DNA、RNA及蛋白质操作技术

细胞转染的原理操作步骤以及小技巧细胞转染是一种将外源DNA、RNA、蛋白质等分子导入到细胞内的实验技术。

这种技术可以用来研究基因功能、发现新的信号通路和治疗基因疾病等。

下面将介绍细胞转染的原理、操作步骤以及一些小技巧。

一、细胞转染的原理：细胞转染主要通过三种方法实现：物理法、化学法和生物学法。

1.物理法：通过高压、电穿孔、微射流等方式，使细胞膜发生瞬时破裂，从而使DNA、RNA等外源分子进入细胞。

常用的物理法有电穿孔法和基因枪法。

2.化学法：通过化学物质，如聚吡咯、脂质体等，使外源分子与细胞膜结合，从而实现转染。

常用的化学法有聚乙烯亚胺（PEI）法、磷酸钙共沉淀法等。

3.生物学法：通过利用病毒载体将外源基因导入目标细胞，实现基因的转移。

常用的生物学法有腺相关病毒（AAV）转染、逆转录病毒（RETRO）转染等。

二、细胞转染的操作步骤：1.细胞的预处理：根据细胞类型和实验要求，将细胞培养至合适的状态。

通常细胞应处于快速生长期，但还未达到接触抑制的阶段。

对于一些特定的细胞，如悬浮细胞，可能需要将其转接至适当的培养基中。

2.外源分子的准备：将外源DNA、RNA等转染载体制备好。

如将DNA克隆并纯化至高质量的质粒DNA，或将RNA合成或纯化。

根据实验要求选择合适的转染载体。

3.转染方法的选择：根据实验要求选择合适的转染方法，如物理法、化学法或生物学法。

一般情况下，物理法适用于悬浮细胞，化学法适用于贴壁细胞，而生物学法适用于大多数细胞类型。

4.细胞转染操作：a.物理法：i.电穿孔法：将细胞悬浮于含有外源分子的缓冲液中，然后通过电穿孔仪的电极或电穿孔板进行电穿孔。

ii. 基因枪法：使用基因枪将外源分子直接“枪”入目标细胞中。

b.化学法：i.PEI法：将PEI与外源DNA或RNA按一定比例混合，在适当条件下形成复合物，然后添加至目标细胞中。

ii. 磷酸钙共沉淀法：将外源DNA与磷酸钙按比例混合，并静置形成磷酸钙- DNA沉淀，然后加入至目标细胞中。

TRIzol法同时提取RNA,,蛋白质TRIzol法同时提取RNA,,TRIzol试剂适用于从细胞和组织中快速分离RNA。

TRIzol试剂有多组分分离作用,与其他方法如硫氰酸胍/酚法、酚/SDS法、盐酸胍法、硫氰酸胍法等相比，最大特点是可同时分离一个样品的RNA\\．TRIzol使样品匀浆化，细胞裂解，溶解细胞内含物，同时因含有RNase抑制剂可保持RNA的完整性。

在加入氯仿离心后，溶液分为水相和有机相，RNA在水相中。

取出水相用异丙醇沉淀可回收RNA；用乙醇沉淀中间层可回收；用异丙醇沉淀有机相可回收。

TRIzol试剂可用于小量样品（50-100mg组织、5×106细胞）也适用于大量样品（≥1g组织、>107细胞）。

对人，动物，植物组织，细菌均适用，可同时处理大量不同样品，整个提取过程在一小时内即可完成。

分离的总RNA无和污染，可用于Northern Blot，dot blot，ployA筛选，体外翻译，RNase保护分析和分子克隆。

在用于RT-PCR时如果两条引物存在于一个单一外显子内，建议用无RNase的DNaseⅠ处理RNA样品，避免出现假阳性。

共纯化的可用作标准，比较不同样品RNA的得率，也可用于PCR和酶切。

可用于Western Blotting。

规格：100ml 黄色透明液体储存条件：2-8℃避光保存12个月注意：请勿直接接触皮肤或吞咽，以免灼伤。

如接触皮肤应立即用洗涤剂和大量水冲洗。

忌用乙醇擦洗，乙醇会加重灼伤程度。

预防RNase污染注意事项：1.经常更换新手套，皮肤上常带有的细菌，霉菌可能成为RNase的来源。

2.使用灭过菌的RNA专用塑料制品避免交叉污染。

3.RNA在TRIzol试剂中时不会被RNase污染，但提取后继续处理过程中应使用不含RNase 的塑料和玻璃器皿。

玻璃器皿可在150℃烘烤4小时，塑料制品可在0.5M NaOH中浸泡10分钟，然后用水彻底清洗，高压灭菌，即可去除RNase。

可编辑修改精选全文完整版第五章分子生物学研究法（上）DNA、RNA及蛋白质操作技术分子生物学研究之所以从20世纪中叶开始得到高速发展，其中最主要的原因之一是现代分子生物学研究方法、特别是基因操作和基因工程技术的进步。

基因操作主要包括DNA分子的切割与连接、核酸分子杂交、凝胶电泳、细胞转化、核酸序列分析以及基因的人工合成、定点突变和PCR扩增等，是分子生物学研究的核心技术。

基因工程是指在体外将核酸分子插入病毒、质粒或其它载体分子，构成遗传物质的新组合，使之进入新的宿主细胞内并获得持续稳定增殖能力和表达。

因此，基因工程技术其实是核酸操作技术的一部分，只不过我们在这里强调了外源核酸分子在另一种不同的寄主细胞中的繁衍与性状表达。

事实上，这种跨越天然物种屏障、把来自任何生物的基因置于毫无亲缘关系的新的寄主生物细胞之中的能力，是基因工程技术区别于其它技术的根本特征。

本章将在回顾重组DNA技术发展史的基础上，讨论DNA操作技术、基因克隆、表达分析技术及蛋白质组学、单核苷酸多态性分析等现代生物学领域里最广泛应用的实验技术和方法。

5. 1 重组DNA技术史话近半个多世纪来，分子生物学研究取得了前所未有的进步，概括地说，主要有三大成就：第一，在20世纪40年代确定了遗传信息的携带者、即基因的分子载体是DNA而不是蛋白质，解决了遗传的物质基础问题；第二，50年代提出了DNA分子的双螺旋结构模型和半保留复制机制,解决了基因的自我复制和世代交替问题；第三，50年代末至60年代，相继提出了“中心法则”和操纵子学说，成功地破译了遗传密码，阐明了遗传信息的流动与表达机制。

但是，由于缺乏有效的分离和富集单一DNA分子的技术，科学家无法对这类物质进行直接的生化分析。

事实上，DNA分子体外切割与连接技术及核苷酸序列分析技术的进步直接推动了重组DNA技术的产生与发展。

因为重组DNA的核心是用限制性核酸内切酶（Restriction endonuclease，RE）和DNA连接酶对DNA分子进行体外切割与连接，所以，科学家认为，这些工具酶的发现和应用是现代生物工程技术史上最重要的事件（表5-1）。

第二节DNA片段的扩增——PCR技术一、DNA在细胞内的复制1．所需的酶：解旋酶、DNA聚合酶和RNA聚合酶等。

2．引物：一段RNA。

3．原料：四种脱氧核苷酸。

4．原则：碱基互补配对原则。

二、PCR技术的过程1．把PCR缓冲液、DNA模板、一对引物、四种脱氧核苷酸、DNA聚合酶、Mg2＋等成分加入到微量离心管中。

2．把离心管置于95℃的高温中，使DNA碱基对之间的氢键断裂，DNA双链拆开成为两条单链。

3．将离心管置于55℃的环境中，使一对引物分别结合到两条分开的模板链上。

4．再将离心管转置于72℃的环境中，在DNA聚合酶的催化下，游离的脱氧核苷酸从引物的一端进行顺次连接，从而形成两条新的子链。

这样高温变性、低温复性和中温延伸三个步骤便构成了PCR过程的一个循环。

三、实验操作1．准备(1)为了避免外源DNA等因素的污染，PCR实验中使用的离心管、吸头、缓冲液以及蒸馏水等在使用前必须进行高压灭菌。

(2)如果没有PCR仪，可以设置3个恒温水浴锅，温度分别为95℃、55℃和72℃，然后按要求在3个水浴锅中来回转移PCR的微量离心管即可。

2．扩增3．检测利用DNA在260nm的紫外线波段的吸收值曲线来测定相应含量。

即：DNA的浓度(μg/mL)＝错误!×稀释倍数。

预习完成后，请把你认为难以解决的问题记录在下面的表格中问题1问题2问题3问题4一、DNA复制(体内)与PCR技术(体外)体内复制PCR反应不同点解旋在解旋酶作用下，细胞提供能量，部分解开加热至95 ℃左右，双链全部解开，不需解旋酶引物一小段RNA 单链DNA分子片段合成子链在引物基础上，一条链连续合成，另一条链不连续合成分别从两条链的引物端开始，都是连续合成，控制温度72 ℃特点边解旋边复制，半保留复制体外迅速扩增TaqDNA聚合酶不需要需要循环次数受生物体自身控制30多次温度体内温和条件高温(可变)相同点①需提供DNA复制的模板②四种脱氧核苷酸为原料③都需要一定的缓冲溶液④子链延伸的方向都是从5′端到3′端①解旋酶的作用是使DNA两条链的氢键断开，而DNA聚合酶与DNA连接酶都是催化形成磷酸二酯键。

分子生物学第五章分子生物学研究法（上）——DNA、RNA及蛋白质操作技术第三节RNA操作技术第四节SNP的理论与应用第五节基因克隆技术第六节蛋白质组与蛋白质组学技术夏玉琼2013-10-10目录RNA操作技术cDNA文库的构建基因文库的筛选SNP的理论与应用基因克隆技术蛋白质与蛋白质组学技术分子生物学 夏玉琼 西安电子科技大学cDNA文库的构建切割位点用四碱基特异性的限制性内切酶部分消化DNA 片段，有的仍有切割位点质粒DNA将DNA 克隆进质粒DNA细菌克隆每个细菌都带有不同片段的DNA细菌转化分子生物学 夏玉琼 西安电子科技大学cDNA文库的构建cDNA的长度0.5-8 kb载体：质粒载体和噬菌体类载体完整的cDNA文库包含大于5*105的独立克隆分子生物学 夏玉琼 西安电子科技大学目录RNA操作技术cDNA文库的构建基因文库的筛选SNP的理论与应用基因克隆技术蛋白质与蛋白质组学技术分子生物学 夏玉琼 西安电子科技大学基因文库的筛选含义通过某种特殊方法从基因文库中鉴定出含有所需重组DNA分子的特定克隆的过程筛选方法核酸杂交法PCR筛选法免疫筛选法分子生物学 夏玉琼 西安电子科技大学核酸杂交法培养基上的菌落盖上硝酸纤维素膜移去硝酸纤维素膜裂解、中和去除细菌蛋白DNA 印迹32P 标记探针杂交放射自显影图像挑出阳性克隆保存母板分子生物学 夏玉琼 西安电子科技大学PCR筛选法需获得基因特异性引物将整个基因文库保存在多孔培养板上用设计好的基因探针对每个孔PCR筛选，挑出阳性的孔对阳性的孔再稀释到次级多孔板中PCR筛选重复稀释重复筛选直到与目的基因对应的单个克隆分子生物学 夏玉琼 西安电子科技大学免疫筛选法文库铺于E.coli 形成噬菌斑转移到硝酸纤维素膜吸收λ噬菌体中表达的外源蛋白保存原板，加入一抗筛选膜上的噬菌斑印迹洗去未结合的抗体加入酶偶联的二抗加底物显色从保存板上挑出阳性噬菌斑一抗：第一抗体，识别目标蛋白二抗：抗体的抗体，能增强信号，增加该方法的灵活性分子生物学 夏玉琼 西安电子科技大学目录RNA操作技术SNP的理论与应用SNP概述SNP的检测技术SNP的应用基因克隆技术蛋白质与蛋白质组学技术分子生物学 夏玉琼 西安电子科技大学SNP概述single nucleotide polymorphism,pronounced “snips”单核苷酸多态性基因组DNA序列中由于单个核苷酸的突变而引起的多态性，发生频率1%或更高例如：某些人的染色体上的某个位置为A，而另外一些人的同样位置是T，染色体DNA同一位置上的每个碱基类型叫做一个等位位点继RFLP和SSR之后的第三代遗传标记遗传标记：在遗传分析上用作标记的基因分子生物学 夏玉琼 西安电子科技大学第一代遗传标记：RFLPRFLP标记是发展最早的DNA标记技术。

DNA提取仔细看试剂盒说明书！使用前：1.在缓冲液GD和漂洗液PW中加入无水乙醇（加入量看瓶标签）2.若缓冲液GA或GB有沉淀，37℃水浴溶解，摇匀后使用简要步骤如下：1.冻存全血37℃快速融化，取200μL血液加20μL Proteinase K溶液，混匀。

2.加200μL缓冲液GB，颠倒混匀数次，70℃放置10min，溶液应变清亮，瞬时离心。

3.加200μL无水乙醇，振荡混匀15s，可能会有絮状沉淀，瞬时离心。

4.将所得溶液和絮状沉淀都加入吸附柱CB3（吸附柱放入收集管），12000rpm（~13400g）离心30s，弃废液。

5.向CB3中加入500μL缓冲液GD（检查是否已加入无水乙醇），12000rpm（~13400g）离心30s，弃废液。

6.向CB3中加入600μL漂洗液PW（检查是否已加入无水乙醇），12000rpm（~13400g）离心30s，弃废液。

7.重复步骤6.8.将CB3放回收集管，12000rpm（~13400g）离心2min，弃废液。

将CB3置于室温放置数分钟，以挥发残留的乙醇。

9.将CB3转入一1.5mL Ep管，向吸附膜中间部位悬空滴加50μL洗脱缓冲液TE，室温放置2-5min，12000rpm（~13400g）离心2min，备用。

DNA/RNA浓度测定使用仪器：ND-1000使用方法：1.保持检测区域的清洁。

准备无RNA酶水，使用前润洗点样区1-2次。

2.打开软件，在点样区滴加1μL无RNA酶水，选择核酸种类（DNA/RNA），设置blank。

3.滴加1μL待测样本，记录浓度和纯度。

4.用纸巾擦去样品，再用无RNA酶水清洗1-2次。

5.关闭软件，关闭电脑，将机器盖上防尘布。

DNA PCR扩增反应体系：模板DNA 500ng10*buffer 2.5 μL25mM MgCl2 1.5 μL2.5mM dNTP 2μL10μM引物各0.4μLTaq酶0.25μL补水至25ul反应条件：95℃3min，（94℃30s，60℃30s，72℃30s），35个循环，72℃5minPCR产物2%琼脂糖凝胶电泳1.小胶（1/4）25mL ,中胶（1/2）50 mL ,大胶 100 mL。

DNARNA及蛋白质操作技术DNA操作技术DNA操作技术广泛应用于生物学研究、医学诊断、犯罪侦查等领域。

下面将介绍几种常见的DNA操作技术。

1.PCR（聚合酶链反应）PCR是一种重要的DNA操作技术，可以迅速扩增目标DNA序列。

PCR的主要步骤包括：变性、退火和延伸。

首先，将DNA样本加热至95℃，使DNA双链解离为单链；然后，降温至退火温度，引物与目标DNA序列特异性结合；最后，在延伸温度下，DNA聚合酶沿DNA模板合成新的DNA链。

通过不断重复这个循环，可以将目标DNA序列扩增成数百万个拷贝。

2.DNA测序DNA测序是确定DNA序列的技术。

最早的DNA测序方法是Sanger测序，它利用带有不同标记的ddNTP和dNTP，在DNA合成过程中随机终止，得到不同长度的DNA片段。

这些片段通过聚丙烯酰胺凝胶电泳分离，然后根据标记的位置确定序列。

近年来，新一代测序技术的出现大大提高了测序速度和准确性，比如Illumina测序技术。

3.DNA克隆DNA克隆是将目标DNA序列插入载体DNA中的过程。

典型的DNA克隆技术包括限制性内切酶切割、连接酶反应和转化。

首先，用限制性内切酶切割目标DNA和载体DNA，产生能相互配对的粘性末端；然后，用连接酶将两者连接起来；最后，将连接物转化到宿主细胞中，宿主细胞通过复制连接物，使其扩增。

DNA克隆广泛应用于基因工程、蛋白表达和基因治疗等领域。

RNA操作技术RNA是生物体内转录出的中间产物，包括mRNA、rRNA、tRNA等不同类型。

下面将介绍几种常见的RNA操作技术。

1.RNA提取RNA提取是从生物体中分离纯化RNA的过程。

常用的RNA提取方法包括酚-氯仿法、离心柱法和磁珠法等。

其中，酚-氯仿法是最常用的方法，通过酚等有机溶剂和氯仿共同沉淀DNA和蛋白质，使RNA在上清液中得到富集。

2.RT-PCR（逆转录聚合酶链反应）RT-PCR是将RNA转录为cDNA，并利用PCR扩增cDNA的技术。

分子生物学考点整理符广勇朱兰第一章．绪论一、分子生物学概念分子生物学是从分子水平研究生命本质为目的的一门新兴边缘学科，是研究核酸、蛋白质等所有生物大分子结构与功能相互关系的科学，是人类从分子水平上真正揭开生物世界奥秘、由被动地适应自然界转向主动地改造和重组自然界的基础学科。

二、重组DNA技术又称基因技术，是20世纪70年代初兴起的技术科学，目的是将不同的DNA片段按照人们的设计定向连接起来，在特定的受体细胞中与载体同时复制并得到表达，产生影响受体细胞的新的遗传性状。

三、基因表达的调控基因表达的调控主要表现在信号传导研究、转录因子研究及RNA剪辑三个方面。

四、转录因子转录因子是能与基因5`端上游特定序列专一结合，从而保证目的基因以特定的强度在特定的时间与空间表达的蛋白质分子。

第二章．染色体与DNA一、染色体上的蛋白质染色体上的蛋白质主要包括组蛋白和非组蛋白。

根据凝胶电泳性质可以把组蛋白分为H1、H2A、H2B、H3、H4。

这些组蛋白都含有大量的赖氨酸和精氨酸。

二、组蛋白的特性1．进化上的极端保守性不同种生物组蛋白的氨基酸组成是十分相似的，特别是H3、H4。

2.无组织特异性到目前为止，仅发现鸟类、鱼类及两栖类红细胞不含H1而带有H5，精细胞染色体的组蛋白是鱼精蛋白这两个例外。

3．肽链上氨基酸分布的不对称性碱性氨基酸集中分布在N端的半条链上。

4.组蛋白的修饰作用包括甲基化、乙酰化、磷酸化、泛素化及ADP核糖基化。

5.富含赖氨酸的组蛋白H5三、HMG蛋白叫高迁移率蛋白四、真核细胞DNA序列的分类1.不重复序列2.中度重复序列3.高度重复序列重复序列的意义：若某一重复序列出现错误，对基因的影响不大，稳定性较高；在短时间内可同时产生大量的基因产物。

重复序列的应用:应用于分子标记的作用：卫星DNA（便于分子标记）和微卫星DNA五、真核生物基因组与原核生物基因组的区别1.真核基因组庞大，原核生物基因组小2.真核基因组存在大量的重复序列，原核基因组没有重复序列3.真核基因组大部分是非编码序列，原核基因组大多是编码序列4.真核基因组的转录产物为单顺反子，原核基因组转录产物多为多顺反子5.真核基因是断裂基因，有内含子结构，原核基因为连续基因，几乎没有内含子结构6.真核基因组存在大量的顺式作用原元件，包括启动子、增强子和沉默子等，原核基因组基本没有增强子和沉默子7.真核基因组存在大量的DNA多态性，原核基因组很少有8.真核基因组具有端粒结构，原核基因组没有端粒结构六、重叠基因（Overlapping gene）指两个或两个以上的基因共有一段DNA序列，或是指一段DNA序列成为两个或两个以上的基因的组成部分。

第五章分子生物学研究法（上）------DNA RNA及蛋白质操作技术1. 简述PCR技术。

课本P165.2 .简述核酸的凝胶电泳。

答：将某种分子放到特定的电场中，它就会以一定的速度向适当的电极移动。

某物质在电场作用下的迁移速度叫作电泳的速率，它与电场强度成正比，与该分子所携带的净电荷数成正比，而与分子的磨擦系数成反比（分子大小、极性、介质的粘度系数等）。

在生理条件下，核酸分子中的磷酸基团是离子化的，所以，DNA和RNA实际上呈多聚阴离子状态（Polyanions）。

将DNA、RNA放到电场中，它就会由负极 -正极移动。

在凝胶电泳中，一般加入溴化乙锭（EB）--ethidium bromide 染色，此时，核酸分子在紫外光下发出荧光，肉眼能看到约50ng DNA所形成的条带。

3. 什么是south 杂交？指将经过电泳分离的DNA片断转移到一定的固相支持物的过程第七章基因的表达与调控（上）---- 原核基因表达调控模式1.简述代谢物对基因表达调控的两种方式。

① 转录水平上的调控(transcriptional regulation) ；② 转录水平上的调控(post-transcriptional regulation) ，包括mRNA 加工成熟水平上的调控(differen,tial processing of RNA transcript和翻译水平上的调控(differential translation of mRNA)。

3.简述乳糖操纵子的调控模型。

A、乳糖操纵子的组成：大肠杆菌乳糖操纵子含Z、Y、A三个结构基因，分别编码半乳糖苷酶、透酶和半乳糖苷乙酰转移酶，此外还有一个操纵序列0, —个启动子P和一个调节基因I。

B、阻遏蛋白的负性调节：没有乳糖存在时，I基因编码的阻遏蛋白结合于操纵序列O处，乳糖操纵子处于阻遏状态,不能合成分解乳糖的三种酶；有乳糖存在时,乳糖作为诱导物诱导阻遏蛋白变构,不能结合于操纵序列,乳糖操纵子被诱导开放合成分解乳糖的三种酶。

TRIZOL试剂警告：接触皮肤或误吞将导致中毒或灼伤。

接触皮肤之后立即用去垢剂和水冲洗。

若感到不适，请遵医嘱（可能的话出示标签）。

收到药品后，在室温下存储。

以已证明TRIZOL在常温下可稳定储存12个月。

说明：TRIZOL是一种从细胞和组织中提取总RNA的现用试剂。

该试剂是一种苯酚异硫氰酸酯单相溶液，它发展自Chomczynski 和Sacchi的RNA一步抽提法。

在细胞破碎和溶解细胞组分时，TRIZOL可以保持细胞匀浆或抽提物中RNA的完整性。

离心后加入氯仿，将溶液分为水相和有机相。

RNA只留在水相中。

转移水相后，用异丙醇沉淀回收RNA。

除去水相后，样品中的DNA和蛋白质也可以用后续沉淀方法回收。

用乙醇从相界面间沉淀DNA，异丙醇从有机相回收蛋白质。

DNA 的共纯化可能对样品间RNA产量的正常化有用。

这项提取技术对人、动物、植物或细菌来源的各种量的组织（低至50-100mg，高至≥1g）和细胞（低至5×106，高至＞107）都有良好的效果。

其简单的操作方法允许同时处理大量样品。

整个过程可在1小时内完成。

用TRIZOL提出的总RNA 不含蛋白质和DNA污染，可用来做Northern 电泳分析、斑点杂交、poly (A)+选择、体外翻译、RNA酶保护分析和分子克隆。

在PCR和扩大DNA酶Ⅰ梯度分离中，建议使用一个内含子中的两个引物。

TRIZOL简化了各种类型的大分子及小分子RNA的分离。

例如，从鼠肝分离的RNA经琼脂糖凝胶电泳和溴化乙锭染色，显示出介于7到15kb的大分子RNA 条带,（由mRNA和hnRNA组成的）两个约5kb（28S）和2kb（18S）核糖体RNA 的条带，以及介于0.1到0.3kb（tRNA, 5S）的小分子RNA的条带。

所分离的RNA 稀释于TE时A260/A280之比大于等于1.8。

谨防RNase的污染：在提取中任何不正确的操作方法中都可能偶然引入RNase。

由于其活性难以抑制，因此只能直接避免其引入。

Trizol法提取RNA、DNA及蛋白质1、向组织或细胞中加入1ml TRIZOL，吹打混匀，室温静置5min；2、加入TRIZOL 1/5(200ul)氯仿，振荡混匀，室温静置3min，4°C 12000g离心15-20min；注：上层水相可以通过异丙醇沉淀RNA，中间层通过乙醇能使DNA沉淀析出，在有机层中加入异丙醇能沉淀出蛋白质。

RNA提取3、将上层水相转移到另一干净的EP管中，加入等体积异丙醇，混匀，室温放置10 minutes;4、4°C，然后离心12,000 g ，10 minutes，去上清留沉淀；5、加入1ml 75%乙醇（RNase-free）洗涤沉淀，votex 5s；6、4°C， 12,000 g ，离心10 minutes，去上清留沉淀；7、加入1ml无水乙醇洗涤，votex 5s ，4°C， 12,000 g ，离心10 minutes，去废液留沉淀；8、晾干；9、加入50ulRNase free ddH2O溶解；10、测浓度，-80℃保存。

DNA提取3、将上层水相转移干净，这对分离DNA很关键；4、加入300ul无水乙醇/1ml TRIZOL，颠倒混匀，室温静置3min；5、4°C，2,000 g ，离心5 minutes；6、转移上清液，用于蛋白提取；7、加入1ml柠檬酸钠/无水乙醇（0.1M柠檬酸钠10%乙醇，pH8.5）洗涤，室温孵育30min（不时轻轻颠倒混匀）；8、4°C， 2,000 g ，离心5 minutes，去废液留沉淀；9、重复步骤7和8；10、加入1ml 75%乙醇洗涤沉淀，室温孵育10-20min（不时轻轻颠倒混匀）；11、4°C， 2,000 g ，离心5minutes，去上清留沉淀；12、无水乙醇洗涤，votex 5s，4°C， 2,000 g ，离心10 minutes；13、晾干；14、加入50ul ddH2O或TE溶解，测浓度，冰箱保存。

细胞转染的方法和基本原理细胞转染是生物学研究中常用的实验技术，用于将外源DNA、RNA或蛋白质引入到靶细胞中。

本文将介绍细胞转染的方法和基本原理。

一、细胞转染的方法1. 化学法转染：化学法转染是最常用的细胞转染方法之一。

通过利用化学物质如聚乙烯亚胺（PEI）或脂质体等，将外源DNA或RNA 包裹成复合物，与细胞膜结合后进入细胞。

这种方法操作简单、成本低廉，适用于多种细胞类型。

但转染效率较低，对细胞有一定毒性。

2. 病毒载体转染：病毒载体转染是一种高效的细胞转染方法。

病毒载体可以将外源基因嵌入病毒基因组中，然后通过感染细胞的方式将基因导入细胞内。

常用的病毒载体有腺病毒、逆转录病毒等。

这种方法转染效率高，适用于多种细胞类型，但需要特殊设备和技术，同时也有一定的生物安全风险。

3. 电穿孔法转染：电穿孔法利用高压脉冲作用于细胞膜，破坏细胞膜结构，从而使外源DNA或RNA进入细胞。

这种方法操作简单，转染效率较高，但对细胞有一定的毒性，并且只适用于某些特定的细胞类型。

4. 基因枪法转染：基因枪法是一种生理穿孔法，通过利用高压气体或火药驱动基因枪，将外源DNA或RNA以微粒形式直接射入细胞。

这种方法适用于多种细胞类型，转染效率较高，但需要特殊设备和技术，并且对细胞有一定的毒性。

二、细胞转染的基本原理细胞转染的基本原理是通过一定的方法将外源DNA、RNA或蛋白质引入靶细胞，使其在细胞内表达或功能发挥。

转染后的细胞可以用于研究基因功能、蛋白质表达及相互作用等。

细胞转染的基本原理可以分为三个步骤：吸附、内化和表达。

1. 吸附：在化学法转染中，外源DNA或RNA会与载体相结合形成复合物，通过静电作用与细胞膜结合。

在病毒载体转染中，病毒载体会与细胞膜表面的受体结合。

吸附是转染的第一步，直接影响转染效率。

2. 内化：吸附后，外源DNA、RNA或蛋白质需要进入细胞内部。

在化学法转染中，复合物通过细胞膜的内吞作用或直接渗透进入细胞质。