行业标准《出口动物源性食品中动物种类的定性检测T-RFLP方法》编制说明一、任务来源根据国家认证认可监督管理委员会2009年《关于下达2009年度出入境检验检疫行业标准制（修）订计划的通知》下达的编写任务通知（计划编号2009B134），由北京出入境检验检疫局负责《出口动物源性食品中动物种类的定性检测T-RFLP方法》的起草工作。
本标准是按照GB/T1.1-2009《标准化工作导则第1部分：标准的结构与编写规则》的要求进行编写的。
二、标准编制的目的和意义随着人们生活水平的提高和生活节奏的加快，人们对禽、肉、鱼等食品及其加工食品（如香肠、罐头等）的需求也在不断增加。
对于一些凭肉眼难以辨认其来源的动物源性食品（尤其是经过加工的食品），某些商家在经济利益的驱使下，常常用比较廉价的动物品种替代比较昂贵的动物品种。
现存比较常见的商业欺诈行为之一就是乱贴标签，标签上标明的原料成分与实际使用的原料成分不符。
这种行为不仅损害了消费者的经济利益和健康，而且还有可能打乱正常的市场竞争秩序。
为了更好地保护消费者的身体健康，维护消费者的经济利益，也考虑到宗教信仰问题，世界各国都对食品标签的内容做了严格的规定。
例如，在新加坡市场上，食品标签必须包括食品的品名（或对食品真实性的描述用语）和食品的成分，当食品由两种或多种成分构成时，对每一种成分应按它们的重量或所占比例给予恰当说明，其顺序应按照他们占有的重量百分比递减标示。
我国的《预包装食品标签通则》（GB7718-2004）也对食品标签的具体内容作了明确规定。
国家质检总局于早在2000年就颁布了《中华人民共和国进出口食品标签管理办法》。
该办法第二章标签审核的第十一条明确规定“进出口食品标签审核的内容包括：标签的格式、版面以及标注的与质量有关的内容是否真实、准确”。
对于乱贴标签现象，世界各国也在相关法规中作出明确规定。
如瑞士《食品条例》(Food Ordinance)的第十九章中要求食品标签不允许欺骗消费者。
我国的《预包装食品标签通则》（GB7718-2004）中也明确规定“食品标签的所有内容，不得以错误的、引起误解的或欺骗性的方式描述或介绍食品”。
法规已经明确规定食品必须加贴标签，而且食品标签不允许欺骗消费者。
贯彻执行这类法规的条件之一就是食品监管机构必须具有判断食品标签是否存在欺诈行为的能力。
对于动物源性食品而言，一个重要的判断依据就是检测其标签上标明的动物种类是否与实际使用的动物种类相符，即进行动物种类鉴定。
因此，开展动物源性食品中动物种类鉴定方法的研究对于更好地保障我国进出口食品的质量和安全、加强对国内动物源性食品市场和生产企业的监管，从而保护消费者的切身利益具有重要意义。
目前，我国已颁布的与动物种类鉴定有关的国家标准和行业标准有：1）GB/T 20190-2006 饲料中牛羊源性成分的定性检测定性聚合酶链式反应（PCR）法2）GB/T 21101-2007 动物源性饲料中猪源性成分定性检测方法PCR方法3）GB/T 21102-2007 动物源性饲料中兔源性成分定性检测方法实时荧光PCR法4）GB/T 21103-2007动物源性饲料中哺乳动物源性成分定性检测方法实时荧光PCR法5）GB/T 21104-2007 动物源性饲料中反刍动物源性成分（牛、羊、鹿）定性检测方法PCR方法6）GB/T 21105-2007 动物源性饲料中狗源性成分定性检测方法PCR方法7）GB/T 21106-2007 动物源性饲料中鹿源性成分定性检测方法PCR方法8）GB/T 21107-2007 动物源性饲料中马、驴源性成分定性检测方法PCR方法9）GB/T 21110-2007 动物源性饲料中骆驼源性成分定性检测方法PCR方法10）SN/T 1119-2002 进出口动物源性饲料中饲料中牛羊源成分检测方法PCR法11）SN/T 2051-2008 食品、化妆品和饲料中牛羊猪源性成分检测方法实时PCR 法从已制定的标准可以看出，已建立的常用的动物种类鉴定方法主要是物种特异引物普通PCR法和实时荧光PCR法。
如果是普通PCR法，PCR产物还需要经过测序或酶切进一步确定所含物种。
物种特异引物PCR或实时荧光PCR方法的检测灵敏度和特异性都很好，已建立的标准适用于鉴定猪、牛、羊、兔、狗、鹿、马、驴和骆驼9种动物成分。
对于其他的动物种类，由于还没有提供特异性的引物和探针，目前所建立的标准还没有提供方法进行鉴定。
而且对于牛和羊，所建立的标准不能鉴定是水牛还是奶牛，是山羊还是绵羊。
在没有特异引物和探针的情况下，根据文献资料的报道，国际上更多的是采用PCR-RFLP方法，这种方法使用通用引物而不是物种特异引物对提取的样品DNA进行扩增,扩增产物经适当的限制性内切酶酶切，通过产生的酶切图谱确定动物种类。
当客户需要我们鉴定送检样品中有没有某种动物成分，而这种动物成分又不在已建立标准所能鉴定的动物种类的范围内时，PCR-RFLP也不失为一种很好的解决问题的方法。
一般，只需要三种以上的限制性内切酶便可以确定动物种类。
对于普通的PCR-RFLP方法，PCR扩增后产物经酶切后用琼脂糖凝胶分析酶切结果。
普通琼脂糖凝胶的分辨率有限，片段小于100bp时条带不仅容易弥散，而且不容易准确判断片段大小，因此这种方法的结果判断受主观影响较大。
例如，我国现行的国家标准“饲料中牛羊源性成分的定性检测定性聚合酶链式反应（PCR）法”（GB/T 20190-2006）中写到“PCR 扩增产物经Sau3A I限制性内切酶酶切后，牛源性成分酶切产物的长度是57bp和214bp，绵羊源性成分酶切产物的长度是91bp和204bp，山羊源性成分的酶切产物的长度是92bp和202bp”。
实际用普通琼脂糖凝胶电泳判断这种短片段的酶切产物大小是很不准确的。
北京出入境检验检疫局技术中心于2008年向质检总局申报并立项了《食品中动物源性成分种类识别技术研究》（课题编号2008IK155）。
该课题首次尝试采用荧光标记和毛细管电泳技术解决PCR-RFLP技术中普通琼脂糖电泳分辨率较低的问题。
该课题于2009年2月经过专家鉴定并获得专家的一致好评。
研究结果也得到国际同行的认可，文章发表在Meat Science 85 (2010): 265-269。
在此课题的基础上，课题组向国家认证认可监督管理委员会提出申请并立项了行业标准《出口动物源性食品中动物种类的定性检测T-RFLP方法》（计划编号2009B134）。
本标准所建立的方法拓宽了我国已建立的动物种类鉴定的实验思路，可以有效完善我国已建立的动物种类领域的标准体系，为我国在动物源性食品鉴定方面提供新的技术手段和方法。
三、本标准的研究过程1. 实验材料北京出入境检验检疫局动检实验室为课题组提供了马、鹿、狗、猪、牛、绵羊、鸡等动物种类的血清样本。
小鼠肌肉组织由北京师范大学生命科学学院提供。
三文鱼、火鸡、水牛、绵羊和山羊样本从进口样本中采集。
鲟鱼样本由水产科学研究院东海水产研究所提供。
2. 实验方法的建立 2.1 DNA 提取方法的确认 2.1.1 传统方法选择最常用的SDS 方法提取动物组织。
操作步骤详见标准。
该方法能很好地提取出动物组织中的DNA 。
2.1.2 试剂盒法比较了三种常用的动物组织DNA 提取试剂盒的效果。
三种试剂盒分别为Promega 公司生产的Wizard® Genomic DNA Purification Kit(Wizard® 基因组DNA 纯化试剂盒)、Qiagen 公司生产的DNeasy® Blood & Tissue Kit （血液和组织DNA 提取试剂盒）和天根公司生产的TIANamp Genomic DNA Kit （TIANamp 基因组DNA 提取试剂盒）。
天根试剂盒和Promega 试剂盒提取DNA 的效果比较图见图1.1。
天根试剂盒和Qiagen 试剂盒提取DNA 的效果比较图见图1.2。
从电泳结果可以看出，对于未经加工的肉制品，三个试剂盒都可以提取出完整的DNA 。
4 3 2 1 M 4 3 2 1Tiagen Promega图1.1 天根试剂盒和Promega 试剂盒DNA 提取效果比较。
1为牛奶样品，2为猪肉样品，3为鸡肉样品，4为牛肉样品，M 为分子量标准DL2000。
9 8 7 6 5 4 3 2 1 M9 8 7 6 5 4 3 2 1 MTiagen Qiagen图1.2 Tiagen 试剂盒与Qiagen 试剂盒提取效果比较。
M ，分子量标准DL2000；1，虫草牛肉（平遥，冠陶牌）；2，麻辣驴肉（平遥，冠陶牌）；3，生鸡肉；4，水果乳酪；5，胡椒乳酪；6，山羊奶酪；7，猪肉香肠；8，唐扬（鸡肉制品）；9，生牛肉。
对于加工过的食品，由于加工过程中DNA降解，只能看见弥散的核酸，并看不到明显的条带。
三个试剂盒相比，Tiagen试剂盒的效果好于Promega试剂盒，与Qiagen试剂盒提取效果相当。
但是Tiagen试剂盒比Qiagen试剂盒廉价很多。
2.2 目的基因的选择2.2.1 引物合成通过查阅文献，分别合成了cytb1，cytb2，cytb3和12S rRNA的通用引物，引物序列见表1.1。
表1.1 cytb和12S rRNA基因通用引物序列和扩增产物长度2.2.2cytb1、cytb2、cytb3和12S rRNA扩增不同种类动物样品的扩增效果比较：分别用cytb1、cytb2、cytb3和12S rRNA引物扩增提取出来的鸡、狗、马和牛的DNA。
扩增产物电泳结果见图1.3。
从电泳结果来看，12S rRNA能够从全部4种动物中扩增出目的条带。
cytb1和cytb2扩增不出目的条带。
Cytb3能从牛肉DNA中扩增出明显的目的条带。
因此决定弃用cytb1和cytb2，将cytb3和12S rRNA引物用更多的物种做进一步的比较。
比较结果见图1.4。
从电泳结果来看，12S rRNA能够从全部18种动物中扩增出目的条带。
而cytb3只能从8种动物中扩增出明显的目的条带。
因此，选用12S rRNA基因作为扩增的靶基因。
图1.3 12S rRNA和cytb1、cytb2、cytb3扩增产物电泳图。
A，12S rRNA；B，cytb1；C：cytb2；D：cytb3。
18 17 16 15 14 13 NC M 12 11 10 9 8 7 6 5 4 3 2 1NC 18 17 16 15 14 13 M 12 11 10 9 8 7 6 5 4 3 2 1图1.4 12S rRNA 和cytb3 PCR 扩增产物电泳检测图。
A ： 12S rRNA 扩增结果；B ： cytb 扩增结果。
