拳参正丁醇提取物对异丙肾上腺素致大鼠心肌肥厚的保护作用

拳参正丁醇提取物保护大鼠心肌缺血再灌注损伤的剂量依赖性效应叶和杨;黄志华;汪秀荣;周莉;胡志萍;何蔚;曾靖【期刊名称】《中国组织工程研究》【年(卷),期】2005(009)039【摘要】目的:观察具有清热、镇惊、理湿、消肿、镇痛等功效的中药拳参正丁醇提取物对大鼠心肌缺血再灌注损伤的保护作用.方法:实验于2004-09/2005-12在赣南医学院科研中心实验室完成.①取32只雄性Wistar大鼠,随机分为4组,每组8只,分别为假手术组、缺血再灌注组、拳参正丁醇提取物实验样品由沈阳药科大学植化教研室邱峰博士提供.高剂量组(120 mg/kg)、拳参正丁醇提取物低剂量组(60 mg/kg).结扎冠状动脉左前降支使心肌缺血,40 min后恢复血流并持续120 min,复制缺血再灌注损伤模型.治疗组于结扎冠状动脉左前降支前20 min经十二指肠注入拳参正丁醇提取物.缺血再灌注组及假手术组经十二指肠注入等体积生理盐水.按南京建成生物工程研究所提供试剂盒说明测定血清乳酸脱氢酶、磷酸肌酸激酶值.测定心肌组织丙二醛和超氧化物歧化酶值.用硫代巴比妥法测定丙二醛含量,用羟胺法测定超氧化物歧化酶值.②另取24只Wistar大鼠,分别为缺血再灌注组、拳参正丁醇提取物高剂量组(120mg/kg)、拳参正丁醇提取物低剂量组(60 mg/kg).同上述动物模型制作方法进行实验.以梗死区心肌湿质量占全心肌湿质量的百分比表示心肌梗死的范围.③用t检验进行组间计量资料差异比较.结果:大鼠56只均进入结果分析.①心肌组织超氧化物歧化酶含量:缺血再灌注组和拳参正丁醇提取物高低剂量组均明显低于假手术组(t=5.27～12.15,P＜0.01);拳参正丁醇提取物高剂量组明显高于缺血再灌注组(t=2.30,P＜0.05).②心肌组织丙二醛含量:缺血再灌注组和拳参正丁醇提取物高低剂量组均明显高于假手术组(t=9.00～10.25,P＜0.01);拳参正丁醇提取物高剂量组明显低于缺血再灌注组(t=1.97,P＜0.05).③血清乳酸脱氢酶和磷酸肌酸激酶活性:缺血再灌注组和拳参正丁醇提取物高低剂量组均明显高于假手术组(t=2.93～18.36,P＜0.01),拳参正丁醇提取物高低剂量组明显低于缺血再灌注组(t=1.99～6.99,P＜0.05～0.01).④心肌梗死范围:拳参正丁醇提取物高、低剂量组大鼠均明显小于缺血再灌注组[(34.24±1.51)%,(34.93±1.88)%,(38.66±3.89)%,t=2.99,2.43,P＜0.01,0.05],尤以高剂量组明显.结论:拳参正丁醇提取物通过提高心肌组织的超氧化物歧化酶和降低丙二醛,降低血清乳酸脱氢酶和磷酸肌酸激酶,清除自由基,防止脂质过氧化而产生保护心肌的作用,该作用随着拳参正丁醇提取物剂量增大而增强.【总页数】3页(P118-120)【作者】叶和杨;黄志华;汪秀荣;周莉;胡志萍;何蔚;曾靖【作者单位】赣南医学院药理教研室,江西省,赣州市,341000;赣南医学院生理实验室,江西省,赣州市,341000;赣南医学院机能实验室,江西省,赣州市,341000;赣南医学院机能实验室,江西省,赣州市,341000;赣南医学院生理实验室,江西省,赣州市,341000;赣南医学院药理教研室,江西省,赣州市,341000;赣南医学院药理教研室,江西省,赣州市,341000【正文语种】中文【中图分类】R542.2【相关文献】1.蕨麻正丁醇提取物对心肌缺血/再灌注损伤大鼠肿瘤坏死因子-α水平的影响 [J], 王震;李建军;董化江;单云官;王永阔;李伯森2.拳参正丁醇提取物对视网膜缺血再灌注损伤的保护作用 [J], 李良东;黎晓;黄志华;熊丽娇;吴亮亮;曾靖3.蕨麻正丁醇提取物对心肌缺血再灌注损伤大鼠白细胞介素-8的影响 [J], 王震;董化江;何文彤;单云官;王永阔;李伯森4.拳参正丁醇提取物对大鼠脑缺血再灌注损伤的保护作用 [J], 李良东;黄志华;余星梅;黎晓;曾靖5.拳参正丁醇提取物对异丙肾上腺素致大鼠心肌肥厚的保护作用 [J], 张乡城;薛金雄;杨晓光;叶春荣;汪有彪;潘吴媛;黄志华;曾靖因版权原因，仅展示原文概要，查看原文内容请购买。

作者：李良东，黄志华，余星梅，黎晓，曾靖【摘要】目的研究拳参正丁醇提取物对脑缺血再灌注损伤的保护作用，并初步探讨其保护机制。

方法大鼠大脑中动脉栓塞，制作脑缺血再灌注损伤模型，缺血后10 min，于舌下静脉给予不同剂量的拳参正丁醇提取物。

再灌注24 h后，断头取脑，ttc染色，测定脑梗塞体积;取血，离心后，取血清，比色法测血清nos、sod的活性及no、mda的含量。

结果与模型组相比，拳参正丁醇提取物治疗组脑梗塞体积减小，血清nos和sod的活性升高，no含量升高，mda含量降低。

结论拳参正丁醇提取物对脑缺血再灌注损伤具有一定的保护作用，其保护机制与拳参正丁醇提取物促进no释放及增强氧自由基的清除有关。

【关键词】拳参正丁醇提取物; 脑缺血再灌注损伤拳参别名草河车，系蓼科植物的干燥根茎。

具有清热、镇惊、利湿、消肿、镇痛等功效。

拳参正丁醇提取物(polygonum bistorla l. n-butyl alcohol extract,pbna)主要由4种成分组成[1]，包括丁香苷、儿茶素、芦丁、mururin a。

本课题组前期研究表明，拳参提取物具有抗心律失常[2]、镇痛 [3，4]、中枢抑制[5]、对心肌缺血[6]及心肌缺血再灌注损伤的保护[7]、扩张血管[8]等作用。

拳参正丁醇提取物是否对脑缺血再灌注损伤起保护作用?本实验应用大鼠大脑中动脉栓塞所致的脑缺血再灌注损伤模型研究拳参正丁醇提取物对脑缺血再灌注损伤的保护作用，并探讨其保护作用与no和抗氧化作用的关系。

1 材料1.1 试剂及药物拳参正丁醇提取物由沈阳药科大学中医药学院植化教研室提供，实验前用双蒸水稀释至所需浓度。

nos、sod、no、和mda试剂盒购自南京建成生物有限公司。

2 方法2.1 实验分组与大鼠脑缺血再灌注损伤模型的制备雄性sd大鼠32只，250～280 g，随机分成4组，即假手术组、脑缺血再灌注损伤模型组、拳参正丁醇提取物高剂量(0.3 mg·kg-1)治疗组、拳参正丁醇提取物低剂量(0.1 mg·kg-1)治疗组。

拳参正丁醇提取物对豚鼠心肌生理特性的影响作者：黄志华, 钟富有李良东朱丹叶和杨曾靖【摘要】目的研究拳参正丁醇提取物对豚鼠离体右心房自律性及收缩特性的影响，并探讨其作用机制。

方法采用豚鼠离体右心房测定拳参正丁醇提取物对其自律性、收缩幅度、收缩速度、舒张速度的影响。

结果拳参正丁醇提取物可降低豚鼠离体右心房的自律性，降低豚鼠离体右心房的收缩幅度、收缩速度、舒张速度，且具有明显的剂量依赖性。

结论拳参正丁醇提取物可抑制豚鼠离体右心房的自律性，降低豚鼠离体右心房的收缩幅度、收缩速度、舒张速度，且具有明显的剂量依赖性。

其机制可能与抑制钙离子的内流及改变肌浆网上的钙泵活性有关。

【关键词】拳参正丁醇提取物右心房自律性收缩特性Abstract:ObjectiveTo investigate the effect of Polygonum Bistorla L.n-Butyl alcohol extract on autorhythmicity and contraction of isolated right atrium of guinea pig and its mechanism. MethodsAfter treated with Polygonum bistorla L. n-Butyl Alcohol Extract, the isolated right atria were investigated that including autorhythmicity, contraction scale, contraction velocity and relaxationspeed.ResultsThe autorhythmicity of the isolated right atria were inhibited after treated with the extract. Moreover, their contraction scale, contraction velocity and relaxation speed were significantly reduced in a dose-dependent manner. ConclusionPolygonum bistorla L.n-Butyl Alcohol Extract can inhibit autorhythmicity of the isolated right atrium, and significantly reduce their contraction scale, contraction velocity and relaxation speed in a dose-dependent manner. Its mechanism may be related to inhibition of calcium influx and mediation activity of calcium pump in sarcoplasmic reticulum.Key words:Polygonum Bistorla L. n-Butyl Alcohol Extract; Right atrium; Autorhythmicity; Contraction拳参Polygonum bistora L.别名草河车，系蓼科植物的干燥根茎。

2186　环球中医药2023年11月第16卷第11期　Global Traditional Chinese Medicine,October 2023,Vol.16,No.11㊃基础研究㊃基金项目:国家自然科学基金(81703836);北京中医药大学优秀青年基金(BUCM⁃2019⁃JCRC005)作者单位:102400　北京中医药大学生命科学学院[洪艺勤(硕士研究生)㊁唐炳华㊁王慧(硕士研究生)㊁解涵滟(硕士研究生)㊁郭冬青],中医学院[陈旭(博士研究生)㊁于藜爽(硕士研究生)]作者简介:洪艺勤(1996-),2020级在读硕士研究生㊂研究方向:中医药防治心血管疾病㊂E⁃mail:h724798722@ 通信作者:郭冬青(1987-),博士,副教授㊂研究方向:中医药防治心血管疾病㊂E⁃mail:dong_qing_guo@丹参提取物对大鼠心肌缺血后血管新生的保护作用研究洪艺勤　唐炳华　陈旭　于藜爽　王慧　解涵滟　郭冬青【摘要】　目的　血管新生是治疗缺血性心脏病(ischemic heart disease,IHD)非常有效的一种方法㊂本研究的主要目的是探究丹参提取物对大鼠心肌缺血后血管新生的保护作用及其机制㊂方法　48只雄性SD 大鼠,随机分为假手术组㊁模型组㊁丹参提取物组和阳性药组,每组12只㊂手术结扎左冠状动脉前降支(left anterior descending,LAD)建立心肌缺血模型,造模成功后丹参提取物组以浓度为0.2928g /kg 的丹参提取物药液灌胃,阳性药组以浓度为1mg /kg 瑞舒伐他汀药液灌胃,模型组㊁假手术组给予生理盐水灌胃㊂干预28天后通过超声评估心功能,通过激光多普勒评估心脏血流的变化㊂体外实验采用氧 葡萄糖剥夺法(oxygen⁃glucose deprivation,OGD)损伤人脐静脉内皮细胞(human umbilical vein endothelial cells,HUVECs),通过CCK⁃8实验和Matrigel 成管实验评估丹参提取物对HUVECs 的保护作用,通过Western blots 检测通路蛋白的表达变化㊂结果　丹参提取物不仅可以改善心肌缺血大鼠的心功能(P <0.01),增加心脏血流量(P <0.01),改善心肌细胞形态和炎症,还可以增加内皮细胞的活力(P <0.05),促进细胞体外成管㊂机制上丹参提取物能够促进OGD 诱导的内皮细胞分泌骨形态发生蛋白2(bone morphogenetic protein⁃2,BMP2)(P <0.01),下调Delta⁃Like 配体蛋白⁃4(Delta⁃like 4,Dll4)和Notch1蛋白的表达(P <0.01,P <0.01)㊂结论　丹参提取物可能通过调节BMP2⁃Dll4/Notch1通路促进血管新生进而保护心功能㊂【关键词】　丹参提取物;　血管新生;　心肌缺血;　骨形态发生蛋白2⁃Delta⁃Like 配体蛋白⁃4/Notch1通路【中图分类号】　R285.5　【文献标识码】　A　doi:10.3969/j.issn.1674⁃1749.2023.11.005Protective effects of Salvia miltiorrhiza extract on angiogenesis after myocardial ischemia in rats HONG Yiqin ,TANG Binghua ,CHEN Xu ,YU Lishuang ,WANG Hui ,XIE Hanyan ,GUO Dongqing School of Life Sciences ,Beijing University of Chinese Medicine ,Beijing 102400,China Corresponding author :GUO Dongqing ,E⁃mail :dong_qing_guo@【Abstract 】　Objective Angiogenesis is an effective way to treat ischemic heart disease (IHD).The objective of this study was to investigate the protective effect and its mechanism of Salvia miltiorrhizaextract on angiogenesis after myocardial ischemia in rats.Methods Forty⁃eight male SD rats wererandomly divided into sham group,model group,salvia miltiorrhiza extract group and positive drug group,with 12rats in each group.The myocardial ischemia model was established by surgical ligation of the left anterior descending artery (LAD).After the model was successfully made,the salvia miltiorrhiza extractgroup was treated with a concentration of 0.2928g /kg Salvia miltiorrhiza extract and the positive treatment group was treated with a concentration of 1mg /kg rosuvastatin.Rats in the model group and sham group环球中医药2023年11月第16卷第11期　Global Traditional Chinese Medicine,October2023,Vol.16,No.112187　were given normal saline intragastric administration.After28days of intervention,the cardiac function was evaluated by ultrasound,and the changes of cardiac blood flow were evaluated by laser doppler.In vitro ex⁃periments,oxygen⁃glucose deprivation(OGD)was used to damage human umbilical vein endothelial cells (HUVECs).The protective effects of Salvia miltiorrhiza extracts on HUVECs were evaluated by CCK⁃8assay and matrigel tube formation assay,and the changes of pathway protein expressions were detected byWestern blots.Results　Salvia miltiorrhiza extract could not only improve cardiac function(P<0.01),increase cardiac blood flow in rats(P<0.01)and improve cardiomyocyte morphology and inflammation with myocardial ischemia,but also increase the vitality of endothelial cells(P<0.05)and promote cell tubeformation in vitro.Salvia miltiorrhiza extract could promote the secretion of BMP2protein by OGD⁃induced endothelial cells(P<0.01)and down⁃regulate the expressions of Dll4and Notch1protein(P<0.01,P<0.01).Conclusion　Salvia miltiorrhiza extract could promote angiogenesis and protect cardiac functionby regulating BMP2⁃Dll4/Notch1pathway.【Key words】　Salvia miltiorrhiza extract;　angiogenesis;　myocardial ischemia;　BMP2⁃Dll4/Notch 缺血性心脏病是指当血液减少或者停止流向心脏的某个部位时,心肌就会因为缺氧而受伤,如果病情严重,则会导致急性心肌梗死[1]㊂本病的直接治疗包括服用阿司匹林㊁硝酸甘油和吸氧[2],另外还有恢复心脏血液循环的再灌注疗法,以及血管成形术㊂血管成形术效果显著,但也具有较高的风险[3]㊂缺血性心脏病最根本的原因是心肌缺血,因此最根本的治疗就是增加缺血心肌的血流量㊂血管新生这种不伤害机体又增加血管从而增加血流量的方法,近些年来受到越来越多的关注和研究㊂血管新生是指从已有的血管中生成新的毛细血管,是一个复杂的过程,在生长发育㊁组织和器官再生以及许多病理状况中都起着重要作用[4⁃5]㊂骨形态发生蛋白(bone morphogenetic proteins, BMPs)属于转化生长因子⁃β(transforming growth factor⁃β,TGF⁃β)家族成员,在血管内稳态和血管新生中发挥重要作用[6]㊂其中骨形态发生蛋白2 (bone morphogenetic protein⁃2,BMP2)已经证实能够在血管生物学中起作用[7],而且可以激活内皮细胞并促进血管新生[8]㊂Notch信号是一种高度保守的细胞间信号通路系统[9],Delta⁃Like配体蛋白⁃4 (Delta⁃like4,Dll4)是唯一由血管内皮细胞表达的Notch配体[10⁃12],可以通过抑制内皮 尖端”细胞的进一步形成和 柄”细胞的增殖作为血管内皮生长因子(vascular endothelial growth factor,VEGF)作用的负调节因子[13]㊂Dll4/Notch1的结合激活会导致Notch受体的蛋白裂解,Notch胞内结构域从细胞膜释放到细胞核,并与CSL转录因子和共激活因子结合,诱导下游靶基因转录[9],从而调节血管新生㊂丹参具有活血祛瘀㊁通经止痛的功效,可用于治疗胸痹心痛㊁痛经经闭等[14]㊂丹参作用平和,能够活血祛瘀而不伤正气,如复方丹参片可用于治疗心绞痛引起的胸痛[15]㊂面对心肌缺血再灌注大鼠,丹参饮可以改善心功能㊁减少心肌凋亡,对心脏发挥保护作用[16]㊂因此本研究基于BMP2⁃Dll4/ Notch1通路探究丹参提取物对心肌缺血后血管新生的作用及机制㊂1　材料与方法1.1　实验动物及实验细胞SPF级雄性SD大鼠48只,体质量(220±20)g,购于北京斯贝福生物技术有限公司,于北京中医药大学动物房中普通饲料饲养,温度:(22±2)℃,湿度:45%±5%,每日12小时光照与黑暗循环,正常饮水㊂人脐静脉内皮细胞(human umbilical vein endothelial cells,HUVECs)来自北京安贞医院㊂1.2　实验药物丹参提取物来自上海源叶生物科技有限公司,批号:S27206⁃25g,是通过水萃取和酒精沉淀对丹参进行制备而得㊂为确保药物质量,课题组通过HPLC⁃PDA建立了指纹图谱,鉴定出了丹参的17个特征峰[17]㊂瑞舒伐他汀来自阿斯利康药业(中国)有限公司,10mg/片,批号:502705㊂1.3　主要试剂与仪器ALC⁃V8S小动物呼吸机,Visual Sonics小动物超声影像系统,moorFLPI⁃2血流成像仪㊂CCK⁃8检测试剂(同仁,日本),BMP2抗体(1∶1000,2188　环球中医药2023年11月第16卷第11期　Global Traditional Chinese Medicine,October2023,Vol.16,No.11Immunoway),Dll4抗体(1∶1000,Bioss),Notch1抗体(1∶1000,Proteintech),GAPDH抗体(1∶1000, Proteintech),山羊抗兔单克隆二抗(1∶2000, Proteintech),ECL超敏发光液(上海雅酶生物医药科技有限公司),BMP2ELISA试剂盒(泉州市睿信生物科技有限公司)㊂Molecular Devices SpectraMax i3x全波长酶标仪,BIO⁃RAD制胶㊁电泳及电转设备与凝胶成像仪及图像分析系统㊂1.4　动物分组㊁造模及给药将48只大鼠适应性饲养1周,腹腔注射1%戊巴比妥钠(50mg/kg)麻醉,用气管套管进行插管,确认通气后连接小动物呼吸仪,设置仪器参数为80次/分钟,潮气量3.0,呼吸比1∶2,于左胸前第3㊁4肋间开胸,伤口约1cm左右,在距离左心耳1~1.5 mm处进行结扎,其中随机选取8只大鼠仅开胸穿线,不结扎,作为后续假手术组㊂结扎完毕后,于心脏表面点滴1~2滴呋塞米,随后逐层关胸,于腹腔注射利多卡因注射液0.1mL,置于预热的电热毯上,待其恢复自主呼吸后自行脱离气管插管,待苏醒后放回笼中㊂术后将存活的40只大鼠随机分为假手术组㊁模型组㊁丹参提取物组(0.2928g/kg)和阳性药组(瑞舒伐他汀1mg/kg)㊂假手术组和模型组给予空白溶剂(生理盐水),丹参提取物和瑞舒伐他汀的给药剂量根据临床治疗剂量等效换算㊂术后24小时后灌胃给药,每天1次,灌胃体积为1mL/100g,持续4周㊂在实验过程中所有死亡的大鼠均被剔除出组,保证最后每组动物存活数不少于6只㊂1.5　细胞培养㊁分组与造模培养条件:37℃,5%CO2,湿度70%~80%;完全培养基:90%1640+10%胎牛血清+1%青霉素/链霉素㊂根据丹参提取物的药物作用浓度,将HUVECs分为:空白对照组㊁模型组㊁400μg/mL丹参提取物组㊁600μg/mL丹参提取物组和800μg/ mL丹参提取物组㊂空白对照组HUVECs在常规培养条件下培养,再更换完全培养基培养8小时㊂模型组常规培养后,更换Earle平衡盐溶液氧-葡萄糖剥夺法(oxygen⁃glucose deprivation,OGD)刺激8小时㊂400μg/mL丹参提取物组常规培养后,更换Earle平衡盐溶液配制的400μg/mL丹参提取物OGD刺激8小时㊂600μg/mL丹参提取物组常规培养后,更换Earle平衡盐溶液配制的600μg/mL丹参提取物OGD刺激8小时㊂800μg/mL丹参提取物组常规培养后,更换Earle平衡盐溶液配制的800μg/mL丹参提取物OGD刺激8小时㊂1.6　检测指标1.6.1　超声检测　大鼠末次给药24小时后,经腹腔注射1%戊巴比妥钠麻醉,将左胸备皮㊂使用小动物超声检测各组大鼠的左室舒张末期内径(left ventricular end⁃diastole diameter,LVID;d)㊁左室收缩末期内径(left ventricular end⁃systole diameter, LVID;s)㊁左心室舒张末期容积(left ventricular end⁃diastolic volume,LVIDV)和左室收缩末期容积(left ventricular end⁃systole volume,LVISV)等指标㊂根据公式计算短轴缩短率(fractional shortening,FS)和射血分数(ejection fraction,EF)㊂FS(%)=(LVID;d⁃LVID;s)/LVID;d×100% EF(%)=(LVIDV⁃LVISV)/LVIDV×100% 1.6.2　心脏微血流扫描　药物干预28天,禁食12小时后,将大鼠麻醉,备皮,气管插管,插上呼吸机㊂打开左胸,露出心脏,用纱布擦去心脏表面多余的血液,将moorFLPI⁃2血流成像仪的扫描探头平行于心脏表面5cm处放置并固定,探头内的光束照射到组织0.5mm的深度测量心脏的血流㊂从蓝色到红色的图像表示低到高的血流量㊂1.6.3　心肌组织苏木精 伊红(hematoxylin⁃eosin, HE)染色　将石蜡切片依次放入二甲苯㊁无水乙醇㊁酒精及蒸馏水中脱蜡,随后使用苏木素染细胞核㊁伊红染液染细胞质,最后脱水封片,图像采集并分析㊂1.6.4　CCK⁃8检测细胞增殖活性　CCK⁃8工作液配制比为CCK⁃8∶1640培养基=1∶9,96孔板每孔加入100μL工作液,37℃培养箱中孵育2小时,酶标仪波长450nm检测OD值㊂将HUVECs接种到96孔板中,每孔接种6×103个,贴壁培养到所需密度时,弃去原培养基,加入完全培养基配制的不同浓度(10㊁50㊁100㊁200㊁400㊁600㊁800㊁1000㊁2000μg/mL)丹参提取物刺激24小时,使用CCK⁃8试剂确认丹参提取物的无毒范围㊂将HUVECs接种到96孔板中,每孔接种6×103个,贴壁培养到所需密度时,弃去原培养基,加入Earle平衡盐溶液配制的不同浓度(10㊁50㊁100㊁200㊁400㊁600㊁800㊁1000㊁2000μg/mL)丹参提取物OGD环球中医药2023年11月第16卷第11期　Global Traditional Chinese Medicine,October2023,Vol.16,No.112189刺激8小时,使用CCK⁃8试剂确认丹参提取物的起效浓度㊂1.6.5　细胞成管实验　在置于冰上的96孔板上每孔加入35μL Matrigel,37℃培养箱中孵育30分钟,使其均匀凝固于孔底㊂将经过不同处理的各组HUVECs以1×106个/mL的密度接种到Matrigel上㊂于37℃培养箱中孵育5小时后,弃上清,PBS冲洗细胞3次㊂加入Calcein⁃AM染料(5μg/mL)并避光染色5分钟㊂使用倒置显微镜拍照㊂使用Image⁃Pro Plus6.0软件计算图中管的总长度和分支点总数,进而比较各组细胞的成管能力㊂1.6.6　蛋白免疫印迹法(Western blots)检测HUVECs中BMP2㊁Dll4㊁Notch1表达情况　将HUVECs培养皿置于冰上,将先前配制好的RIPA裂解液加入培养皿中,使用细胞刮刀将细胞刮至皿一侧,取细胞于EP管中,充分裂解20分钟,离心机12000r/min,离心10分钟,取上清;采用BCA蛋白定量法进行定量,加入loading buffer调整蛋白浓度, 98℃金属浴10分钟,使蛋白充分变性,自然冷却后使用;向配制好的浓缩胶上样孔中分别加入5μL Marker和10μL蛋白样品,80V电泳90分钟, 300mA电转90分钟,5%牛奶封闭液封闭2小时,将膜放入BMP2一抗㊁Dll4一抗㊁Notch1一抗㊁GAPDH一抗中4℃孵育过夜,二抗常温孵育1小时,将膜置于凝胶成像仪中,将ECL发光液均匀地滴在膜上,设置合适的曝光时间,得到图像并保存,使用Image Lab对条带灰度进行计算分析㊂1.6.7　酶联免疫吸附法(ELISA)检测HUVECs上清液中BMP2表达情况　收集不同处理后的各组HUVECs培养基,根据制造商的说明,4000r/min离心20分钟,提取上清液㊂于96孔板设置标准品孔㊁空白孔和样本孔,标准品孔加入不同浓度的标准品各50μL,空白孔不加,样本孔分别加待测样本50μL,然后标准品孔和样本孔都各加入检测抗体100μL,37℃恒温箱避光孵育60分钟㊂弃去液体,加入洗涤液静置20秒,重复5次㊂将底物A和B 按1∶1体积充分混合,每个孔加入混合液100μL,37℃恒温箱避光孵育15分钟,随后每个孔加入终止液50μL,在酶标仪上读取各孔吸光度㊂通过标准品孔的OD值得到标准曲线y=aln(x)+b,再将样本孔的OD值代入标准曲线中,从而得到每个样本的浓度值㊂1.7　统计学处理实验所得数据为计量资料,采用SPSS25.0统计软件进行数据处理分析㊂经检验数据符合正态分布且方差齐,以均数±标准差(x±s)表示㊂多组间比较采用单因素方差分析,两两比较采用LSD检测㊂P<0.05表示差异具有统计学意义㊂2　结果2.1　丹参提取物对心肌缺血大鼠心功能的影响左冠状动脉前降支结扎28天后进行超声检测,模型组大鼠的EF值和FS值显著下降(P<0.01),提示模型组大鼠的心功能严重受损,LVID;d值增加(P<0.01),提示左心室扩张㊂药物干预28天后,与模型组相比,丹参提取物组的大鼠EF值和FS值显著升高(P<0.01),LVID;d值和LVID;s值显著降低(P<0.01),阳性药组EF值和FS值亦升高(P<0.05),LVID;d值和LVID;s值亦降低(P<0.05),表明丹参提取物可以恢复心肌缺血大鼠的射血功能,改善心功能㊂见表1㊂2.2　丹参提取物对心肌缺血大鼠心脏血流量的影响使用激光多普勒直观评估丹参提取物对心脏血流的影响,结果显示模型组心肌红色信号明显弱于假手术组(P<0.01),提示心肌血流量减少,血供不足㊂丹参提取物组血流信号明显强于模型组,说明心肌血流量明显增加(P<0.01),证明丹参提取物确实有促进心肌缺血大鼠血管新生的作用,而阳性药组促心脏血流的效果不明显㊂见图1,表2㊂表1　各组心肌缺血模型大鼠心脏超声检测结果(x±s)组别鼠只EF(%)FS(%)LVID;d(mm)LVID;s(mm)假手术组684.89±1.22c40.83±1.39c 6.23±0.26c 3.67±0.12c 模型组636.54±1.67a18.79±0.98a9.58±0.39a7.99±0.31a 丹参提取物组654.10±2.08c29.07±1.41c7.25±0.36c 5.10±0.35c 阳性药组640.51±1.3323.28±1.018.22±0.29b 6.71±0.31b 注:与假手术组相比,a P<0.01;与模型组相比,b P<0.05,c P<0.01㊂2190　环球中医药2023年11月第16卷第11期　Global Traditional Chinese Medicine,October2023,Vol.16,No.11图1　各组心肌缺血模型大鼠心脏血流量比较表2　各组心肌缺血模型大鼠心脏血流量比较(x±s,PU)组别鼠只血流量(Flux)假手术组62719±248.2模型组61897±373.3a丹参提取物组62298±167.5b阳性药组62135±256.6注:与假手术组相比,a P<0.01;与模型组相比,b P<0.01㊂2.3　丹参提取物对心肌缺血大鼠心肌细胞染色的影响HE染色结果显示,假手术组大鼠心肌细胞无结构性改变且无炎细胞浸润,模型组心肌形态变化严重,结构异常并出现炎性细胞浸润㊂丹参提取物干预后,心肌细胞排列较为整齐,炎性细胞浸润减少,证明丹参提取物具有明显改善心肌细胞形态和炎症的作用㊂见图2㊂2.4　丹参提取物对HUVECs无毒范围的确定为了筛选丹参提取物对HUVECs的毒性范围,将丹参提取物作用于HUVECs细胞24小时㊂CCK⁃8结果显示,丹参提取物在浓度为10~800μg/mL 时对HUVECs细胞活力几乎没有影响,证明此浓度范围内丹参提取物对细胞无毒副作用,而1000 ~2000μg/mL丹参提取物明显降低了细胞活力(P<0.05,P<0.01)㊂见表3㊂2.5　丹参提取物对OGD损伤的HUVECs细胞活力的影响将内皮细胞进行OGD处理的同时,给予不同浓图2　各组心肌缺血模型大鼠心肌组织HE染色结果(×400)表3　不同浓度丹参提取物对HUVECs细胞活力的影响(x±s)组别浓度孔数细胞活力空白组060.98±0.08丹参提取物组10μg/mL6 1.01±0.0550μg/mL60.99±0.06100μg/mL6 1.02±0.05200μg/mL60.98±0.05400μg/mL6 1.02±0.02600μg/mL60.99±0.04800μg/mL6 1.01±0.071000μg/mL60.89±0.04a2000μg/mL60.87±0.02b 注:与空白组相比,a P<0.05,b P<0.01㊂环球中医药2023年11月第16卷第11期　Global Traditional Chinese Medicine,October 2023,Vol.16,No.112191　度的丹参提取物刺激,8小时后使用CCK⁃8实验检测细胞活力㊂结果显示,模型组与空白组相比,细胞活力明显下降(P <0.01);而与模型组相比,100~2000μg /mL 的丹参提取物能提高细胞活力,整体呈现先升高后降低的趋势(P <0.05)㊂见表4㊂表4　不同浓度丹参提取物对OGD 损伤HUVECs细胞活力的影响(x ±s )组别浓度孔数细胞活力空白组060.98±0.02模型组060.47±0.04a 丹参提取物组10μg /mL 60.54±0.0250μg /mL60.57±0.05100μg /mL 60.65±0.06b 200μg /mL60.65±0.05c 400μg /mL 60.68±0.04c 600μg /mL 60.83±0.06c 800μg /mL 60.97±0.03c 1000μg /mL 60.79±0.06c 2000μg /mL 60.79±0.05c注:与空白组相比,a P <0.01;与模型组相比,b P <0.05,c P <0.01㊂2.6　丹参提取物对HUVECs 体外成管的影响采用Matrigel 成管实验来观察HUVECs 的成管能力㊂与空白组相比,模型组几乎没有分支点和成管能力;与模型组相比,400μg /mL㊁600μg /mL 和800μg /mL 丹参提取物能增加管的总长度及分支点的数目,其中600μg /mL 成管效果最佳,提示丹参提取物对OGD 损伤的HUVECs 的成管能力有促进作用㊂见图3㊂2.7　丹参提取物对BMP2⁃Dll4/Notch1通路的影响与模型组比较,各组HUVECs 细胞中BMP2的表达变化没有统计学意义;各组HUVECs 细胞上清液中,模型组分泌的BMP2含量显著减少(P <0.01),而400μg /mL㊁600μg /mL 和800μg /mL 丹参提取物能增加BMP2的分泌,600μg /mL 时增加最明显(P <0.01)㊂见表5~6㊂通过Western blots 检测BMP2下游蛋白Dll4和Notch1的表达变化,发现OGD 刺激能够激活Dll4/Notch1,使Dll4㊁Notch1表达增加(P <0.01)㊂而丹参提取物能够显著降低Dll4㊁Notch1的表达(P <0.01),抑制Dll4/Notch1通路㊂见表7㊂表5　各组HUVECs 细胞中BMP2的蛋白表达水平比较(x ±s )组别组数BMP2空白组30.30±0.04模型组30.25±0.03400μg /mL 丹参提取物组30.31±0.07600μg /mL 丹参提取物组30.35±0.06800μg /mL 丹参提取物组30.29±0.03表6　各组HUVECs 上清液中分泌的BMP2含量比较(x ±s ,pg /mL)组别组数BMP2空白组318.48±1.12模型组38.40±0.67a 400μg /mL 丹参提取物组310.74±1.13600μg /mL 丹参提取物组316.59±0.49b800μg /mL 丹参提取物组39.49±1.15注:与空白组相比,a P <0.01;与模型组相比,b P <0.01㊂图3　不同浓度丹参提取物对OGD 损伤HUVECs 细胞成管的影响2192　环球中医药2023年11月第16卷第11期　Global Traditional Chinese Medicine,October2023,Vol.16,No.11表7　各组HUVECs中Dll4㊁Notch1的蛋白表达水平比较(x±s)组别组数Dll4Notch1空白组30.46±0.010.23±0.08模型组30.91±0.02a0.90±0.18a 400μg/mL丹参提取物组30.82±0.070.64±0.11 600μg/mL丹参提取物组30.52±0.07b0.27±0.08b 800μg/mL丹参提取物组30.57±0.14b0.34±0.13b 注:与空白组相比,a P<0.01;与模型组相比,b P<0.01㊂3摇讨论缺血性心脏病由流向心脏的部分血流减少或停止引起,目前的治疗方法不仅包括通过介入手术促进缺血动脉的快速再灌注,还包括使用适当的辅助抗血小板药物保持血管畅通,使用他汀类药物以降低低密度脂蛋白胆固醇和其他药物以改善血管壁和心肌的愈合,从而减少其他缺血后并发症的发生率,包括心律失常和心力衰竭[18]㊂而中医药则可以通过中药配伍从减少炎症㊁减少纤维化㊁促进血管新生等多个方面调节保护心肌,从而恢复心脏血流㊂近年来,血管新生这一促进恢复的治疗方法在众多通过减少损伤来达到治疗目的的方法中脱颖而出,成为一个新的研究热点㊂BMPs最初是因其诱导骨和软骨形成的能力而被发现㊂BMPs信号通路不仅参与骨发育,还参与原肠胚形成㊁胚胎模式形成和器官发生[19]㊁血管生成与血管完整性[7]㊁铁稳态[20]㊁炎症[21]和有性生殖[22]㊂在不同的BMPs中,BMP2㊁BMP4㊁BMP6和BMP7已被证明在血管生物学中起作用[7],其中BMP2已经被报道可以激活内皮细胞并促进血管新生[8],而且心肌梗死后血清中BMP2从第一天就开始下降,与左心室重构过程相吻合[23]㊂研究证实,血管新生需要多种信号级联的协调整合,包括VEGF㊁成纤维细胞生长因子㊁Notch/ Dll4㊁血管生成素㊁TGF⁃β和BMP通路[18]㊂Dll4/ Notch1信号通路是调节血管新生的重要通路,Dll4是血管新生的负调控因子[24],可被BMP2诱导[25], Notch1是一种高度保守的受体,广泛存在于细胞表面,受Dll4的受体配体模式的调控[26]㊂目前临床前实验探究中药促进缺血心肌血管新生,多是通过检测血液或心脏组织中血管生长因子含量以及对内皮特异性标记物CD31的免疫组化染色来间接评估心肌组织的血管新生情况,缺乏整体水平对心脏血流的评估㊂在本研究中,笔者使用moorFLPI⁃2血流成像仪直观评估了各组大鼠的心脏血流量㊂通过超声检测㊁激光多普勒和HE染色证明丹参提取物不仅能够改善心肌缺血大鼠的心功能,还能增加心脏血流量,改善心肌细胞形态和炎症㊂在离体细胞层面,本研究验证了丹参提取物能够增加细胞活力,增加内皮细胞的体外成管,佐证了丹参提取物对血管新生的调节作用㊂实验结果显示,丹参提取物不能明显改变内皮细胞中BMP2蛋白的表达,但是能够增加HUVECs上清中BMP2的分泌量,同时降低细胞中Dll4和Notch1的蛋白表达,提示丹参提取物可能通过BMP2抑制Dll4/ Notch1信号通路,这可能是丹参提取物通过促进血管新生发挥心肌保护作用的机制之一㊂综上,丹参提取物可通过调节BMP2⁃Dll4/ Notch1信号通路,促进心肌缺血后血管新生,进而发挥心功能保护作用㊂参考文献[1]　LU L,LIU M,SUN R,et al.Myocardial infarction:symptomsand treatments[J].Cell Biochem.Biophys.,2015,72(3):865⁃867.[2]　Erhardt L,Herlitz J,Bossaert L,et al.Task force on themanagement of chest pain[J].Eur.Heart J,2002,23(15):1153⁃1176.[3]　O’Connor R E,Brady W,Brooks S C,et al.Part10:acutecoronary syndromes:2010American heart association guidelinesfor cardiopulmonary resuscitation and emergency cardiovascularcare[J].Circulation,2010,122(18Suppl3):S787⁃S817.[4]　Nowak⁃Sliwinska 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拳参正丁醇提取物的化学成分
刘晓秋;李维维;生可心;刘健;陈发奎
【期刊名称】《沈阳药科大学学报》
【年(卷),期】2006(23)1
【摘要】目的分离拳参(Polygonum bistortaL.)根茎正丁醇提取物的化学成分并进行结构鉴定。

方法利用硅胶、聚酰胺和Sephadex LH 20柱色谱进行分离纯化,根据理化性质和光谱数据进行结构鉴定。

结果得到4个化合物,分别鉴定为丁香苷(syringin,Ⅰ)、儿茶素(catechin,Ⅱ)、芦丁(rutin,Ⅲ)、mururin A(Ⅳ)。

结论Ⅰ和Ⅳ为首次从该属植物中分离得到。

【总页数】3页(P15-17)
【关键词】结构鉴定;拳参;根茎;丁香苷;mururin;A
【作者】刘晓秋;李维维;生可心;刘健;陈发奎
【作者单位】沈阳药科大学中药学院
【正文语种】中文
【中图分类】R284
【相关文献】
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3.大鼠心肌肥厚时血管活性物质的变化与拳参正丁醇提取物的关系 [J], 李良东;周琴;黄志华;曾靖;张乡城;汪有彪
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5.拳参正丁醇提取物对视网膜缺血再灌注损伤时一氧化氮及一氧化氮合酶的影响[J], 黄志华;李良东;黎晓;张生枝;熊丽娇;曾靖
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拳参正丁醇提取物对Iso诱导的小鼠心肌细胞肥厚的影响及机制研究赵雅欣;黄志华;罗利文;罗晶;陈英瑶;朱焱;匡文俐;方翔沛;赖文耀;曾靖【摘要】目的:探讨拳参正丁醇提取物对小鼠心肌肥厚的影响及抗心肌肥厚的机制.方法:采用异丙肾上腺素(I so)诱导的小鼠心肌肥厚模型(1 mg·kg-,sc,Bid,连续10 d),40只小鼠随机分为5组:正常组、模型组、拳参正丁醇提取物(Polygonum bistorla L.n-Butyl Alcohol Extract,PBNA)组(0.1 mg·kg-1,0.3 mg·kg-1)和卡托普利组(20 mg·kg-1).14 d相应药物干预后,测定左心室重量指数(left ventricle mass index,LVMI)、全心重量指数(heart mass index,HMI),Western blot检测Ⅰ和Ⅲ型胶原蛋白的表达及磷酸肌醇3-激酶(PI3K)磷酸化水平.实时荧光定量-PCR 检测ANF和β-MHC的mRNA表达.结果:与正常组比较,模型组LVMI和HMI升高,Ⅰ和Ⅲ型胶原蛋白表达升高,p-PI3K水平升高,ANF、3-MHC、C ollagen Ⅰ和Collagen Ⅲ的mRNA的表达均明显升高;与模型组比较,PBNA组(0.1 mg· kg-1,0.3 mg· kg-1)的LVMI和HMI降低,心肌组织Ⅰ和Ⅲ型胶原蛋白表达、p-PI3K 水平、ANF和β-MHC的mRNA的表达均降低,Collagen Ⅰ和Collagen Ⅲ的mRNA有降低趋势,但无统计学差异.结论:PBNA可以有效改善Iso诱导的心肌肥厚,其抗心肌肥厚作用与降低促心肌肥厚因子ANF和β-MHC,降低胶原生成,及抑制PI3K信号有关.【期刊名称】《赣南医学院学报》【年(卷),期】2018(038)002【总页数】4页(P108-111)【关键词】拳参正丁醇提取物;心肌肥厚;PI3K【作者】赵雅欣;黄志华;罗利文;罗晶;陈英瑶;朱焱;匡文俐;方翔沛;赖文耀;曾靖【作者单位】赣南医学院,江西赣州341000;赣南医学院基础医学院,江西赣州341000;赣南医学院,江西赣州341000;赣南医学院,江西赣州341000;赣南医学院,江西赣州341000;赣南医学院,江西赣州341000;赣南医学院,江西赣州341000;赣南医学院,江西赣州341000;赣南医学院,江西赣州341000;赣南医学院药学院,江西赣州341000【正文语种】中文【中图分类】R285心肌肥厚是心脏对过度负荷所产生的一种适应性反应。