分子生物学第五章 分子生物学研究法--DNA、RNA及蛋白质操作技术

分子生物学课程教学大纲课程名称：分子生物学（Molecular Biology）课程编号：1313072215课程类别：专业课总学时数：68 课内实验时数：18学分：3.5开课单位：生命科学学院生物技术教研室适用专业：生物技术适用对象：本科（四年）一、课程的性质、类型、目的和任务分子生物学为高等学校生物技术专业学生必修的一门专业基础课，是从分子水平研究生命本质为目的的一门新兴边缘学科，主要研究核酸、蛋白质等生物大分子的功能、形态结构特征及其重要性和规律性的科学，是人类从分子水平上真正揭开生物世界的奥秘，由被动地适应自然界转向主动地改造和重组自然界的基础学科。

通过分子生物学的教学，应使学生了解分子生物学的发展历史以及最新研究成果；熟练掌握DNA的结构与功能、RNA在蛋白质合成中的功能、蛋白质的结构与功能、遗传密码及基因表达调控的本质；了解现代分子生物学基本研究方法，并能运用分子生物学的理论知识分析、研究和解决问题，为进一步学习有关专业课程及从事基因工程领域的研究工作奠定基础。

二、本课程与其它课程的联系与分工从学科角度来讲，分子生物学涵盖面非常广，与生物学、生物化学和细胞生物学、遗传学等生命科学课程有交叉，《生物化学》是先修课程。

三、教学内容及教学基本要求[1]表示“了解”；[2]表示“理解”或“熟悉”；[3]表示“掌握”；△表示自学内容；○表示略讲内容；第一章绪论第一节引言创世说与进化论[1]；细胞学说[2]；经典的生物化学和遗传学[3]；DNA的发现[2]第二节分子生物学简史[1]第三节分子生物学研究的主要内容分子生物学的含义[3]；DNA重组技术、基因工程技术概念[3]；分子生物学研究的主要内容[3]第四节展望分子生物学的一些分支学科[1]；分子生物学发展的趋势[1]重点：分子生物学的含义和研究内容难点：分子生物学的研究内容教学手段：多媒体教学教学方法：讲授法作业：1．简述阵德尔、摩尔根和沃森等人对分子生物学发展的主要贡献。

可编辑修改精选全文完整版第五章分子生物学研究法（上）DNA、RNA及蛋白质操作技术分子生物学研究之所以从20世纪中叶开始得到高速发展，其中最主要的原因之一是现代分子生物学研究方法、特别是基因操作和基因工程技术的进步。

基因操作主要包括DNA分子的切割与连接、核酸分子杂交、凝胶电泳、细胞转化、核酸序列分析以及基因的人工合成、定点突变和PCR扩增等，是分子生物学研究的核心技术。

基因工程是指在体外将核酸分子插入病毒、质粒或其它载体分子，构成遗传物质的新组合，使之进入新的宿主细胞内并获得持续稳定增殖能力和表达。

因此，基因工程技术其实是核酸操作技术的一部分，只不过我们在这里强调了外源核酸分子在另一种不同的寄主细胞中的繁衍与性状表达。

事实上，这种跨越天然物种屏障、把来自任何生物的基因置于毫无亲缘关系的新的寄主生物细胞之中的能力，是基因工程技术区别于其它技术的根本特征。

本章将在回顾重组DNA技术发展史的基础上，讨论DNA操作技术、基因克隆、表达分析技术及蛋白质组学、单核苷酸多态性分析等现代生物学领域里最广泛应用的实验技术和方法。

5. 1 重组DNA技术史话近半个多世纪来，分子生物学研究取得了前所未有的进步，概括地说，主要有三大成就：第一，在20世纪40年代确定了遗传信息的携带者、即基因的分子载体是DNA而不是蛋白质，解决了遗传的物质基础问题；第二，50年代提出了DNA分子的双螺旋结构模型和半保留复制机制,解决了基因的自我复制和世代交替问题；第三，50年代末至60年代，相继提出了“中心法则”和操纵子学说，成功地破译了遗传密码，阐明了遗传信息的流动与表达机制。

但是，由于缺乏有效的分离和富集单一DNA分子的技术，科学家无法对这类物质进行直接的生化分析。

事实上，DNA分子体外切割与连接技术及核苷酸序列分析技术的进步直接推动了重组DNA技术的产生与发展。

因为重组DNA的核心是用限制性核酸内切酶（Restriction endonuclease，RE）和DNA连接酶对DNA分子进行体外切割与连接，所以，科学家认为，这些工具酶的发现和应用是现代生物工程技术史上最重要的事件（表5-1）。

分子生物学内容方法
分子生物学是一门研究生物分子的结构、功能和相互作用的学科。

该学科主要研究DNA、RNA、蛋白质等分子在生物体内的生物学功能以及它们之间相互作用所涉及的分子机制。

分子生物学的主要研究方法包括：
1. DNA克隆技术：通过PCR反应将DNA片段扩增、定向切割并插入载体，构建出可以自我复制的DNA分子。

2. 基因编辑技术：包括CRISPR-Cas9等可精准调整基因序列，实现基因改良。

3. 蛋白表达速成技术：如GST-tag、6xHis-tag等融合表达，简化蛋白纯化步骤，提高表达纯度。

4. PCR技术：多项PCR技术可扩增DNA样品，在基因诊断、疾病检测、病菌检测和基因操作等方面有广泛应用。

5. 蛋白质鉴定技术：包括2D PAGE、Tandem Mass Spectrometry 等，可对蛋白质进行鉴定、定量和分析。

这些方法在研究生物分子间相互作用以及调控机制方面具有广泛应用，对于生命科学领域的研究和实际应用具有重要意义。

分子生物学第五章分子生物学研究法（上）——DNA、RNA及蛋白质操作技术第三节RNA操作技术第四节SNP的理论与应用第五节基因克隆技术第六节蛋白质组与蛋白质组学技术夏玉琼2013-10-10目录RNA操作技术cDNA文库的构建基因文库的筛选SNP的理论与应用基因克隆技术蛋白质与蛋白质组学技术分子生物学 夏玉琼 西安电子科技大学cDNA文库的构建切割位点用四碱基特异性的限制性内切酶部分消化DNA 片段，有的仍有切割位点质粒DNA将DNA 克隆进质粒DNA细菌克隆每个细菌都带有不同片段的DNA细菌转化分子生物学 夏玉琼 西安电子科技大学cDNA文库的构建cDNA的长度0.5-8 kb载体：质粒载体和噬菌体类载体完整的cDNA文库包含大于5*105的独立克隆分子生物学 夏玉琼 西安电子科技大学目录RNA操作技术cDNA文库的构建基因文库的筛选SNP的理论与应用基因克隆技术蛋白质与蛋白质组学技术分子生物学 夏玉琼 西安电子科技大学基因文库的筛选含义通过某种特殊方法从基因文库中鉴定出含有所需重组DNA分子的特定克隆的过程筛选方法核酸杂交法PCR筛选法免疫筛选法分子生物学 夏玉琼 西安电子科技大学核酸杂交法培养基上的菌落盖上硝酸纤维素膜移去硝酸纤维素膜裂解、中和去除细菌蛋白DNA 印迹32P 标记探针杂交放射自显影图像挑出阳性克隆保存母板分子生物学 夏玉琼 西安电子科技大学PCR筛选法需获得基因特异性引物将整个基因文库保存在多孔培养板上用设计好的基因探针对每个孔PCR筛选，挑出阳性的孔对阳性的孔再稀释到次级多孔板中PCR筛选重复稀释重复筛选直到与目的基因对应的单个克隆分子生物学 夏玉琼 西安电子科技大学免疫筛选法文库铺于E.coli 形成噬菌斑转移到硝酸纤维素膜吸收λ噬菌体中表达的外源蛋白保存原板，加入一抗筛选膜上的噬菌斑印迹洗去未结合的抗体加入酶偶联的二抗加底物显色从保存板上挑出阳性噬菌斑一抗：第一抗体，识别目标蛋白二抗：抗体的抗体，能增强信号，增加该方法的灵活性分子生物学 夏玉琼 西安电子科技大学目录RNA操作技术SNP的理论与应用SNP概述SNP的检测技术SNP的应用基因克隆技术蛋白质与蛋白质组学技术分子生物学 夏玉琼 西安电子科技大学SNP概述single nucleotide polymorphism,pronounced “snips”单核苷酸多态性基因组DNA序列中由于单个核苷酸的突变而引起的多态性，发生频率1%或更高例如：某些人的染色体上的某个位置为A，而另外一些人的同样位置是T，染色体DNA同一位置上的每个碱基类型叫做一个等位位点继RFLP和SSR之后的第三代遗传标记遗传标记：在遗传分析上用作标记的基因分子生物学 夏玉琼 西安电子科技大学第一代遗传标记：RFLPRFLP标记是发展最早的DNA标记技术。

分子学研究法——DNA、RNA和蛋白质PPTxx年xx月xx日contents •引言•DNA和RNA的结构和功能•蛋白质的结构和功能•DNA、RNA和蛋白质的分析方法•分子学研究的应用•结论目录01引言1分子学研究的重要性23分子学研究对于理解生物体和疾病的机制至关重要分子学研究有助于疾病的预防、诊断和治疗分子学研究为新药发现和开发提供理论基础DNA是生物遗传信息的载体，负责编码生物体的所有特征RNA在细胞内扮演多种角色，包括转录、翻译和调节蛋白质是细胞内功能最丰富的分子，参与细胞构造、代谢和信号传导等DNA、RNA和蛋白质的生物角色分子学研究的历史和发展分子生物学起源于19世纪末，遗传学家孟德尔的实验研究分子生物学在20世纪末得到了迅速发展，推动了基因组学和蛋白质组学的研究20世纪中叶，DNA双螺旋结构被揭示目前，分子生物学已经渗透到生物学、医学和农学等多个领域，为人类健康和发展做出了巨大贡献02DNA和RNA的结构和功能DNA分子由两条反向平行的多核苷酸链组成，通过氢键相互作用形成双螺旋结构。

DNA双螺旋结构脱氧核糖核苷酸是DNA的基本单位，由一分子脱氧核糖、一分子磷酸和一分子含氮碱基组成。

DNA的基本单位DNA是生物体的遗传物质，负责储存和传递遗传信息。

DNA的功能DNA的结构和功能03RNA的功能RNA在蛋白质合成过程中起关键作用，负责将DNA中的遗传信息转录成mRNA，并将氨基酸转运到核糖体中。

RNA的结构和功能01RNA的分类RNA分为信使RNA（mRNA）、转运RNA（tRNA）和核糖体RNA（rRNA）。

02RNA的结构RNA分子由核糖、磷酸和含氮碱基组成，通过磷酸二酯键形成线性分子。

DNA和RNA的相互转化DNA和RNA在细胞内可以相互转化，DNA可以转录成mRNA，而mRNA可以翻译成蛋白质。

DNA和RNA在生物体内的相互作用DNA和RNA的遗传信息传递DNA中的遗传信息通过DNA复制传递给子代细胞，并通过mRNA的转录和翻译传递给蛋白质。

分子生物学考点整理符广勇朱兰第一章．绪论一、分子生物学概念分子生物学是从分子水平研究生命本质为目的的一门新兴边缘学科，是研究核酸、蛋白质等所有生物大分子结构与功能相互关系的科学，是人类从分子水平上真正揭开生物世界奥秘、由被动地适应自然界转向主动地改造和重组自然界的基础学科。

二、重组DNA技术又称基因技术，是20世纪70年代初兴起的技术科学，目的是将不同的DNA片段按照人们的设计定向连接起来，在特定的受体细胞中与载体同时复制并得到表达，产生影响受体细胞的新的遗传性状。

三、基因表达的调控基因表达的调控主要表现在信号传导研究、转录因子研究及RNA剪辑三个方面。

四、转录因子转录因子是能与基因5`端上游特定序列专一结合，从而保证目的基因以特定的强度在特定的时间与空间表达的蛋白质分子。

第二章．染色体与DNA一、染色体上的蛋白质染色体上的蛋白质主要包括组蛋白和非组蛋白。

根据凝胶电泳性质可以把组蛋白分为H1、H2A、H2B、H3、H4。

这些组蛋白都含有大量的赖氨酸和精氨酸。

二、组蛋白的特性1．进化上的极端保守性不同种生物组蛋白的氨基酸组成是十分相似的，特别是H3、H4。

2.无组织特异性到目前为止，仅发现鸟类、鱼类及两栖类红细胞不含H1而带有H5，精细胞染色体的组蛋白是鱼精蛋白这两个例外。

3．肽链上氨基酸分布的不对称性碱性氨基酸集中分布在N端的半条链上。

4.组蛋白的修饰作用包括甲基化、乙酰化、磷酸化、泛素化及ADP核糖基化。

5.富含赖氨酸的组蛋白H5三、HMG蛋白叫高迁移率蛋白四、真核细胞DNA序列的分类1.不重复序列2.中度重复序列3.高度重复序列重复序列的意义：若某一重复序列出现错误，对基因的影响不大，稳定性较高；在短时间内可同时产生大量的基因产物。

重复序列的应用:应用于分子标记的作用：卫星DNA（便于分子标记）和微卫星DNA五、真核生物基因组与原核生物基因组的区别1.真核基因组庞大，原核生物基因组小2.真核基因组存在大量的重复序列，原核基因组没有重复序列3.真核基因组大部分是非编码序列，原核基因组大多是编码序列4.真核基因组的转录产物为单顺反子，原核基因组转录产物多为多顺反子5.真核基因是断裂基因，有内含子结构，原核基因为连续基因，几乎没有内含子结构6.真核基因组存在大量的顺式作用原元件，包括启动子、增强子和沉默子等，原核基因组基本没有增强子和沉默子7.真核基因组存在大量的DNA多态性，原核基因组很少有8.真核基因组具有端粒结构，原核基因组没有端粒结构六、重叠基因（Overlapping gene）指两个或两个以上的基因共有一段DNA序列，或是指一段DNA序列成为两个或两个以上的基因的组成部分。

第五章分子生物学研究法（上）------DNA RNA及蛋白质操作技术1. 简述PCR技术。

课本P165.2 .简述核酸的凝胶电泳。

答：将某种分子放到特定的电场中，它就会以一定的速度向适当的电极移动。

某物质在电场作用下的迁移速度叫作电泳的速率，它与电场强度成正比，与该分子所携带的净电荷数成正比，而与分子的磨擦系数成反比（分子大小、极性、介质的粘度系数等）。

在生理条件下，核酸分子中的磷酸基团是离子化的，所以，DNA和RNA实际上呈多聚阴离子状态（Polyanions）。

将DNA、RNA放到电场中，它就会由负极 -正极移动。

在凝胶电泳中，一般加入溴化乙锭（EB）--ethidium bromide 染色，此时，核酸分子在紫外光下发出荧光，肉眼能看到约50ng DNA所形成的条带。

3. 什么是south 杂交？指将经过电泳分离的DNA片断转移到一定的固相支持物的过程第七章基因的表达与调控（上）---- 原核基因表达调控模式1.简述代谢物对基因表达调控的两种方式。

① 转录水平上的调控(transcriptional regulation) ；② 转录水平上的调控(post-transcriptional regulation) ，包括mRNA 加工成熟水平上的调控(differen,tial processing of RNA transcript和翻译水平上的调控(differential translation of mRNA)。

3.简述乳糖操纵子的调控模型。

A、乳糖操纵子的组成：大肠杆菌乳糖操纵子含Z、Y、A三个结构基因，分别编码半乳糖苷酶、透酶和半乳糖苷乙酰转移酶，此外还有一个操纵序列0, —个启动子P和一个调节基因I。

B、阻遏蛋白的负性调节：没有乳糖存在时，I基因编码的阻遏蛋白结合于操纵序列O处，乳糖操纵子处于阻遏状态,不能合成分解乳糖的三种酶；有乳糖存在时,乳糖作为诱导物诱导阻遏蛋白变构,不能结合于操纵序列,乳糖操纵子被诱导开放合成分解乳糖的三种酶。

第一章绪论1分子生物学是研究核酸、蛋白质等生物大分子的结构与功能,并从分子水平上阐明蛋白质与蛋白质、蛋白质与核酸之间的互作及其基因表达调控机理的学科。

2医学分子生物学是分子生物学的一个重要分支,是从分子水平上研究人体和疾病相关生物在正常和疾病状态下的生命活动及其规律, 从分子水平上开展人类疾病的预防、诊断和治疗研究的一门科学。

3顺反子是编码一条多肽链的单位。

有关基因就是一个顺反子4 C值(C value :单倍体基因组中 DNA 的含量。

第二章染色体与 DNA1基因:基因是产生一条多肽链或功能 RNA 所必须的全部核苷酸序列 , 是决定遗传性状的功能单位。

2基因组:细胞或生物体的一套完整单倍体的遗传物质的总和。

3C 值矛盾也称 C 值悖论,指生物体的进化程度与基因组大小之间不完全成比例的现象。

4DNA 的一级结构是指 4种脱氧核苷酸的连接(磷酸二酯键及其排列顺序, DNA 序列是这一概念的简称。

5DNA 的二级结构是指两条多核苷酸链反向平行盘绕所产生的双螺旋结构。

6DNA 的高级结构是指 DNA 双螺旋进一步扭曲盘绕所形成的特定空间结构。

是一种比双螺旋更高层次的空间构象。

7DNA 的半保留复制是由亲代 DNA 生成子代 DNA 时, 每个新形成的子代DNA 中, 一条链来自亲代 DNA ,而另一条链则是新合成的,这种复制方式称半保留复制。

8复制子是 DNA 复制时在复制的局部将链解开,形成复制单位,称为复制子。

9 复制叉是复制时 DNA 双链解开分成二股单链‚新链沿着张开的二股单链生成,复制中形成的这种 Y 字形的结构称为复制叉10 DNA 的半不连续复制是 DNA 复制时其中一条子链的合成是连续的,而另一条子链的合成是不连续的,故称半不连续复制。

11前导链是在 DNA 复制时,合成方向与复制叉移动的方向一致并连续合成的链为前导链; 合成方向与复制叉移动的方向相反,形成许多不连续的片段,最后再连成一条完整的 DNA 链为滞后链。