第 8 讲 DNA RNA 蛋白质操作技术(1)

近代医学中的分子生物学技术医学发展的不断进步，离不开现代分子生物学技术的运用。

分子生物学技术是指利用分子生物学的基本理论和实验方法进行研究的技术手段，它具有高精度、高灵敏、高特异性等特点，被广泛应用于基因治疗、肿瘤学、免疫学等领域。

分子生物学技术主要包括4个方面：DNA技术、RNA技术、蛋白质技术和细胞技术。

下面将依次介绍。

一、DNA技术DNA技术是指利用基因工程技术对DNA进行操作和改造的技术，其目的是研究DNA，揭示其作用机理，以及利用DNA进行基因诊断、基因治疗、基因工程等方面的应用。

DNA技术主要包括PCR、基因克隆、DNA测序、DNA芯片等技术。

PCR技术（聚合酶链式反应）是一种体外扩增DNA的技术，它的原理是利用核酸引物将所需的DNA片段扩增至每个分子数以百万计。

PCR技术已经广泛用于基因检测、DNA重组、疾病诊断及生物系统学等研究领域。

基因克隆技术是通过分子克隆技术将相应的DNA分子克隆到细胞质体或病毒载体上，利用重组DNA技术将所需的DNA片段提取、扩增插入到所需的载体中，形成一个新的基因组，这种技术被广泛用于疾病的基因治疗和工业生产中。

DNA测序技术是将DNA单链进行测序的技术，它通过测量DNA碱基序列决定DNA的组成和序列，利用碱基对的配对特性来确定DNA条带的化学结构和排列顺序，这种技术已经被广泛应用于基因诊断、疾病治疗、基因工程等方面。

DNA芯片技术是一种高通量的基因表达分析技术。

它是一种半导体芯片上附有数百万至数千万个RNA或DNA分子的技术，可以在一个实验中同时检测数千种基因表达水平，从而迅速获取大量有关细胞和组织的表达信息。

二、RNA技术RNA技术主要包括RNA提取、RNA测序、RNAi等技术。

RNA提取技术是研究RNA的一种常用方法，通过分子生物学技术将细胞或组织中RNA分离出来，以便进一步研究RNA的生物学特性以及RNA在各种疾病中的作用机制。

RNA测序技术是指通过测序技术对RNA进行测序，以获得RNA子集的特定序列和结构线索，从而推断RNA的在细胞内的功能，并且可以进行基因表达分析、疾病诊断及治疗等方面的应用。

DNA提取仔细看试剂盒说明书！使用前：1.在缓冲液GD和漂洗液PW中加入无水乙醇（加入量看瓶标签）2.若缓冲液GA或GB有沉淀，37℃水浴溶解，摇匀后使用简要步骤如下：1.冻存全血37℃快速融化，取200μL血液加20μL Proteinase K溶液，混匀。

2.加200μL缓冲液GB，颠倒混匀数次，70℃放置10min，溶液应变清亮，瞬时离心。

3.加200μL无水乙醇，振荡混匀15s，可能会有絮状沉淀，瞬时离心。

4.将所得溶液和絮状沉淀都加入吸附柱CB3（吸附柱放入收集管），12000rpm（~13400g）离心30s，弃废液。

5.向CB3中加入500μL缓冲液GD（检查是否已加入无水乙醇），12000rpm（~13400g）离心30s，弃废液。

6.向CB3中加入600μL漂洗液PW（检查是否已加入无水乙醇），12000rpm（~13400g）离心30s，弃废液。

7.重复步骤6.8.将CB3放回收集管，12000rpm（~13400g）离心2min，弃废液。

将CB3置于室温放置数分钟，以挥发残留的乙醇。

9.将CB3转入一1.5mL Ep管，向吸附膜中间部位悬空滴加50μL洗脱缓冲液TE，室温放置2-5min，12000rpm（~13400g）离心2min，备用。

DNA/RNA浓度测定使用仪器：ND-1000使用方法：1.保持检测区域的清洁。

准备无RNA酶水，使用前润洗点样区1-2次。

2.打开软件，在点样区滴加1μL无RNA酶水，选择核酸种类（DNA/RNA），设置blank。

3.滴加1μL待测样本，记录浓度和纯度。

4.用纸巾擦去样品，再用无RNA酶水清洗1-2次。

5.关闭软件，关闭电脑，将机器盖上防尘布。

DNA PCR扩增反应体系：模板DNA 500ng10*buffer 2.5 μL25mM MgCl2 1.5 μL2.5mM dNTP 2μL10μM引物各0.4μLTaq酶0.25μL补水至25ul反应条件：95℃3min，（94℃30s，60℃30s，72℃30s），35个循环，72℃5minPCR产物2%琼脂糖凝胶电泳1.小胶（1/4）25mL ,中胶（1/2）50 mL ,大胶 100 mL。

DNARNA及蛋白质操作技术DNA操作技术DNA操作技术广泛应用于生物学研究、医学诊断、犯罪侦查等领域。

下面将介绍几种常见的DNA操作技术。

1.PCR（聚合酶链反应）PCR是一种重要的DNA操作技术，可以迅速扩增目标DNA序列。

PCR的主要步骤包括：变性、退火和延伸。

首先，将DNA样本加热至95℃，使DNA双链解离为单链；然后，降温至退火温度，引物与目标DNA序列特异性结合；最后，在延伸温度下，DNA聚合酶沿DNA模板合成新的DNA链。

通过不断重复这个循环，可以将目标DNA序列扩增成数百万个拷贝。

2.DNA测序DNA测序是确定DNA序列的技术。

最早的DNA测序方法是Sanger测序，它利用带有不同标记的ddNTP和dNTP，在DNA合成过程中随机终止，得到不同长度的DNA片段。

这些片段通过聚丙烯酰胺凝胶电泳分离，然后根据标记的位置确定序列。

近年来，新一代测序技术的出现大大提高了测序速度和准确性，比如Illumina测序技术。

3.DNA克隆DNA克隆是将目标DNA序列插入载体DNA中的过程。

典型的DNA克隆技术包括限制性内切酶切割、连接酶反应和转化。

首先，用限制性内切酶切割目标DNA和载体DNA，产生能相互配对的粘性末端；然后，用连接酶将两者连接起来；最后，将连接物转化到宿主细胞中，宿主细胞通过复制连接物，使其扩增。

DNA克隆广泛应用于基因工程、蛋白表达和基因治疗等领域。

RNA操作技术RNA是生物体内转录出的中间产物，包括mRNA、rRNA、tRNA等不同类型。

下面将介绍几种常见的RNA操作技术。

1.RNA提取RNA提取是从生物体中分离纯化RNA的过程。

常用的RNA提取方法包括酚-氯仿法、离心柱法和磁珠法等。

其中，酚-氯仿法是最常用的方法，通过酚等有机溶剂和氯仿共同沉淀DNA和蛋白质，使RNA在上清液中得到富集。

2.RT-PCR（逆转录聚合酶链反应）RT-PCR是将RNA转录为cDNA，并利用PCR扩增cDNA的技术。

第五章分子生物学研究法（上）------DNA RNA及蛋白质操作技术1. 简述PCR技术。

课本P165.2 .简述核酸的凝胶电泳。

答：将某种分子放到特定的电场中，它就会以一定的速度向适当的电极移动。

某物质在电场作用下的迁移速度叫作电泳的速率，它与电场强度成正比，与该分子所携带的净电荷数成正比，而与分子的磨擦系数成反比（分子大小、极性、介质的粘度系数等）。

在生理条件下，核酸分子中的磷酸基团是离子化的，所以，DNA和RNA实际上呈多聚阴离子状态（Polyanions）。

将DNA、RNA放到电场中，它就会由负极 -正极移动。

在凝胶电泳中，一般加入溴化乙锭（EB）--ethidium bromide 染色，此时，核酸分子在紫外光下发出荧光，肉眼能看到约50ng DNA所形成的条带。

3. 什么是south 杂交？指将经过电泳分离的DNA片断转移到一定的固相支持物的过程第七章基因的表达与调控（上）---- 原核基因表达调控模式1.简述代谢物对基因表达调控的两种方式。

① 转录水平上的调控(transcriptional regulation) ；② 转录水平上的调控(post-transcriptional regulation) ，包括mRNA 加工成熟水平上的调控(differen,tial processing of RNA transcript和翻译水平上的调控(differential translation of mRNA)。

3.简述乳糖操纵子的调控模型。

A、乳糖操纵子的组成：大肠杆菌乳糖操纵子含Z、Y、A三个结构基因，分别编码半乳糖苷酶、透酶和半乳糖苷乙酰转移酶，此外还有一个操纵序列0, —个启动子P和一个调节基因I。

B、阻遏蛋白的负性调节：没有乳糖存在时，I基因编码的阻遏蛋白结合于操纵序列O处，乳糖操纵子处于阻遏状态,不能合成分解乳糖的三种酶；有乳糖存在时,乳糖作为诱导物诱导阻遏蛋白变构,不能结合于操纵序列,乳糖操纵子被诱导开放合成分解乳糖的三种酶。

DNArna实验知识点1. 引言DNArna实验是生物学研究中常用的一种实验方法，通过转录过程将DNA转化为RNA，进一步揭示基因的功能和表达方式。

本文将介绍DNArna实验的基本原理、实验步骤以及相关技术。

2. 基本原理DNArna实验基于中心法则，即DNA通过转录作用形成RNA，然后通过翻译作用转化为蛋白质。

转录是DNA信息传导的第一步，通过RNA聚合酶酶催化下，DNA的双链解旋并与核苷酸配对形成mRNA。

这一过程的关键是选择性地复制DNA的部分区域，从而决定了转录产物的种类和数量。

3. 实验步骤DNArna实验主要包括DNA提取、逆转录、PCR扩增、细胞培养和蛋白质检测等步骤。

下面将介绍每个步骤的具体操作：步骤1：DNA提取•从目标生物体中提取DNA，常用方法包括酚/氯仿法、离心法等。

这一步骤的目的是从细胞中分离出DNA，并去除其他的细胞成分。

步骤2：逆转录•将DNA转化为cDNA（亦称为逆转录过程），这一步骤主要依靠逆转录酶的作用。

逆转录酶能够将RNA-DNA复合物中的RNA分子替换为DNA 分子，生成cDNA。

步骤3：PCR扩增•使用聚合酶链反应（PCR）扩增cDNA。

PCR是一种体外合成DNA的技术，能够快速而特异地扩增目标DNA序列。

通过PCR扩增，可以大量复制目标基因序列，为后续的分析和检测提供充足的材料。

步骤4：细胞培养•将PCR扩增得到的cDNA插入到目标细胞中，培养出细胞系，以便进一步分析其基因表达情况。

细胞培养的条件需要根据具体实验目的进行优化，并确保细胞的生长和表达状态。

步骤5：蛋白质检测•使用蛋白质检测技术，如Western blotting或ELISA等，对目标蛋白质进行检测。

这些技术能够定量和鉴定目标蛋白质的表达水平，从而对基因的功能进行进一步分析。

4. 相关技术DNArna实验的基本步骤可以结合多种相关技术进行优化和扩展。

以下列举一些常用的相关技术：•单细胞分析：利用单细胞技术，可以研究细胞间的差异性，揭示单个细胞的基因表达状况，并探索细胞发育和疾病发展的机制。