia,Zhang Hongwei.(Tianji n Exit-Entry Inspection and Quaran tine Bureau,T ianjin,300456)Liu Yin,Huang Xitai(Tianjin Nankai University,T ianjin,300071)Abstract:[Objective] To establish a PCR method for detection of Enterobacte r saka z a kii in dehydrated powdered milk.[Method] T he conserved sequences in16S rRNA and23S rRNA genes of bacteria were used as a pair of universal pri mers to amplify the16S-23S in terspacer region of6strains of Ente r obacter saka z a kii.On the basis of comparative sequence analysis of the16S-23S interspacer regions,11primers were designed and30pairs of these pri mers were combined so that a pair of pri mers specific for Enterobacte r saka z a kii was screened out.Even-tually,we established the PCR method for detection of dehydrated powdered milk from dehydrated powdered milk.[Result] The PCR method established in this article is hi ghly specific and sensitive for detection of Ente r obacter saka zakii through the testing of10strains of En-te robacter sakazakii and18strains of other relative bacteria and artificial inoculation.The sensi tivity can reach to2.2~5.4cfu/100g.[Conclu-sion] This PCR method,which fills the domestic blank and reaches to international advanced level,should be generalized and applied to routine detection.Key words:Dehydrated powdered milk;Enterobacter saka z akii;PCR1 前言阪崎肠杆菌(Enterobacter sakazakii),又名黄色阴沟肠杆菌,为肠杆菌科肠杆菌属的一个种,1980年改名为阪崎肠杆菌[1]。
Urmenyi and Franklin两位科学家在1961年首次报道了由该菌引起的两例脑膜炎病例,随后在全球范围内相继出现了由阪崎肠杆菌引起的脑膜炎、败血症和坏死性小肠结肠炎的报道。
2001年4月,在美国某医院新生儿重症监护室,一早产儿发烧、心动过速,脑脊液培养发现阪崎肠杆菌,诊断为脑膜炎,用抗生素治疗无效,9天后死亡,扩大检查该院49名婴儿的粪便和尿液,发现10人为阪崎肠杆菌阳性,其原因是使用了某批Portagen的婴儿配方奶粉,而且在该批奶粉中也检查出了阪崎肠杆菌,结果导致Portagen婴儿配方奶粉于2002年4月被召回[2]。
1998年,在比利时有12名婴儿因哺喂同一牌号的婴儿配方奶粉而发生小肠结肠坏死,在这些婴儿的粪便和该批奶粉中同时分离出阪崎肠杆菌,当停用该批奶粉后,未有新的病例发生[3]。
从大多数病例看,阪崎肠杆菌主要危害婴儿,也有小部分成人感染骨髓炎和菌血症的报道,虽然有抗生素的治疗,但总体死亡率高达80%[4]。
目前,该菌感染源头还不十分清楚,但多数报告表明奶作者简介:高旗利(1964-),男,毕业于南开大学,硕士,已发表论文20余篇。
本研究为科技部农社司2003DIA6N002-002和天津出入境检验检疫局TK005-2003项目资助。
4粉是主渠道。
奶粉中阪崎肠杆菌的污染问题引起了FAO/W HO 的高度重视,在2004年召开了两次国际会议,由于FDA B AM 推荐的阪崎肠杆菌传统检测方法不仅流程长(6天),而且在VRB GA 平板上,该菌与肠杆菌科其他某些菌的菌落形态相似,可操作性差,为弥补传统方法的局限性,与会各国专家倡导采用国际通用的分子生物学方法检测阪崎肠杆菌。
2 材料与方法2.1 试验材料2.1.1 菌株(见表1)。
2.1.2 试剂MLST 增菌液(每升含有胰酪胨20g,氯化钠34.22g,乳糖5.0g,磷酸氢二钾2.75g,磷酸二氢钾2.75g,月桂基硫酸钠0.1g,万古霉素10mg,pH7);脑心浸液(bioM rieux );营养肉汤(北京陆桥技术有限责任公司);细菌全基因组DNA 提取试剂盒(北京天为时代科技有限公司);PCR 试剂盒(北京天为时代科技有限公司);100bp DNA ladder (北京天为时代科技有限公司);琼脂糖(promega 公司);10 loading buffer(大连宝生物工程公司);5 TBE (Tris54g,0.5mol/L ED TA pH 8.020mL,硼酸27.5g,加蒸馏水至1000m L)。
2.1.3 仪器离心机(Eppendorf,5417R,Germany);PCR 扩增仪(MJ Research,P TC -200,American);电泳仪(Hoefer,PS3000,American);凝胶成像仪(Bio-Rad,T2A,Italy)。
2.2 方法2.2.1 增菌培养表1 试验用菌株菌名来源菌号菌名来源菌号阪崎肠杆菌ATCC a12868伤口埃希氏菌自备菌株ESV 0407阪崎肠杆菌ATCC 29004团聚肠杆菌自备菌株D G1阪崎肠杆菌ATCC 29544中间肠杆菌自备菌株ENI0407阪崎肠杆菌自备菌株b DS 2河生肠杆菌自备菌株EN R0407阪崎肠杆菌自备菌株DS 4弗劳地枸橼酸菌CMCC 48021阪崎肠杆菌自备菌株FS1肠炎沙门氏菌N ICPBP d50041阪崎肠杆菌自备菌株RFPS 1痢疾志贺菌N ICPBP 51252阪崎肠杆菌自备菌株FS4小肠耶尔森氏菌N ICPBP 52301阪崎肠杆菌自备菌株IF M1蜂房哈夫尼亚菌CMCC 45201阪崎肠杆菌自备菌株SHY 1肺炎克雷伯CMCC 46114普通变形杆菌CMCC c49027大肠杆菌A TCC 8739奇异变形杆菌CMCC 49005大肠杆菌O157:H7自备菌株P TS 001阴沟肠杆菌CMCC 15301粘质沙雷菌自备菌株NS L1产气肠杆菌CMCC45103气味沙雷菌自备菌株QS L1注:a:美国典型培养物保藏中心,b:本室分离、鉴定的菌株,c:医学微生物菌种保藏管理中心,d:中国药品生物制品检定所。
所有实验菌株接种于营养肉汤,37 过夜培养。
2.2.2 细菌全基因组DNA 提取取1.5mL 过夜菌悬液,用试剂盒提取细菌DNA,方法详见天为时代科技有限公司的细菌全基因组DNA 提取试剂盒说明书,所提取DNA 溶于50 L TE 中。
2.2.3 16S~23S rDNA 间区序列扩增及测序2.2.3.1 反应体系(见表2)。
表2 间区序列PCR 反应体系试剂加入量10 buffer 5 l p r(10uM)各2 L d NTP(10mM)1 L 模板DNA 2 L Taq 酶(5U/ul)0.5 L dd H 2O37.5 L注:模板DNA 为阪崎肠杆菌ATCC12868,ATCC29544,ATCC29004,DS2,FS1菌株DNA 。
2.2.3.2 16S~23S rDNA 间区序列通用引物引物1:5 -GC TCG TG TNG TGANA TG TTG C CA-3 (在16s rD NA 序列中),引物2:5 -GCG A T TTC YG AA TGG GGR AA C GG-3 (在23S rDNA 序列中)。
2.2.3.3 反应条件94 预变性10min;94 30sec,57 15sec,72 60sec 进行5次循环;94 30sec,64 60sec,进行25次循环;72 延伸5min,4 保存。
2.2.3.4 电泳及测序:1.5%琼脂糖,电压5V/cm,电泳2.5h;回收ISR IA和ISR G泳带DNA,由大连宝生物工程公司双向测序。
