CaCl2感受态细胞的制备实验步骤

大肠杆菌的CaCl2化学感受态细胞制备和转化准备工作：1、LB琼脂平板若干。

2、50mL离心管若干，加满超纯水后于121℃20分钟灭菌备用。

3、含有50mL LB液体培养基的250mL三角瓶若干，121℃20分钟灭菌烘干。

4、1.5mL离心管若干，121℃20分钟灭菌烘干。

5、22﹪灭菌甘油溶液：22mL甘油加入78mL超纯水，121℃20分钟灭菌，保存于4℃。

试剂：1、100mL1mol/LCaCl2溶液：14.7gCaCl2.2H2O用超纯水配制成100mL贮存液，灭菌备用，保存于4℃冰箱。

2、100mL0.1mol/LCaCl2溶液：10mL1mol/LCaCl2溶液加90mL灭菌超纯水混匀，保存于4℃冰箱。

3、100mL0.1mol/LCaCl2甘油溶液：10mL1mol/LCaCl2溶液加90mL22﹪的灭菌甘油溶液，混匀，保存于4℃冰箱。

感受态细胞制备：1、晚上从－70℃冰箱活化大肠杆菌（如DH5α或JM109），划LB平板，37℃培养过夜。

2、晚上从培养平板上挑取单菌落接种到一支3mLLB液体培养基试管，37℃培养过夜。

3、早上按1：100比例将过夜培养菌液接种到含有50mLLB液体培养基的250mL 三角瓶中，200rpm，37℃培养1-2hr左右，测OD600到0.2-0.3时，转到50mL离心管，冰浴10分钟左右。

4、以4000rpm，在4℃冷冻离心收集菌体。

5、去上清，用0.1mol/L10mLCaCl2溶液重悬菌体，水浴20分钟左右。

6、以4000rpm，在4℃冷冻离心收集菌体。

7、去上清，将收集的菌体用1mL0.1mol/LCaCl2甘油溶液重悬，分装成100μl每个离心管，与－70℃保存。

8、必要时以浓度已知的标准质粒转化制备的感受态细胞以估计效率。

转化：1、从－70℃冰箱取出含有感受态细胞的离心管，在超净台上冰浴，待其融化后，加入连接产物或对照质粒，冰浴30分钟。

2、将离心管从冰浴取出并迅速转到42℃水浴热激90s，然后转冰浴2分钟。

大肠杆菌感受态细胞的CaCl2法制备及质粒转化实验原理处于对数生长期的细菌经CaCl2 处理后接受外源DNA的能力显著增加。

细菌处于容易吸收外源DNA的状态叫感受态。

在自然条件下，很多质粒都可通过细菌接合作用转移到新的宿主内，但在人工构建的质粒载体中，一般缺乏此种转移所必需的mob基因，因此不能自行完成从一个细胞到另一个细胞的接合转移。

如需将质粒载体转移进受体细菌，需诱导受体细菌产生一种短暂的感受态，以摄取外源DNA。

转化（Transformation）是将外源DNA分子引入受体细胞，使之获得新的遗传性状的一种手段，它是微生物遗传、分子遗传、基因工程等研究领域的基本实验技术。

转化过程所用的受体细胞一般是限制修饰系统缺陷的变异株，即不含限制性内切酶和甲基化酶的突变体（R-,M-），它可以容忍外源DNA分子进入体内并稳定地遗传给后代。

受体细胞经过一些特殊方法（如电击法，CaCl2 ，RbCl(KCl)等化学试剂法）的处理后，细胞膜的通透性发生了暂时性的改变，成为能允许外源DNA分子进入的感受态细胞（Compenent cells）。

进入受体细胞的DNA分子通过复制、表达实现遗传信息的转移，使受体细胞出现新的遗传性状。

将经过转化后的细胞在筛选培养基中培养，即可筛选出转化子（Transformant，即带有异源DNA 分子的受体细胞）。

目前常用的感受态细胞制备方法有CaCl2和RbCl(KCl)法，RbCl(KCl)法制备的感受态细胞转化效率较高，但CaCl2法简便易行，且其转化效率完全可以满足一般实验的要求，制备出的感受态细胞暂时不用时，可加入占总体积15%的无菌甘油于-70℃保存（半年），因此CaCl2法使用更广泛。

主要试剂(1)0.1mol/L CaCl2溶液(2)LB液体培养基(3)30%甘油：30mL甘油溶于100mL蒸馏水，高压灭菌。

主要设备(1)超净工作台(2)冷冻离心机(3)恒温摇床(4)－70℃冰箱(5)10mL移液管(6)吸耳球(7)1mL、200μL移液枪（配套枪头）(8)50mL 离心管(9)1.5mL离心管实验材料(1)大肠杆菌DH5α（R-，M-，Amp-）实验步骤（一）受体菌的培养(1)从LB平板上挑取新活化的E. coli DH5α单菌落，接种于3～5mL LB液体培养基中，37℃下振荡培养过夜（12h左右）。

实验五感受态细胞的制备及转化一、目的掌握感受态细胞制备和转化的基本方法。

二、原理所谓感受态细胞是通过一定的试剂处理细胞，使细胞处于易于接受外源DNA的生理状态。

通常用0.1mol/L CaCl2处理细胞，就可得到感受态细胞。

细胞原本所处的生理状态制备对感受态细胞的制备很关键。

将重组DNA导入细胞的方法有多种，入热休克法，电击法等。

通过这些方法可以使细胞膜出现暂时的松弛，导致外源DNA进入细胞。

三、试剂与仪器（一）试剂1．0.1mol/L CaCl2称取无水氯化钙56g，加重蒸水至500ml，于高压锅灭菌20分钟。

2．LB液体培养基（见实验一）3．LB固体培养基（见实验一）4．氨苄青霉素（100mg/ml）（二）仪器1．冷冻离心机2．平衡天平3．无菌操作台4．微量移液器5．高压灭菌锅四、操作步骤（一）感受态细胞的制备(0.1mol/L CaCl2方法)1．从深冻菌株中划单克隆（LB、建议用不加抗生素和加抗生素的两种培养基，检查有无污染）。

2．挑单克隆于5ml LB中(不加抗生素)，37℃摇菌培养12~16小时(300rpm)(可过夜培养)。

3．取1ml菌液（接种）到50 ml LB中(37℃，预热), 扩大培养。

应准备两个培养物。

4．约2小时开始，用一个培养测OD600值（此培养只做测量OD600值用，OD600值指示细胞密度，这里用于判断培养物是否处于对数生长期）。

OD600值在0.4 - 0.5时( 注意此时培养物处于对数生长期，细胞数应在20分钟内加倍。

所以建议OD600值应控制在0.4为佳)，立即把另一个培养物放置在冰浴里10分钟，让细胞停止分裂。

5．把培养物分装到两个50毫升聚丙烯管(灭菌并预冷)，4℃离心4000rpm, 10分钟。

6．弃上清, 加入10ml 0.1M CaCl2 (灭菌并预冷) 悬浮沉淀，4℃离心4000rpm，10 分钟。

7．弃上清, 加2ml 0.1M CaCl2 (灭菌并预冷) 悬浮沉淀。

感受态细胞制备制备感受态常用得方法就是电击法与CaCl2制备法,以下介绍CaCｌ2制备法:1、可以从－８0℃冰柜中,取出一支冻存菌株,于事先照过紫外得超净台中,用无菌得接种环轻轻蘸取菌种后,在无抗平板(由于Rocetta含有氯霉素抗性,需要涂布在氯霉素抗性得平板,后面得都就是如此)上划线,并将菌种迅速放回－80℃保存,在划线板上做好相应标记,于３7℃培养过夜。

2、从37℃培养过夜得新鲜平板上挑取一个单克隆,接种于2mlEP管中,3７℃,２20ｒｐm震荡培养约6个小时至对数生长中后期;将该菌悬液以1:1０0得比例接种于5０ml LB液体培养基(２瓶)中,3７℃振荡培养2、5小时至ＯD600＝0。

5。

注意:接种比例不得大于1:１0。

3、在无菌条件下将细菌转移到一个无菌、预冷得离心管(50ml)中,在冰上放置5~1０ｍin; 注意:划板、接种为了防止意外发生最好多划一块平板与多接一根试管,划板、接种、转接均要严格按照无菌操作。

4、4℃５000g离心５分钟。

用预冷得去离子水洗涤沉淀,4℃ 500０ｇ离心５分钟;Nｏte:此步主要就是为了洗去培养基中得盐等5、沉淀加入2ｍl预冷得0、05mol/L CaＣｌ2—１5％甘油混合溶液,轻吹散,冰浴5分钟,4℃5００0ｇ离心5分钟;6、沉淀加入2ｍl预冷得0.05ｍol/L CａCl２—15％甘油混合溶液,轻吹散,即成为感受态细胞悬液。

分装成50～1００μl得小份,贮存于－70℃可保存半年。

含15％甘油得0.０5mol/L CaCｌ2制备方法:称取0。

28g CaCl２(无水,分析纯),溶于５０ml重蒸水中,加入１5ｍl甘油,定容至100ｍl,高压灭菌。

感受态细胞得特征感受态:通过特殊处理使细胞处于能够吸收外源ＤＮA得状态。

感受态细胞得特征:(1)细胞表面暴露出一些可接受外来ＤNA得位点(以溶菌酶处理,可促使受体细胞得接受位点充分暴露)。

(2)细胞膜通透性增加(用钙离子处理,可使膜通透性增加,使DNＡ直接穿过质膜进入细胞)。

CaCl2感受态细胞的制备的实验步骤1．前夜接种受体菌（DH5α或DH10B），挑取单菌落于LB培养基中37℃摇床培养过夜（约16小时）；2．取1ml过夜培养物转接于100ml LB培养基中，在37℃摇床上剧烈振荡培养约2.5-3小时（250-300rpm）；3．将0.1M CaCl2溶液置于冰上预冷；以下步骤需在超净工作台和冰上操作4．吸取1.5ml培养好的菌液至1.5ml离心管中，在冰上冷却10分钟；5．4℃下3000g冷冻离心5分钟；6．弃去上清，加入100μl预冷0.1M CaCl2溶液，用移液枪轻轻上下吸动打匀，使细胞重新悬浮，在冰放置20分钟；7．4℃下3000g冷冻离心5分钟；8．弃去上清，加入100μl预冷0.1M CaCl2溶液，用移液枪轻轻上下吸动打匀，使细胞重新悬浮；9．细胞悬浮液可立即用于转化实验或添加冷冻保护剂（15% - 20%甘油）后超低温冷冻贮存备用（－70℃）。

·电转化法制备大肠杆菌感受态细胞的实验步骤1．前夜接种受体菌（DH5α或DH10B），挑取单菌落于LB培养基中37℃摇床培养过夜；2．取2ml过夜培养物转接于200ml LB培养基中，在37℃摇床上剧烈振荡培养至OD600=0.6（约2.5-3小时）；3．将菌液迅速置于冰上。

以下步骤务必在超净工作台和冰上操作4．吸取1.5ml培养好的菌液至1.5ml离心管中，在冰上冷却10分钟；5．4℃下3000g冷冻离心5分钟；6．弃去上清，加入1500μl冰冷的10%甘油，用移液枪轻轻上下吸动打匀，使细胞重新悬浮；7．4℃下3000g冷冻离心5分钟8．弃去上清，加入750μl冰冷的10%甘油，用移液枪轻轻上下吸动打匀，使细胞重新悬浮；9．4℃下3000g冷冻离心5分钟10．加入20μl冰冷10%的甘油，用移液器轻轻上下吸动打匀，使细胞重新悬浮；11．立即使用或迅速置于-70℃超低温保存。

附注：影响感受态细胞转化效率的因素及实际操作过程中应注意的事项：1．细菌的生长状态：实验中应密切注视细菌的生长状态和密度，尽量使用对数生长期的细胞（一般通过检测OD600来控制。

实验5 细菌培养及CaCl2法制备感受态细胞实验目的：明确培养基的配制原理；通过对LB培养基的配制，掌握配制培养基的一般方法和步骤；掌握细菌的接种、培养的无菌操作方法和步骤。

实验原理：重组DNA分子（质粒、噬菌体、粘性质粒）必须导入宿主菌中，通过细菌培养来扩增所需的重组DNA。

大肠杆菌与其它微生物一样，都具有稳定遗传性和变异性、遗传性，保证微生物本身特征的相对稳定，即无性繁殖过程中能够保持原有的性状，为菌种保藏提供了有利因此。

菌种保藏的原理是：通过低温、干燥、隔绝空气和断绝营养等手段，以达最大限度地降低菌种的代谢强度，抑制细菌的生长和繁殖。

由于菌种的代谢相对静止，生命活动将处休眠状态，从而可以保藏较长时间。

要求保存的菌种在复苏后除保持以前的生活与繁殖能力、不发生形态特征、生理状态及遗传性状的改变外，还不允许污染任何杂菌。

此外，在保存前应确保菌种的单纯性，先分离单菌落后进行鉴定，然后再繁殖保存。

常用的长期保存法有：液体石蜡法、硅胶保存法、加入甘油或二甲基亚砜（DMSD）等℃，由于在-70℃或液氮中冻存，细菌内保护剂。

目前比较常用的甘油低温保存法(-70~-196)的酶活性均己停止，即代谢处于完全停止状态，故可以长期保存。

在0~-70℃温度范围内，水晶呈针状，极易招致细菌的严重损伤。

用电镜观察，可见细菌的核膜上有大量针尖样小孔。

因此，为了避免0~-70℃冰晶的形成和细菌膜两侧离子平衡的破坏，需要加保护剂。

甘油可降低冰点，在缓慢的冻结条件下，能使细菌内水分在冻结前透出细菌外。

贮存在-70℃以下低温中能减少冰晶形成，甘油对细菌无毒性，分子量小，溶解度大，易穿透细菌。

甘油的使用浓度范围为15%-50%，一般常用30%。

在保存瓶中按1：1加入60%的甘油和菌液，混匀后贮存于-70℃或液氮中。

复苏后细菌仍能生长，活力不受任何影响。

培养基是人工地将多种物质按各种微生物生长的需要配制而成的一种混合营养基质，用以培养或分离各种微生物。

氯化钙法制备大肠杆菌感受态细胞实验原理转化是将外源基因引入受体细胞，使之获得新的遗传性状的一种手段，它是微生物遗传、分子遗传、基因工程等研究领域的基本实验技术。

转化过程所用的受体细胞经过一些特殊方法处理后，细胞膜的通透性发生了暂时性改变，成为允许外源DNA分子进入的状态，这种细胞称为感受态细胞。

进入受体细胞的DNA分子通过复制，表达实现遗传信息的转移，使受体细胞出现新的遗传性状。

将经过转化后的细胞在筛选培养基中培养，即可筛选出转化子（即带有异源DNA分子的受体细胞）。

目前常用的感受态细胞制备方法有CaCl2和RbCl 法。

制备出的感受态细胞暂时不用时，可加入占总体积15%的无菌甘油，并于-70℃保存。

本实验以E.coli DH5α菌株为受体细胞，并用CaCl2处理，使其处于感受态，然后与pUC18质粒共保温，实现转化。

由于pUC18质粒带有氨苄青霉素抗性基因（Amp）,可通过Amp抗性来筛选转化子。

如受体细胞没有转入pUC18，则在含Amp的培养基上不能生长。

能在Amp培养基上生长的受体细胞（转化子）肯定已导入了pUC18。

转化子扩增后，可将转化的质粒提出，进行电泳、酶切等进一步鉴定。

实验方法一、材料DH5a菌种（生工），3ml不含抗生素的LB液体培养基，100ml不含抗生素的LB液体培养基，盐酸，三羟甲基氨基甲烷（Tris碱），CaCl2，2块氨苄抗性LB固体培养基，2块卡纳抗性LB固体培养基，2块无抗性LB固体培养基,甘油。

二、设备移液枪(20μl,200μl,1000μl)，50ml离心管4支，对应离心管转子，0.45um针头滤器，30ml注射器，烧杯，量筒，容量瓶，锥形瓶，冰浴。

三、试剂准备1. LB培养基300ml：胰化蛋白胨3g，酵母提取物1.5g，NaCl3g，290ml去离子水，加入10mol/L NaOH，每次5μl，比对PH试纸至PH7.0左右。

1) 分装出100ml LB液体培养基（不含抗生素）。

生物工程大实验学院：生命科学学院专业： 10级生物工程班级：三班姓名：林冬学号：1009030302指导教师：肖露老师感受态细胞的制备和质粒的转化实验一．实验目的：1. 掌握用CaCl2法制备感受态细胞的原理和方法。

2.学习和掌握质粒DNA的转化和重组质粒的筛选方法。

二．实验原理：细菌吸收外源DNA 的能力最高时的状态被称为感受态细胞。

有些种类的细菌在其生长的任一阶段都处于感受态，而另一些细菌只有处于某个生长时期时（一般为对数生长早、中期），才会处于感受态，如本实验所用的大肠杆菌。

用一定浓度的CaCl2 处理对数生长早中期的细菌可以大大提高细菌吸收周围环境中的DNA分子的能力。

对这种现象的一种解释是CaCl2能使细菌细胞壁的通透性增强，从而提高转化率。

这种转化方法称为“化学法”。

三．材料：设备与试剂四．实验方法：①取100mlDH5ɑ培养物置于冰浴中10min，同时将0.1mCacl2和灭菌的50ml离心管4℃中放置10min.②在无菌条件下将培养物移入50ml离心管中（不能超过2/3体积约30ml）平衡后对称放入离心机，在4℃，6000转/min,离心5min,停止离心后，弃上清液（在超净工作上无菌条件下操作）③加入5ml预冷的0.1molCacl2溶液，用涡旋振荡器振荡均匀使DH5ɑ细胞重新悬浮，置于冰水浴中旋转20min后，在4℃6000转/min离心5min,弃上清。

④细胞重复③一次，离心后弃上清，沉淀后用4mlCacl2悬浮，加灭菌甘油至浓度15％左右，混匀后分装于1.5mlEP管中，200ul/管，于80℃冰箱中冻存备用。

转化实验：200ul感受态→加入1ul质粒混匀→42℃水浴90s→迅速拿出置于冰浴2min→加入800ulLB培养基→37℃，220rpm振荡培养1h→取出100ul涂板。

单菌落扩大培养用接种环挑单菌落接入含150ml液体LB培养基锥形瓶中。

37℃，120rpm摇瓶培养，直至透过菌悬液看报纸上的字能够看出形状但不能辨认。

E.coli Top10感受态细胞制备（CaCl2法）一、实验材料准备灭菌材料（提前2天）：一盒1.5mL EP管，6支50mL离心管（用四个），无菌大板小板，LB固体培养基，200mL LB液体培养基（100mL LB/500mL锥形瓶，现配，超纯水），0.1M CaCl2（现配50mL）、0.1M CaCl2+15%甘油（现配50mL）。

二、菌种活化无菌枪尖吸5μL感受态细胞（菌种也可）在新鲜的LB琼脂平板划线，37℃培养12-16小时。

注：划线尽量长、多，这样才可分出单菌落；如果早上做尽量早点接种划线，最好9点之前，否则就前一天晚上划线过夜培养；单个LB板（选用大板）如果用100mL倒平板，可先倒一个LB板（按15mL计算），剩余LB再加抗生素制成抗性平板。

三、预培养从LB平板上挑取一个分隔良好(处于线上形态圆润)的单菌落，转到一个含5mL LB的试管中，37℃，150rpm,12h。

此处过夜培养注：此处用两支试管，挑2个单菌落，但后面只用一个试管，好处防止某个管不长。

四、培养至对数期第二天早上从5mL菌液中各吸取1mL转接入2个100mL LB/500mL锥形瓶，37℃，200rpm，培养约2h，使OD达到0.4~0.6。

转接前吸取2mL LB培养基作空白对照。

在一个半小时时就测OD600，然后每隔10分钟测一次，接近0.4时每隔2分钟测一次。

注：开始接种时就把50mL和 1.5mL离心管放在-20℃冰箱，0.1M CaCl2、0.1MCaCl2+15%甘油、整盒蓝黄枪尖放在4℃。

培养1h时打开分光光度计预热，离心机预冷至4℃。

五、感受态细胞制备1.无菌条件下，将菌液转移到4个预冷的50mL圆底离心管中，在冰上放置10min。

2.4℃，1500g（尖底离心管1300rpm），离心10min，去上清，用枪吸尽残存培养基。

3.10mL预冷的0.1mol/L CaCl2重悬菌体，放置冰上，10min。