感受态细胞和质粒DNA的转化

一、实验目的1. 理解质粒转化实验的基本原理和操作步骤。

2. 掌握感受态细胞制备和质粒转化方法。

3. 学会筛选和鉴定转化子。

二、实验原理质粒转化实验是将外源DNA片段（如质粒）导入受体细胞（如大肠杆菌）的过程。

通过转化，受体细胞获得外源DNA片段所携带的遗传信息，从而表现出相应的生物学特性。

本实验采用热冲击法将质粒DNA导入大肠杆菌感受态细胞中，通过筛选和鉴定转化子，实现对目的基因的克隆。

三、实验材料1. 质粒：pUC19质粒（含有抗生素抗性基因）2. 受体菌：大肠杆菌DH5α3. 试剂：氯化钙、NaCl、Tris-HCl、EDTA、TE缓冲液、无水乙醇、酚、氯仿、异丙醇、琼脂糖、DNA Marker、DNA测序引物等4. 仪器：恒温摇床、台式离心机、PCR仪、电泳仪、凝胶成像系统、紫外灯、超净工作台等四、实验步骤1. 制备感受态细胞（1）将大肠杆菌DH5α在含有抗生素的LB液体培养基中培养过夜。

（2）取适量培养物，按1:100的比例加入新鲜的LB液体培养基中，37℃振荡培养1.5小时，使细菌处于对数生长期。

（3）将细菌离心收集，弃去上清液，用冷的CaCl2溶液重悬细胞，使细胞浓度约为1×10^8个/mL。

（4）将重悬的细胞置于冰浴中5分钟，以降低细胞膜通透性。

（5）将细胞与质粒DNA混合，37℃温育30分钟。

（6）将混合物迅速置于冰浴中5分钟，以停止转化过程。

（7）将混合物加入到LB固体培养基中，37℃培养过夜。

2. 筛选和鉴定转化子（1）将培养皿中的单菌落接种到含有抗生素的LB液体培养基中，37℃培养过夜。

（2）提取转化子DNA，进行PCR扩增，检测目的基因是否存在。

（3）对PCR产物进行琼脂糖凝胶电泳，观察条带是否与预期相符。

（4）对阳性克隆进行测序，验证目的基因是否正确导入。

五、实验结果1. 感受态细胞制备成功，转化效率较高。

2. 成功筛选出转化子，目的基因导入受体细胞。

3. 阳性克隆PCR产物与预期相符，测序结果验证目的基因正确导入。

质粒转入感受态细菌的原理
质粒转入感受态细菌的原理是通过一种称为转化的机制进行的。

转化是细菌之间通过吸收外源DNA并将其融合到自身基因组中的过程。

感受态细菌是对外源DNA（如质粒）具有接受能力的细菌。

转化包括以下几个步骤：
1. 准备感受态细菌：通常使用复苏液处理细菌，复苏液中包含一些醣化剂或离子（如Ca2+）等物质，可以使细胞膜变得更容易渗透。

2. 吸收外源DNA：将质粒与感受态细菌一起暴露在低温、高电压或添加特定溶液条件下，使质粒能够进入细菌细胞。

3. DNA融合：在感受态细菌内，外源DNA通过DNA酶等酶的作用，与细菌染色体发生重组。

这样，外源DNA的片段可以被整合进细菌基因组中。

通过上述步骤，质粒可以被转入感受态细菌中。

感受态细菌在接受外源DNA后，它可能会表达质粒中的基因，从而产生质粒编码的特定蛋白质。

这种转化的机制被广泛应用于基因工程和遗传学研究中。

直接给出感受：通过质粒转化的过程，感受态细菌可以获得质粒中所携带的额外基因信息，这些额外基因信息可以被细菌利用，产生新的蛋白质，赋予细菌新的
功能或性状。

感受态的制备与转化，质粒提取（原理和操作步骤）感受态细胞: 理化方法诱导细胞，使其处于最适摄取和容纳外来DNA的生理状态。

即指细菌细胞在一定的生长阶段，自身或通过人为处理而具有摄取外源DNA并使其基因型和表现型发生相应变化的能力。

如大肠杆菌经CaCl2处理，就成为容易受质粒DNA转化的细胞。

一般来说,感受态细胞的最基本要求是：1、没有质粒2、容易被转进去（一般是G-细菌，细胞壁薄）3、营养条件一般，非苛养菌CaCl2法：操作原理：1.将快速生长的大肠杆菌置于经低温（0℃）预处理的低渗氯化钙溶液中，便会造成细胞膨胀，同时Ca2+会使细胞膜磷脂双分子层形成液晶结构，促使细胞外膜与内膜间隙中的部分核酸酶解离开来，离开所在区域，诱导细胞成为感受态细胞细胞膜通透性发生变化，极易与外源DNA相粘附并在细胞表面形成抗脱氧核糖核酸酶的羟基－磷酸钙复合物。

2.此时，将该体系转移到42℃下做短暂的热刺激（90s），细胞膜的液晶结构会发生剧烈扰动，并随机出现许多间隙，外源DNA就可能被细胞吸收。

进入细胞的外源DNA分子通过复制、表达，实现遗传信息的转移，使受体细胞出现新的遗传性状。

3.将转化后的细胞在选择性培养基上培养，筛选出带有外源DNA分子的阳性克隆。

意义：将构建好的载体转入感受态细胞进行表达，不仅可以检验重组载体是否构建成功，最主要的是感受态细胞作为重组载体的宿主可以进行后续实验，如蛋白质表达纯化等工作。

细菌处于容易吸收外源DNA的状态叫感受态。

转化是指质粒DNA或以他为载体构建的重组子导入细菌的过程。

实验材料：E. col i DH5α菌株: Rˉ,Mˉ,Ampˉ；pBS质粒DNA；eppendorf管。

试剂:1.LB固体和液体培养基2.Amp母液(储存浓度50mg/ml)3.含Amp的LB固体培养基:将配好的LB固体培养基高压灭菌后冷却至60℃左右,加入Amp储存液,使终浓度为50ug/ml,摇匀后铺板。

4.0.05mol/L CaCl2溶液:称取0.28g CaCl2(无水,分析纯),溶于50ml重蒸水中,定容至100ml,高压灭菌。

质粒转化42摄氏度热激作用
质粒转化是将外源 DNA 导入受体细胞的过程，其中一个关键步骤是热激作用。

在质粒转化过程中，将感受态细胞与质粒 DNA 混合后，需要进行热激处理，以提高转化效率。

热激的温度通常为 42°C，这是因为在这个温度下，细胞膜的通透性会增加，使得质粒 DNA 更容易进入细胞。

此外，热激还可以诱导 SOS 反应，激活一系列与 DNA 修复和重组相关的基因，从而促进质粒 DNA 的整合和表达。

热激的时间通常为 90 秒到 2 分钟不等，具体时间取决于使用的感受态细胞和质粒 DNA 的性质。

过长或过短的热激时间都可能会影响转化效率。

需要注意的是，热激处理可能会对细胞造成一定的伤害，因此在进行质粒转化时，需要选择适当的感受态细胞和质粒 DNA，并控制好热激的时间和温度，以确保转化效率和细胞的存活率。

42°C 的热激作用在质粒转化过程中起到了关键的作用，它可以提高细胞膜的通透性，促进质粒 DNA 的整合和表达，从而提高转化效率。