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3中外医疗中外医疗I N FOR I GN M DI L TR TM N T2008N O .26CH I NA FOR EI G N M EDI CAL TREATM ENT综述铜绿假单胞菌是医院内感染的重要病原菌,具有广谱耐药性的菌株日益增,其对妥布霉素、庆大霉素、丁胺卡那霉素、羧苄青霉素和氧哌嗪青霉素的耐药率在30％～60％之间,且不断上升。
1994年报道对氨曲南和泰能的耐药率分别为43.7％和35％。
目前对其耐药机制研究也越来越多。
目前认为耐药机制包括β——内酰胺酶的水解、外膜通透性降低、主动外排系统的排出等以及它们之间的协同作用,使细菌产生了高度耐药。
1β-内酰胺酶的水解铜绿假单胞菌通过酶对抗生素的水解作用,可以使产酶菌在有抗生素存在的环境下仍能够生存[1]。
由β-内酰胺酶介导的耐药机制主要有:(1)铜绿假单胞菌产碳青霉烯酶水解碳青霉烯类抗生素;(2)所有的铜绿假单胞菌都能够表达由染色体介导的A m pC 酶,但β-内酰胺类抗生素等诱导剂可增加表达水平。
铜绿假单胞菌产生的A m pC 酶微弱水解碳青霉烯,合并铜绿假单胞菌膜通透性下降而导致耐药性的产生,是铜绿假单胞菌对亚胺培南产生低水平耐药的主要机制。
2氨基糖苷类修饰酶耐氨基糖苷类抗生素的主要机制是产生纯化酶,催化氨基糖苷类抗生素氨基或羧基的共价修饰,导致氨基糖苷类抗生素与核糖体结合减少,促进药物摄取的E D P-l I 阻断而产生耐药性[2]。
国内从铜绿假单胞菌中检出4种A A C 基因和2种A N T 基因以及1种A PH 基因,一种氨基糖苷类修饰酶可修饰多种氨基糖苷类药物使之失活[3]。
3改变抗生素作用靶位细菌在抗生素作用下产生诱导酶对菌体成分进行化学修饰,使其与抗生素结合的有效部位变异,使药物不敏感而细菌本身的生物功能正常。
对作用于铜绿假单胞菌的β-内酰胺类抗生素的敏感性和耐药性,PBP5的β-内酰胺酶活性具有重要作用,PB P5缺失的铜绿假单胞菌可显示高敏特性[4]。
扶正解毒化瘀方对多重耐药铜绿假单胞菌MexAB-OprM外排泵表达影响的研究【摘要】铜绿假单胞菌是一种具有多重耐药性的病原菌，其中MexAB-OprM外排泵是其主要耐药机制之一。
本研究旨在探讨中药方剂扶正解毒化瘀方对铜绿假单胞菌MexAB-OprM外排泵表达的影响。
研究结果显示，扶正解毒化瘀方能显著抑制铜绿假单胞菌的MexAB-OprM外排泵表达，从而提高其对抗药物的敏感性。
该研究为探索新型抗菌药物提供了理论基础，具有重要的临床应用前景。
这一发现有助于深入理解中药与耐药性菌株之间的相互作用机制，为临床治疗提供新的思路和方法。
【关键词】关键词：铜绿假单胞菌、多重耐药性、MexAB-OprM外排泵、扶正解毒化瘀方、耐药机制、实验设计、实验结果、研究结论、应用前景。
1. 引言1.1 研究背景铜绿假单胞菌是一种致病性较强的革兰氏阴性细菌，常导致医院感染的主要病原菌之一。
铜绿假单胞菌对多种抗生素表现出耐药性，其中多重耐药铜绿假单胞菌(MDR-Pseudomonas aeruginosa)更是对多种抗生素产生耐药，给临床治疗带来了很大挑战。
目前，人们对铜绿假单胞菌的耐药机制进行了深入研究，发现该菌通过多种途径实现耐药，其中MexAB-OprM外排泵是其主要耐药机制之一。
MexAB-OprM外排泵是一种重要的外排泵系统，能有效排出抗菌药物，降低其在细胞内的浓度，从而减少药物的治疗效果。
扶正解毒化瘀方是一种传统中药方剂，具有扶正固本、解毒化瘀的功效。
研究表明，扶正解毒化瘀方对多种耐药菌的外排泵表达有一定的影响，但其对多重耐药铜绿假单胞菌MexAB-OprM外排泵的影响尚未有明确报道。
本研究旨在探究扶正解毒化瘀方对多重耐药铜绿假单胞菌MexAB-OprM外排泵表达的影响，为进一步研究其抗菌机制提供理论基础。
1.2 研究目的研究目的是通过实验研究扶正解毒化瘀方对多重耐药铜绿假单胞菌MexAB-OprM外排泵表达的影响，探讨其对耐药性的调控机制及可能的作用途径，为开发新型抗菌药物提供理论基础和实验依据。
扶正解毒化瘀方对多重耐药铜绿假单胞菌MexAB-OprM外排泵表达影响的研究【摘要】本研究旨在探究扶正解毒化瘀方对多重耐药铜绿假单胞菌MexAB-OprM外排泵表达的影响。
首先介绍了多重耐药铜绿假单胞菌及其外排泵MexAB-OprM的相关知识，探讨了扶正解毒化瘀方的药理作用。
实验结果显示，扶正解毒化瘀方能够显著抑制MexAB-OprM 外排泵的表达，从而降低铜绿假单胞菌的多重耐药性。
结论表明，扶正解毒化瘀方对多重耐药铜绿假单胞菌MexAB-OprM外排泵表达具有一定影响，为开发铜绿假单胞菌治疗新策略提供了新的方向。
未来研究应进一步探究扶正解毒化瘀方的药效机制，为临床治疗提供更多选择。
结论总结了本研究的意义和展望，为应对多重耐药铜绿假单胞菌的挑战提供了新思路。
【关键词】扶正解毒化瘀方、多重耐药铜绿假单胞菌、MexAB-OprM外排泵、药理作用、实验方法、实验结果、影响、研究目的、研究意义、结论、未来研究展望、结论总结1. 引言1.1 背景介绍多重耐药铜绿假单胞菌是一种常见的细菌，其对抗生素的耐药性对临床治疗造成了很大的挑战。
其中外排泵MexAB-OprM是铜绿假单胞菌的一个重要耐药机制，能够将抗生素从细胞内排出，从而导致细菌对抗生素的耐药性。
目前，针对多重耐药铜绿假单胞菌的治疗选项有限，研究扶正解毒化瘀方对其外排泵表达的影响具有重要的临床价值。
扶正解毒化瘀方是一种传统中药方剂，具有扶正解毒、祛瘀化痰的作用。
近年来，研究发现扶正解毒化瘀方对多种细菌具有一定的抗菌作用，但其对多重耐药铜绿假单胞菌MexAB-OprM外排泵表达的影响尚未明确。
通过深入研究扶正解毒化瘀方对多重耐药铜绿假单胞菌的作用机制，有望为临床治疗提供新的思路和方法。
本研究旨在探讨扶正解毒化瘀方对多重耐药铜绿假单胞菌MexAB-OprM外排泵表达的影响，为多重耐药细菌的治疗提供新的思路和药物选择。
1.2 研究目的研究目的：本研究旨在探究扶正解毒化瘀方对多重耐药铜绿假单胞菌MexAB-OprM外排泵表达的影响。
铜绿假单胞菌对14种抗菌药物的多重耐药分析作者：牛文娟来源：《中国医药导报》2010年第01期[摘要] 目的:调查我院2008年6月～2009年6月临床分离的铜绿假单胞菌在临床感染中的耐药特征。
方法:收集我院2008年6月～2009年6月临床分离的100例铜绿假单胞菌。
使用Kirby-Bauer纸片琼脂扩散法对14种抗菌药物的抑菌环直径,按CLSI(美国临床实验室标准化研究所)2009年规定判读结果。
结果:铜绿假单胞菌对头孢吡肟、阿米卡星、美罗培南、头孢他啶、头孢哌酮/舒巴坦的耐药率分别为2.1%、4.2%、9.7%、17.1%、20.0%,对替卡西林、磷霉素呈高水平耐药,其耐药率分别为78.4%、62.0%。
结论:我院临床分离的铜绿假单胞菌对14种抗菌药物均有不同程度的耐药。
[关键词] 铜绿假单胞菌;多重耐药;碳青霉烯类抗生素[中图分类号] R378.99+1 [文献标识码]B[文章编号]1673-7210(2010)01(a)-181-02铜绿假单胞菌(Pseudomonasaeruginosa,PA)属革兰阴性杆菌,假单胞菌属,常定植入呼吸道等表面,是医院感染的重要致病菌,为条件致病菌。
当机体免疫力低下时,可引起多种感染。
由于铜绿假单胞菌对多种抗生素耐药,给临床治疗造成极大困难。
近年来,随着广谱头孢菌素类抗生素、碳青霉烯类抗生素等在临床上大量使用,铜绿假单胞菌对临床常用抗生素灵敏度不断下降,尤其是对碳青霉烯类抗生素的耐药逐渐上升,严重威胁临床的抗感染治疗。
为此笔者调查了近一年来我院临床分离的铜绿假单胞菌对14种抗菌药物的耐药率。
1 材料与方法1.1 菌株来源我院2008年6月～2009年6月各科室送来的痰液、灌洗液、脓液、尿液、伤口分泌物、血液等标本分离的铜绿假单胞菌。
1.2药敏纸片阿米卡星、庆大霉素、哌拉西林、头孢他啶、环丙沙星、头孢吡肟、头孢哌酮/舒巴坦、哌拉西林/他唑巴坦、氨曲南、头孢哌酮、亚胺培南、美罗培南、替卡西林、磷霉素为英国OXOID公司产品。
铜绿假单胞菌耐药性的形成机制及其对抗菌治疗的影响分析铜绿假单胞菌（Pseudomonas aeruginosa）是一种常见的耐药性细菌，它具有多种耐药机制，严重影响了抗菌治疗的效果。
本文将深入探讨铜绿假单胞菌耐药性的形成机制，并分析该耐药性对抗菌治疗的影响。
一、铜绿假单胞菌耐药性的形成机制1. 药物外排泵系统：铜绿假单胞菌具有多种药物外排泵系统，如MexAB-OprM、MexCD-OprJ和MexEF-OprN等。
这些药物外排泵系统能有效地将抗生素从细胞内外排出，降低药物在细胞内的浓度，从而减少细胞所受到的药物压力。
2. 胞内酶的产生：铜绿假单胞菌能够产生β-内酰胺酶，这种酶能够有效地降解β-内酰胺类抗生素，如青霉素和头孢菌素等。
这种酶的产生使得抗生素在细胞内无法发挥其抗菌作用，导致细菌耐药。
3. 创建生物膜：铜绿假单胞菌具有生物膜形成的能力，生物膜提供了一种保护层，阻碍抗生素的进入，使得细菌在生物膜内相对于抗生素更加耐受。
此外，生物膜还能够促进细菌间的基因传递，进一步增加耐药性。
4. 固定多样的耐药基因：铜绿假单胞菌具有丰富的基因库，其中包括多种耐药基因。
这些耐药基因通过水平基因转移的方式在菌群内传递，使得菌群中的细菌获得了耐药性。
此外，铜绿假单胞菌还能够在适应抗生素选择压力的过程中产生新的耐药基因，进一步增加了其耐药性。
二、铜绿假单胞菌耐药性对抗菌治疗的影响1. 临床治疗效果下降：铜绿假单胞菌耐药性的形成导致了常用抗菌药物对其的治疗效果下降。
当患者感染耐药性铜绿假单胞菌时，抗菌药物可能无法有效杀灭菌株，从而延长感染时间，增加治疗难度和费用。
2. 增加治疗失败风险：铜绿假单胞菌耐药性的增加使得治疗失败的风险增加。
耐药性细菌在抗菌药物的压力下存活，可能发展出新的耐药基因，使其逐渐耐药多种抗菌药物。
这使得以往有效的抗菌治疗方案无法应用于与该菌株感染的患者，导致治疗失败。
3. 交叉感染的风险增加：铜绿假单胞菌耐药性的增加使得在医疗机构内交叉感染的风险增加。
第22卷 第11期医学研究生学报Vol.22 No.11 2009年11月Journal of Medical Postgraduates Nov.2009・综 述・铜绿假单胞菌的常见耐药机制徐小勇综述, 施 毅审校第二军医大学南京临床学院(南京军区南京总医院)呼吸内科,江苏南京210002摘要: 铜绿假单胞菌(P A)是目前临床上常见的致病菌,耐药发生率高。
耐药的机制涉及外膜的低通透性、外排泵的过度表达、产生灭活酶、靶位的改变或增加等。
P A的耐药往往是多方面的,常导致多耐药,给临床治疗带来严峻挑战。
关键词: 铜绿假单胞菌; 抗菌药物耐药中图分类号: R378.99 文献标识码: A 文章编号: 100828199(2009)11212202053M echan is m s underlyi n g the antibiotic resistance of Pseudom onas aeruginosaXU Xiao2yong revie w ing,SH I Yi checking(D epart m en t of R espiratory M ed icine,N anjing School of C lin ical M ed icine,the S econd M ilita ry M ed icalU niversity/J inling Hospital,N anjing210002,J iangsu,China)Abstract: Pseudo m onas aeruginosa,a ubiquit ous organis m,shows a re markable resistance t o antibi ot2 ics because of its l ow per meability of the outer2me mbrane,over2exp ressi on of efflux pump s,inactivati on of antibotics,or mutati ons in targets.These mechanis m s are often p resent si m ultaneously,and increase the burden on clinical therapy.Key words: Pseudo m onas aeruginosa; Antibi otic resistance0 引 言 铜绿假单胞菌(p seudo monas aeruginosa,P A)广泛分布于自然界,为革兰阴性杆菌。
铜绿假单胞菌感染和耐药机制铜绿假单胞菌是革兰氏阴性杆菌，是条件致病菌，它对健康的机体几乎不会引起感染，但是对免疫受损的机体可以引起严重的感染，免疫受损的机体包括囊性纤维化患者，癌症病人，艾滋病毒感染者，严重烧伤病人[1] 。
由于传统的抗生素治疗，使铜绿假单胞菌对许多抗生素产生了严重的耐药性，它可以产生各种灭活酶或修饰酶, 如内酰胺酶等; 菌体蛋白结构和功能改变逃避抗菌药物作用; 膜屏障与主动排外; 形成生物保护膜等[4] ，来抵制抗生素的作用。
这也是在临床上很棘手的问题，使铜绿假单胞菌不仅成为难以治疗的病原菌，也使其成为众多研究细菌致病性和耐药性的对象。
首先来了解一下铜绿假单胞菌引起的常见的感染和疾病。
1、铜绿假单胞菌引起的常见的感染和疾病在临床上发现呼吸科和烧伤科铜绿假单胞菌感染率和检出率较高。
1.1 铜绿假单胞菌相关性肺炎它包括慢性阻塞性肺疾病(COPD)，医院获得性肺炎(CAP，呼吸机相关性肺炎(VAP), 气管镜相关性肺炎，囊性纤维变性(CF等。
慢性阻塞性肺疾病( COPD) 慢性阻塞性肺疾病( COPD) 是以感染为主要表现的疾病, 由于其呼吸道防御功能下降, 支气管清除能力减弱, 故能引起多种细菌的感染，铜绿假单胞菌感染是COPD病人急性加重的主要原因。
铜绿假单胞菌一开始就被认为是引起慢性阻塞性肺疾病(COPD的重要的致病菌[10] , Laura的研究证明铜绿假单胞菌引起COP爾人的慢性感染[11]。
医院获得性肺炎( CAP) 铜绿假单胞菌在社区获得性肺炎中不常见，但在医院获得性肺炎(CAP中较常见的病原菌之一[2]。
CAP是COPD常见并发症和重要死亡原因之一，近年来国内关于COPD患者合并CAP 方面的研究得到广泛关注。
同时由于社会人口的老龄化、免疫损害宿主增加、病原菌变迁和抗菌药物耐药率上升等原因, 其致病菌的组成和耐药特性在不同国家、不同地区之间存在着明显差异而且随着时间的推移而不断变迁[6] 。
扶正解毒化瘀方对多重耐药铜绿假单胞菌MexAB-OprM外排泵表达影响的研究【摘要】本研究旨在探讨扶正解毒化瘀方对多重耐药铜绿假单胞菌MexAB-OprM外排泵表达的影响。
通过对MexAB-OprM外排泵及其在多重耐药菌中的作用进行介绍，分析扶正解毒化瘀方成分及其药理作用，揭示该方剂对MexAB-OprM外排泵表达的调控机制。
实验结果表明，扶正解毒化瘀方能显著影响多重耐药菌的外排泵表达水平，为开发新型治疗多重耐药菌感染的药物提供了理论依据。
这一研究为探索多重耐药菌感染的治疗新途径提供了重要参考。
【关键词】多重耐药铜绿假单胞菌、MexAB-OprM外排泵、扶正解毒化瘀方、表达水平、药物治疗1. 引言1.1 研究背景多少、段落等。
以下是内容：多重耐药铜绿假单胞菌是一种常见的医院感染病原体，对抗生素的耐药性日益严重，给临床治疗带来了极大挑战。
MexAB-OprM外排泵是铜绿假单胞菌耐药的主要机制之一，它能够将抗生素从细菌细胞内外排出，导致细菌对抗生素的耐药性增强。
目前，针对多重耐药铜绿假单胞菌感染的治疗选择有限，急需探索新的治疗策略。
传统中医药中有一方名为扶正解毒化瘀方，据说具有抗菌、消炎等功效，是否对多重耐药铜绿假单胞菌的治疗具有潜在作用，尚需进一步研究。
本研究旨在探究扶正解毒化瘀方对多重耐药铜绿假单胞菌MexAB-OprM外排泵表达的影响，为开发新型治疗多重耐药菌感染的药物提供理论依据。
1.2 研究目的本研究旨在探究扶正解毒化瘀方对多重耐药铜绿假单胞菌MexAB-OprM外排泵表达的影响，明确其潜在的抗菌机制。
具体目的包括：1.评估扶正解毒化瘀方对多重耐药铜绿假单胞菌MexAB-OprM外排泵的抑制作用，验证其是否具有降低耐药性的潜力；2.研究扶正解毒化瘀方中各组分的药理作用，揭示其可能的作用机制；3.探讨扶正解毒化瘀方对MexAB-OprM外排泵表达的影响机制，探明其影响途径；4.通过实验设计，验证扶正解毒化瘀方在调控铜绿假单胞菌多重耐药性中的潜在应用价值。
铜绿假单胞菌MexAB-OprM、MexXY-OprM主动外排系统的耐药作用姚慧琳【摘要】Objective To investigate the role of active efflux systems MexAB-OprM and MexXY-OprM in the multidrug resistance of Pseudomonas aeruginosa. Methods Thirty-six strains of multidrug-resistant P. Aeruginosa were isolated from clinical specimens. The minimum inhibitory concentration (MIC) to cefotaxime was determined by agar dilution technique. The interference experiment was conducted in the presence of pump inhibitor carbonyl cyanide m-chlorophenylhydrazone (CCCP). The mRNA of mexA and mexX gene was analyzed by real-time RT-PCR to estimate the expression level of MexAB-OprM and MexXY-OprM efflux systems. The amplified products were analyzed by sequencing. The mechanism of overexpression was studied using Blast software. Results In the presence of CCCP, 24 of the 36 strains of P. Aeruginosa showed 4 times or higher increase of susceptibility to ciprofloxacin. The active efflux phenotype was identified in 66. 7% (24/36) of the strains. MexABOprM efflux system was overexpressed in 41.7% (15/36) of the strains. MexXY-OprM efflux system was overexpressed in 58. 3% (21/36) of the strains. Fifteen strains overexpressed both MexAB-OprM and MexXY-OprM efflux systems simultaneously. Mutation of mexR and mexZ with corresponding amino acid substitution was identified in 4 of the strains overexpressing mexA and mexX. Conclusions Overexpression of active efflux systemsMexAB-OprM and MexXY-OprM in multidrug-resistant P. Aeruginosa is one of the mechanisms contributing to the multidrug resistance of the bacteria which is caused by the mutation of the regulatory genes mexR and mexZ, respectively.%目的探讨MexAB-OprM、MexXY-OprM主动外排系统(外排泵)在多重耐药铜绿假单胞菌耐药机制中的作用.方法选取36株临床分离的多重耐药铜绿假单胞菌,采用琼脂二倍稀释法,测定环丙沙星对铜绿假单胞菌的MIC及进行泵抑制剂碳酰氰基对-氯苯腙(CCCP)存在情况下的干预试验；用实时定量RT-PCR测定结构基因mexA、mexX的mRNA表达水平来判断MexAB-OprM、MexXY-OprM外排泵表达情况；用PCR法分别扩增其调控基因mexR、mexZ,并对其产物测序,用Blast软件在GenBank与已知序列比较,研究其过度表达的机制.结果在CCCP作用下,36株铜绿假单胞菌中24株菌对环丙沙星的敏感性(MIC)由20～320 mg/L提高到2.5～40 mg/L,主动外排表型阳性率为66.7％(24/36),15株菌高表达MexAB-OprM外排系统(41.7％),21株高表达MexXY-OprM外排系统(58.3％).15株高表达MexAB-OprM外排系统铜绿假单胞菌同时表达MexXY-OprM外排系统；12株干预试验阴性的铜绿假单胞菌均无mexA、mexX高表达；随机选择mexA、mexX高表达的4株细菌均发生mexR、mexZ 基因突变,出现氨基酸替代.结论主动外排系统MexAB-OprM、MexXY-OprM在多重耐药铜绿假单胞菌中过度表达是铜绿假单胞菌多重耐药的机制之一；外排泵MexAB-OprM、MexXY-OprM高表达分别与调控基因mexR、mexZ发生变异有关.【期刊名称】《中国感染与化疗杂志》【年(卷),期】2012(012)001【总页数】4页(P32-35)【关键词】外排泵;铜绿假单胞菌;多重耐药【作者】姚慧琳【作者单位】安徽省淮北矿业集团总医院检验科,235000【正文语种】中文【中图分类】R378.991铜绿假单胞菌是医院感染常见的条件致病菌之一，常对多种抗菌药物耐药，所涉及耐药机制相当复杂，包括抗生素灭活酶或修饰酶的生成、外膜低渗透性、外膜通道蛋白缺失、形成生物膜以及主动外排系统等［1］。
铜绿假单胞菌耐药与多重抗药性机制解析铜绿假单胞菌是一种常见的病原菌，具有广泛的耐药性和多重抗药性。
了解铜绿假单胞菌的耐药和抗药机制对于防治感染疾病具有重要意义。
本文将通过对铜绿假单胞菌的耐药和多重抗药性机制进行详细解析。
1. 铜绿假单胞菌的耐药机制铜绿假单胞菌的耐药机制主要包括药物内流、药物靶标突变、药物排出通道改变以及药物降解等多种方式。
首先，铜绿假单胞菌具有药物内流通道的改变能力。
细菌通过改变药物通道的结构和功能来限制药物进入细胞，从而减少药物的有效浓度。
比如，铜绿假单胞菌可通过调节外膜蛋白的表达量和构象来限制药物进入细胞。
其次，铜绿假单胞菌可以发生药物靶标的突变，从而降低药物对其的结合亲和力。
这种突变可能导致药物分子无法与目标蛋白结合，从而失去药物的作用。
例如，铜绿假单胞菌的GyrA蛋白具有突变位点，可导致青霉素等β-内酰胺类抗生素的失效。
此外，铜绿假单胞菌还可以改变药物排出通道，从而增加药物外流的速率。
这主要通过调节药物外排泵的表达量和功能来实现。
铜绿假单胞菌具有多种外排泵，如MexAB-OprM和MexXY-OprM等，这些泵能有效地将药物从细胞内排出，从而使得细菌对药物具有更高的耐药性。
最后，铜绿假单胞菌还可以通过药物的降解来降低药物的有效浓度。
菌体表面的酶可以降解一些抗生素，从而使得药物无法发挥作用。
此外，铜绿假单胞菌还可以产生β-内酰胺酶等药物降解酶，从而使得广谱抗生素失去活性。
2. 铜绿假单胞菌的多重抗药性机制多重抗药性是指细菌对多种抗生素产生耐药性的能力。
铜绿假单胞菌往往具有复杂的多重抗药性机制，其主要包括快速突变、基因水平的水平转移和基因调控的变化等。
首先，铜绿假单胞菌具有高度的突变率，导致其对不同抗生素产生快速适应和耐药。
这种快速突变能力使得铜绿假单胞菌能够在长期的抗生素选择压力下迅速适应新的环境，从而产生多重抗药性。
其次，铜绿假单胞菌具有基因水平的耐药基因转移能力。
细菌可以通过水平基因转移将耐药基因传递给其他菌株，从而扩大耐药菌株的范围。
论 著多药耐药铜绿假单胞菌M ex AB OprM主动外排系统的耐药作用魏志华,沈继录,徐元宏(安徽医科大学第一附属医院检验科,安徽合肥230022)摘要:目的 探讨MexA B Opr M 主动外排系统(外排泵)在多药耐药铜绿假单胞菌耐药机制中的作用。
方法 挑选临床分离的铜绿假单胞菌多药耐药菌株26株、敏感菌株15株及标准质控菌株(A T CC27853),用R T PCR 扩增其内膜转运蛋白mex B 的结构基因mexB 和内参照基因16S r RN A 片段,根据mex B 与16S r RN A 扩增产物的电泳扫描比值,分析mex B mRN A 的表达水平,判断M exA B OprM 的表达情况。
结果 26株多药耐药菌株对14种常用抗菌药物全部耐药,耐药率为100%,15株敏感菌株对14种常用抗菌药物全部敏感;标准质控菌株、所有的敏感菌株和多药耐药菌株均检测出mexB mRN A 基因;耐药菌株的mex B mRN A 水平(2.41 1.10)显著高于敏感菌株(1.47 0.83)(P <0.01)。
结论 M ex A B O prM 主动外排系统表达水平的增高与铜绿假单胞菌多药耐药的形成密切相关。
关键词:铜绿假单胞菌;外排泵;耐药性中图分类号:R378.99+1 文献标识码:A 文章编号:1005 4529(2010)09 1205 03Contribution of MexAB OprM Active Efflux System in Multidrug resistantPseudomonas aeruginosaWEI Zhi hua,SH EN Ji lu,XU Yuan hong(T he F ir st Af f iliated H osp ital,A nhui Medical University ,H ef ei,Anhui 230022,China)Abstract:OBJECTIVE T o inv est igate the effect o f M exA B O prM activ e efflux sy stem in mult idr ug r esistant Ps eudomonas aer uginosa .METHODS T ot ally 26str ains o f multidrug resistant P.aer uginos a ,15strains of susceptible P.aer uginos a and A T CC27853.wer e selected the levels of mex B mRN A o f 15standard susceptible stra ins and 26multidrug resistant str ains wer e detect ed by RT PCR,and the 16S r RN A g ene was a lso amplified as contro l.T he lev els of mexB mR NA wer e analy zed accor ding t o the rat io of electr opho resis scan results of their PCR pr oducts and the 16S r RN A !s .RESULTS T he drug r esist ant rates of 26str ains of multidr ug resistant P.aer uginosa ag ainst 14kinds of ant ibiotics wer e 100%.T he mexB mR NA wer e ex amined in all st rains .T he levels of mex B mRN A in mult idrug r esist ant st rains (2.41 1.10)w ere significantly higher than that o f standar d susceptible stra ins (1.47 0.83)(P <0.01).CONC LUSIONS T he o ver ex pression o f M ex AB OprM act ive efflux system is associated with multidrug resistance of P.aeruginosa .Key words:Pseudomonas aer uginosa ;Efflux pump;Drug resistance收稿日期:2009 11 20; 修回日期:2010 01 07基金项目:安徽省自然科学基金资助(0902*******)通讯作者:徐元宏,E mail:x yhong1964@铜绿假单胞菌(PA E)是医院获得性感染的条件致病菌之一,已成为临床标本中分离出的主要病原菌。
PAE 常对多种抗菌药物耐药,具有先天固有和后天获得的多药高度耐药性,所涉及耐药机制相当复杂,包括抗菌药物灭活酶或修饰酶的生成、外膜低渗透性、外膜孔蛋白缺失、生物膜形成和主动外排等[1]。
笔者主要研究临床分离的多药耐药PAE 和敏感PAE 中Mex AB OprM 的表达情况,探讨其与PAE 多药耐药的关系,为临床治疗多药耐药PAE 提供治疗思路。
1 材料与方法1.1 试剂 T rizol 试剂购自Invitrog en 公司。
Reverse Tr anscription Sy stem 购自Prom eg a 公司。
m ex B 及内参16S rRNA 的引物由上海生工公司合成。
DNA 标志物、rT aq DNA Polym erase 、dNTP M ixture 、10∀PCR 缓冲液购自大连宝生物工程有限公司。
1.2 菌株来源 收集2006年1月~2007年12月1205 中华医院感染学杂志2010年第20卷第9期安徽医科大学第一附属医院临床标本中分离出的铜绿假单胞菌,挑选26株多药耐药株,15株敏感株,经美国M icroScan WalkAw ay 40全自动微生物分析仪鉴定。
1.3 RT PCR 检测M ex AB OprM 的表达水平1.3.1 引物设计与合成 引物序列参照文献[2],由上海生物工程公司合成,见表1。
表1 M ex AB O pr M 内膜转运蛋白结构基因mex B及内参基因16S r RN A 引物引 物 序列(5!#3!)退火温度(∃)片段大小(bp)m exB上游:GT GT T CGGCT CGC AGT ACT C 54244下游:AACCGT CGGGAT TGACCT TG16S rRNA 上游:GGAGGAAGGTGGGGAT GAC G61241下游:AT GGT GTGACGGGCGGTGT G1.3.2 细菌RNA 的提取 接种PAE 与5ml LB 培养液,37∃,200r/min 过夜培养,取2m l 细菌培养液10000r/min 离心1m in 收集菌体;沉淀物中加入1ml T rizol 试剂,用枪头反复吹打裂解细胞,冰上放置10min,室温放置5m in,加入0.2ml(1/5体积)氯仿,用力振荡15s,室温放置3m in,12000r/m in,4∃离心15m in;小心吸取上层无色水样层转移至一新EP 管中,每管加入0.2ml 异丙醇,充分混匀,室温放置10m in,12000r/m in,4∃离心10m in;轻轻倒去上清,加入1ml 75%乙醇洗涤RNA 沉淀,充分混匀,7500r /min,4∃离心5m in;弃上清,短暂干燥RNA 后,每管加入20 l 无RNA 酶的DEPC 水溶解RNA 。
经凝胶电泳后用紫外分光光度计测定RN A 含量及纯度,要求A 260/A 280%2.0。
1.3.3 cDNA 合成 总RNA 样品5 l,70∃变性10min;总反应体系20 l,含4.9 l ddH 2O,4 l Mg Cl 2,2 l 缓冲液,2 l dNT Ps,1 l Randprimer,0.5 l Rnsin,0.6 l AM V;室温放置10min,42∃反应60m in,95∃灭活5min,4∃保存。
1.3.4 PCR 扩增 取上述逆转录产物2 l 作为模版进行PCR 扩增,每个反应体系终体积为25 l,含PCR 水17.375 l,2.5 l 10∀缓冲液,2 l dN TPs,上下游引物各1 l(10 m),2 l 模板,0.125 lTaq DNA 聚合酶。
PCR 反应参数为:95∃∀10m in 预变性;95∃∀30s,退火温度∀30s,72∃∀30s,30个循环;最后72∃延伸5m in 。
仪器为美国ABI7000DNA 扩增仪。
PCR 产物于1%琼脂糖凝胶(含0.1 l/ml 溴乙啶)中电泳,电泳结果由美国BIO RAD GelDocEQ 凝胶成像分析系统扫描,分析PCR 产物的相对含量。
1.3.5 统计学分析 采用t 检验。
2 结 果2.1 mex B 、16S rRNA m RNA 的表达情况 m ex B 、16S rRNA 基因扩增产物大小分别为244bp 和241bp 。
标准株、所有敏感株和耐药株均扩增出m ex B,说明各菌株均有mexB m RNA 表达。
PCR 结果见图1~3。
2.2 PAE 的M IC 结果 所选26株多药耐药PAE 对14种常用抗菌药物全部耐药,耐药率为100%。
15株敏感PAE 对14种常用抗菌药物全部敏感,M IC 结果见表2。
2.3 应用凝胶成像分析系统扫描扩增产物的电泳结果 以16S rRNA 基因扩增产物为参照,将m ex B 基因扩增产物的扫描值与之相比,作为其相对含量。
耐药菌株26株,敏感菌株15株,经t 检验分析,耐药株m ex B 基因扩增产物的相对含量(2.41 1.10)显著高于敏感株(1.47 0.83)(P <0.01)。
3 讨 论PA E 的耐药机制十分复杂,主动外排系统在1206 Chin J N osocom iol Vo l.20N o.92010表2 耐药菌株M IC结果菌株号PIP TZP CTX CRO CAZ FEP ATM IM P M EM GM AM K CIP LVX GAT 14256128>256>25632326432323264488 15256512>256>2566432641616>32>128>163232 18512256>256>25664>12864>64>64>32641688 19256128>256>2563232641616>32>128>163232 215122562561281632643216>32>128>161616 25512256>256>256128128>12832>64>3232163232 30256256>256>256>128>128>1283216>32>128>16832 32>512512>256>256>128>128>128>64>64>32>128>16>32>32 35512256>256>25664128>128>64>64>32>128>16>32>32 37>512>512>256>256>128>128>1286432>32>128163216 38256128>256>256>128>128>1283216>32>128>163232 40512256>256>2563232643232>32>128>16>32>32 41>512256>256>25632641283216>32>128>163232 53512512>256>25664321281664>32>128>16>32>32 56>512>512>256>25664641286432832>16>32>32 57512512>256>25664641286464>3232>163232 58256256>256>2563264643264>3232>163232 59>512512>256>256128128>1283264>3264>1616>32 62>512512>256>256128128>1286464>32>128>16>32>32 65512512>256>2566464>1283264>3232>163232 66256256>256>25664>128>128>6464>32>128>163232 81>512512>256>256>128>128>1283264>32>128163232 90512128128>25664>128>128>6432>32>128>163232 95>512512128643264641632>32>128>163232 100512512>25625632321283232>32>128>16>3232 109512512>256>256128641283232>32>128>16>3232PAE耐药中起着极其重要的作用,根据PAE全基因组序列分析,推测铜绿假单胞菌至少有12种主动外排系统,至今已通过基因检测发现了7种[3 5],均属于RND型外排泵。
