课用 DNA的粗提取 PCR

DNA提取流程及PCR体系一、DNA提取流程：1.样本准备：选取合适的样本，如血液、组织、细胞等，并进行预处理，如洗涤、破碎等操作。

2.细胞破碎：将样本中的细胞壁和细胞膜破碎，以释放细胞内的DNA。

可以采用机械方法（如刮刀、搅拌器）或化学方法（如洗涤溶液、裂解酶）进行破碎。

3.蛋白质沉淀：通过加入蛋白酶K等蛋白质降解酶，将样本中的蛋白质降解沉淀，以便后续步骤中分离DNA。

4.DNA沉淀：通过加入冷醇（如乙醇）或盐溶液，使DNA分子形成可见的沉淀，然后用离心来分离沉淀。

5.洗涤：用盐溶液或酒精洗涤DNA沉淀，去除杂质，可以进行多次洗涤以提高纯度。

6. 重溶解：用适当的缓冲液（如Tris-EDTA）重溶解沉淀，得到高浓度的DNA溶液。

7.检测：对提取的DNA进行质量和纯度的检测，如使用比色法、凝胶电泳、荧光定量等方法来检测。

二、PCR体系：PCR（聚合酶链反应）是一种体外DNA复制的技术，它能迅速扩增少量DNA。

PCR体系的组成主要包括模板DNA、引物、聚合酶、四个dNTP、缓冲液和水。

1. 模板DNA：PCR的起始物质，可以是DNA提取物、基因库、克隆体等。

一般情况下，PCR需要1-100ng的模板DNA。

2.引物：PCR需要两种引物，分别位于模板DNA的两侧，起到引导DNA扩增的作用。

引物的浓度通常为0.2-1μM。

3. 聚合酶：PCR中常使用热稳定的DNA聚合酶（如Taq DNA聚合酶），它能耐受高温，保证PCR反应的稳定性。

通常为1-2.5 units。

4.dNTP：四个脱氧核苷酸，即dATP、dCTP、dGTP和dTTP，用于合成新DNA链的碱基。

通常浓度为0.2-0.4mM。

5.缓冲液：PCR反应需要具有适当的pH和离子强度的缓冲液，以维持反应中的酶活性和稳定性。

6.水：PCR反应中的水用于稀释和稀释试剂。

PCR反应一般分为三个步骤：变性、退火和延伸。

变性时，反应体系升温至94-95℃，使DNA融解成单链。

【实验九】DNA的粗提取与鉴定陈小珺（江西省赣州市第三中学341000）1 教学建议在本实验的教学中，教师应注意以下几点。

1.1 实验材料必须准备充足。

本实验所用的实验材料是鸡血细胞液,由活鸡的鲜血经沉淀后获得。

每组(2个学生)需用5 mL 鸡血细胞液,则每班(50人)至少需要130 mL,而鸡血细胞液与鸡血的体积比为1:3,这样每班至少需要390 mL 鸡血细胞液。

宰杀1只中等大小的活鸡,一般可得120 mL 左右的鲜血,因此,1个班实验需要买4只活鸡。

也可以到市场售活鸡处去索取鸡血,但所带烧杯中必须提前放入抗凝剂。

（每100ml鸡血加入3g柠檬酸钠）1.2 盛放鸡血细胞液的容器,最好是塑料容器。

因为鸡血细胞破碎后释放出的DNA,容易被玻璃容器吸附,由于细胞内DNA的含量本来就比较少,再被玻璃容器吸附去一部分,提取到的DNA就会更少。

1.3 获取较纯净的DNA的关键步骤。

1.3.1 充分搅拌鸡血细胞液：将鸡血细胞液与蒸馏水混合以后,必须用玻璃棒沿一个方向快速搅拌,使鸡血细胞加速破裂,并释放出DNA。

1.3.2沉淀DNA时必须用冷酒精：体积分数为95%的酒精在冰箱中至少存放24 h。

1.3.3正确搅拌含有悬浮物的溶液实验步骤3、5、7,都需要用玻璃棒搅拌。

教师应提醒学生注意,在进行步骤3、5时,玻璃棒不要直插烧杯底部,而且搅拌要轻缓,以便获得较完整的DNA 分子。

进行步骤7时,要将玻璃棒插入烧杯中溶液的中间,用手缓慢转动5 min。

2 实验原理的补充介绍2.1 DNA的释放本实验用鸡血细胞做实验材料有两个原因。

一是因为鸡血细胞核的DNA 含量丰富，材料易得；二是鸡血细胞极易吸水胀破。

DNA位于鸡血细胞的细胞核中,正常情况下不会释放出来。

为了使DNA从细胞核中释放出来,实验中采用了向鸡血细胞液中加入蒸馏水并且搅拌的方法。

蒸馏水对于鸡血细胞来说,是一种低渗液体,水分可以大量进入血细胞内,使血细胞破裂。

dna粗提取和鉴定的原理
DNA粗提取和鉴定主要是通过以下原理进行的：
1. 粗提取：DNA粗提取是将DNA从生物样本（如血液、唾液、组织等）中分离出来的过程。

最常用的方法是细胞裂解，以释放DNA。

细胞裂解可以通过物理方法（如机械切割、超声波
处理）或化学方法（如蛋白酶消化、洗涤剂裂解）来实现。

裂解后，可进行离心等步骤以去除细胞残渣和其他杂质，得到含有DNA的提取液。

2. 鉴定：DNA鉴定是通过比较DNA序列的相似性或特征来确定个体的身份、亲缘关系等。

主要有以下鉴定方法：
- 聚合酶链式反应（PCR）：PCR是通过复制特定DNA片段的方法，使得起始数量较少的DNA可以被扩增到足够数量以
进行分析。

PCR需要通过引物选择性扩增特定的DNA序列，
然后通过酶切、电泳等技术进行分析。

- DNA测序：DNA测序是确定DNA序列的方法。

常用的测
序技术有Sanger测序和下一代测序（如Illumina、Ion Torrent 等）。

测序后得到DNA的碱基序列，可以与数据库中的已知
序列进行比对，从而确定DNA的来源、身份等信息。

- DNA指纹技术：DNA指纹技术是根据DNA上的多态性位
点进行鉴定。

常用的方法是通过PCR扩增多个DNA位点，然后通过电泳等技术进行分析。

与其他个体相比较，每个个体的DNA指纹是独特的，可以用于身份鉴定、亲缘关系判定等。

这些原理在DNA粗提取和鉴定过程中相互作用，可以帮助科学家从生物样本中提取和鉴定DNA，为研究、法医学和医学诊断等领域提供有力的技术支持。

DNA的粗提取及鉴定实验教学设计实验目的：1.了解DNA的提取过程及原理。

2.学习DNA的鉴定方法。

3.掌握实验中的基本操作技巧。

实验原理：DNA的粗提取主要包括细胞破碎、DNA的溶解和纯化三个步骤。

实验中可以使用菌落PCR、血液等生物材料进行DNA的提取。

DNA的鉴定方法主要有电泳分离、PCR扩增及DNA测序等。

电泳分离可以通过DNA片段的大小差异来鉴定DNA的存在与否。

实验材料：1.细菌培养物或血液样品2.离心机3.恒温摇床4.DNA提取试剂盒5.TAE缓冲液6.紫外透射盒7.DNA分子量标记物8.PCR试剂盒实验步骤：1.细菌培养物的DNA提取b.弃去上清液，加入2mL的琼脂糖溶液并混匀。

f.取上清液，得到DNA提取物。

2.DNA的电泳分离a.准备0.8%的琼脂糖凝胶，加入适量的TAE缓冲液，加热溶解后待用。

b.取100μL的DNA提取物与10μL的DNA分子量标记物混合，并将混合液加入琼脂糖凝胶槽中。

c.在电泳槽中注入足够的TAE缓冲液，将琼脂糖凝胶槽完全覆盖。

d.连接电源，设置电压和时间，进行DNA的电泳分离。

e.使用紫外透射盒观察DNA带的迁移情况。

3.DNA的PCR扩增a.设置PCR反应条件，包括引物的浓度、模板DNA的浓度、反应体系的体积等。

b.将PCR反应体系按照设定的比例加入PCR试管中。

c.连接PCR仪，设置反应温度和时间，进行PCR扩增。

d.将PCR产物进行电泳分离，并观察PCR产物的扩增情况。

4.DNA的测序a.将PCR产物提取纯化。

b.将纯化后的PCR产物送往测序公司进行测序。

c.获取DNA序列结果，并进行测序结果的分析。

实验结果及讨论：1.细菌培养物的DNA提取可以通过观察DNA溶液的浑浊度来判断DNA提取效果的好坏。

溶液越浑浊，DNA提取效果越好。

2.DNA的电泳分离可以通过观察琼脂糖凝胶上DNA带的迁移情况来判断DNA的大小及纯度。

带迁移越远，DNA片段越小。

3.PCR扩增结果可以通过观察琼脂糖凝胶上PCR产物的带的扩增情况来判断PCR反应的效果。

DNA粗提取步骤一、目的要求本实验旨在使学生掌握DNA粗提取的基本原理和操作步骤，了解DNA的物理、化学性质以及其在生物科学研究中的应用。

通过实验，要求学生能够独立完成DNA的粗提取，并对实验结果进行分析和解释。

二、实验原理DNA粗提取的原理基于DNA在不同物理和化学环境中的稳定性。

在一定浓度的盐溶液和适当的温度条件下，DNA的溶解度会发生变化，从而实现DNA 的分离和提取。

本实验采用盐析法进行DNA粗提取，具体操作步骤如下：1.细胞破碎：通过物理或化学方法破碎细胞，释放出细胞内的DNA。

常用的破碎方法包括机械破碎（如研磨、匀浆等）、化学破碎（如用酸、碱或酶处理）和冷冻破碎等。

2.去除杂质：通过离心、过滤等方法去除细胞碎片、蛋白质和其他杂质，使DNA充分溶解在溶液中。

3.调节盐浓度：通过调节盐浓度，使DNA在盐溶液中的溶解度发生变化，从而实现DNA的分离和提取。

常用的盐溶液包括氯化钠、氯化钾、氯化钙等。

4.沉淀DNA：通过降低pH值、加入乙醇或异丙醇等方法，使DNA从溶液中沉淀析出。

5.洗涤与干燥：用70%乙醇或无水乙醇洗涤DNA沉淀，去除残留的盐分和杂质，然后干燥得到粗提取的DNA。

三、实验步骤1.准备实验材料与试剂（1）实验材料：鸡血细胞；（2）试剂：氯化钠、柠檬酸钠、蒸馏水、95%乙醇、70%乙醇；（3）仪器与器皿：离心管、离心机、滴管、玻璃棒、烧杯。

2.操作步骤（1）制备鸡血细胞溶液：取适量鸡血细胞，加入等体积的柠檬酸钠溶液，混合均匀后离心，去除上清液，得到鸡血细胞沉淀。

（2）破碎细胞：将鸡血细胞沉淀重新悬浮于适量蒸馏水中，加入适量的玻璃珠或石英砂，搅拌破碎细胞。

也可以采用匀浆、超声破碎等方法破碎细胞。

（3）去除杂质：将破碎后的溶液离心，去除上清液，得到的沉淀物为富含DNA的细胞碎片。

可以进一步用蒸馏水冲洗沉淀物，去除残留的蛋白质和其他杂质。

（4）调节盐浓度：向沉淀物中加入适量的氯化钠溶液，搅拌均匀，使DNA充分溶解在盐溶液中。

dna粗提取与鉴定DNA粗提取与鉴定DNA是生命的基础，它携带了生物体的遗传信息。

在现代分子生物学中，DNA的提取和鉴定是非常重要的技术。

本文将介绍DNA粗提取和鉴定的方法。

一、DNA粗提取1.1 细胞破碎法细胞破碎法是一种常见的DNA粗提取方法。

它通过机械或化学手段破坏细胞膜和核膜，释放出细胞内的DNA。

机械方法包括高压均质和超声波破碎等，化学方法包括SDS、NaOH等。

这些方法都可以有效地破坏细胞结构，但同时也会对DNA造成一定程度的损伤。

1.2 酚/氯仿法酚/氯仿法是一种经典的DNA粗提取方法，它利用酚对蛋白质和核酸有不同的溶解度来分离DNA。

首先用盐水或缓冲液洗涤样品，然后加入酚/氯仿混合液，在离心后上层为水相（含RNA）、中间为界面层（含蛋白质）和下层为有机相（含DNA）。

通过抽取下层的有机相，可以得到粗提的DNA。

1.3 硅胶柱法硅胶柱法是一种高效的DNA粗提取方法，它基于DNA和硅胶之间的亲和力。

首先将样品加入硅胶柱中，然后用盐水或缓冲液洗涤硅胶柱，最后用低盐缓冲液洗脱DNA。

这种方法可以得到较纯的DNA，并且适用于大量样品处理。

二、DNA鉴定2.1 凝胶电泳凝胶电泳是一种常见的DNA鉴定方法，它利用电场将带电的DNA分子移动到凝胶上。

根据不同长度的DNA片段在凝胶中行进速度不同来分离不同大小的DNA片段。

通过比较样品中不同长度的DNA条带，可以确定样品中是否存在目标序列。

2.2 PCR扩增PCR扩增是一种高效、敏感、特异性强的鉴定方法。

它通过引物特异性识别目标序列，在体外进行大量扩增。

PCR扩增可以检测极少量的目标序列，并且能够对复杂混合物进行分析。

2.3 DNA测序DNA测序是一种直接读取DNA序列的方法。

它通过将PCR扩增的目标片段或提取的DNA样品，进行测序仪读取，得到目标序列的具体信息。

这种方法可以检测出极少量的变异或突变，并且可以对整个基因组进行分析。

三、总结DNA粗提取和鉴定是现代分子生物学中非常重要的技术。