农杆菌感受态细胞的制备原理和实验步骤及验证

版本一? 农杆菌感受态细胞的制备? ℃保存的E H A105于含50μg/m l链霉素平板划线，28℃培养。

? ℃振荡培养12-16h r。

? ℃220r p m振荡培养至O D600=。

??℃5000r p m离心5m i n，去上清。

??℃。

? .双元载体转化农杆菌E H A105? 取1μg左右的质粒DNA加入到200ml EHA105感受态细胞中，混匀后，冰浴30min，-70℃放置10min 。

再在37℃水浴5min或42℃水浴1min，接着冰浴2min，加入800mlYM液体培养基28℃，175rpm摇培3hr后涂在含50μg/ml K a n a m y c i n的Y M平板上。

28℃培养到形成单菌落。

其中 YM 可以用LB 代替，第一次的 CaCl2 溶液可用溶液（（） DTT）替代。

版本二?普通农杆菌感受态制备与转化：?1. 挑单菌落于2ml YEP培养基（含Rif20mg/ml）中28℃过夜活化。

?2. 取2ml过夜菌液接种于50ml YEP培养基中28℃生长至OD600约等于左右（4hr）。

?3. 5k rpm离心5分钟。

?4. 在10ml NaCl中悬浮细胞。

?5. 5 krpm离心5分钟，悬浮细胞于20ml冰预冷的CaCl2。

?如不是马上使用，可以将之按200ul分装储存于-80℃待用。

?6. 加1ug DNA于200ul感受态细胞中，冰上放置30分钟。

?7. 液氮中冷冻1分钟。

?8. 37℃水浴溶化细胞。

?9. 加1ml YEP培养基，28℃摇床培养2-4hr（低速）。

?10. 离心1分钟，悬浮细胞在100ul YEP培养基中。

?11. 涂板，28℃培养2-3天。

?版本三?农杆菌感受态细胞的制备?1.挑取少许农杆菌LBA4404，接种于5ml LB液体培养基 (含50mg/L STR)中，28℃、200r/mim培养过夜。

?2.取2ml培养物于LB液体培养基 (含50mg/L STR) 中继续培养，直至OD800 为左右。

农杆菌感受态细胞的制备在科学的世界里，农杆菌这家伙可是个大明星，尤其是在植物基因工程中，简直就像是超级英雄一样的存在。

说到农杆菌，它是个很有趣的小家伙，特别是在我们想把新基因转移到植物里的时候，它的表现真是让人惊叹。

今天就来聊聊怎么准备感受态细胞，听起来有点高大上，其实就是让植物细胞准备好接受外来的基因，像小朋友期待新玩具一样，兴奋得不得了。

要准备的就是农杆菌的培养。

想象一下，咱们要给这些小家伙开个派对，当然要先让它们有个好环境。

选个合适的培养基，像是给它们铺一张舒适的床。

然后，温度、pH值、氧气这些条件也得一丝不苟，不能马虎。

温度太高，农杆菌可受不了，像人一样，热得直冒汗；温度太低，它们又会懒洋洋的，没精神。

要是培养基里的营养不够，嘿，那简直就是饿肚子的小朋友，没啥干劲。

就得让这些小家伙进入生长期，哈哈，听起来像在养宠物。

等它们长到合适的密度，咱们就准备好收割成果啦。

这时候，得小心翼翼地把它们从培养基里取出来，别把它们给弄伤了，像捧着刚出生的小宝宝一样。

取出的细胞要经过洗涤，洗去多余的培养基，确保它们干净得像新洗的衣服。

用生理盐水轻轻地重悬这些细胞，调成合适的浓度，让它们准备好迎接“客人”。

这里有个小窍门，嘿嘿，增加细胞的感受性。

可以用一些特殊的化合物，比如PEG，这玩意儿就像催化剂，能帮助细胞更好地接受外来的DNA。

想象一下，像是给小朋友加了点魔法，立马变得更加活泼，更有好奇心。

然后，得把想要转移的DNA和这些感受态细胞混合。

这个过程就像搭积木，得小心翼翼，别让它们散架。

把这个混合物在特定的条件下静置一段时间，让细胞慢慢适应，就像在等待一场盛大的聚会。

期间，要保持适宜的温度和环境，让它们尽情享受这个过程。

就要进行转化了。

这一步就像是给这些细胞送去了新玩具，兴奋得不得了。

把细胞和DNA一起放到农杆菌中，轻轻搅拌，别太猛，怕把小家伙们给搅晕了。

静置一段时间后，它们就会开始接受这些新基因，像在参加一场欢迎会一样。

感受态细胞的制备的实验步骤CaCl2感受态细胞的制备的实验步骤1．前夜接种受体菌（DH5α或DH10B），挑取单菌落于LB培养基中37℃摇床培养过夜（约16小时）；2．取1ml过夜培养物转接于100ml LB培养基中，在37℃摇床上剧烈振荡培养约2.5-3小时（250-300rpm）；3．将0.1M CaCl2溶液置于冰上预冷；以下步骤需在超净工作台和冰上操作4．吸取1.5ml培养好的菌液至1.5ml离心管中，在冰上冷却10分钟；5．4℃下3000g冷冻离心5分钟；6．弃去上清，加入100μl预冷0.1M CaCl2溶液，用移液枪轻轻上下吸动打匀，使细胞重新悬浮，在冰放置20分钟；7．4℃下3000g冷冻离心5分钟；8．弃去上清，加入100μl预冷0.1M CaCl2溶液，用移液枪轻轻上下吸动打匀，使细胞重新悬浮；9．细胞悬浮液可立即用于转化实验或添加冷冻保护剂（15% - 20%甘油）后超低温冷冻贮存备用（－70℃）。

·电转化法制备大肠杆菌感受态细胞的实验步骤1．前夜接种受体菌（DH5α或DH10B），挑取单菌落于LB培养基中37℃摇床培养过夜；2．取2ml过夜培养物转接于200ml LB培养基中，在37℃摇床上剧烈振荡培养至OD600=0.6（约2.5-3小时）；3．将菌液迅速置于冰上。

以下步骤务必在超净工作台和冰上操作4．吸取1.5ml培养好的菌液至1.5ml离心管中，在冰上冷却10分钟；5．4℃下3000g冷冻离心5分钟；6．弃去上清，加入1500μl冰冷的10%甘油，用移液枪轻轻上下吸动打匀，使细胞重新悬浮；7．4℃下3000g冷冻离心5分钟8．弃去上清，加入750μl冰冷的10%甘油，用移液枪轻轻上下吸动打匀，使细胞重新悬浮；9．4℃下3000g冷冻离心5分钟10．加入20μl冰冷10%的甘油，用移液器轻轻上下吸动打匀，使细胞重新悬浮；11．立即使用或迅速置于-70℃超低温保存。

Pei YX 实验室文档zengjieqiao 第七篇
农杆菌感受态细胞的制备
取-80℃保存的LBA4404于含50μg/ml链霉素平板划线，28℃培养。

挑取单菌落接种于5ml YEB液体培养基中，220rpm 28℃振荡培养12-16 h。

取2ml菌液转接于100ml YEB液体培养基中，28℃ 220rpm振荡培养至
=0.5。

OD
600
转入无菌离心管，4℃，5000rpm离心5min,去上清液。

溶液，轻轻悬浮细胞，冰上放置20min。

加入30ml预冷的(0.05-0.1)M的CaCl
2
4℃ 5000rpm离心5min，去上清。

溶液，轻轻悬浮。

加入4ml预冷的含15%甘油的(0.05-0.1)M的CaCl
2
农杆菌悬浮液分装于无菌1.5 ml Eppendorf管中，每管200μl冻存于-80℃。

注意：(0.05-0.1)M的CaCl
溶液都可以，差别不是很大!
2
转化
分别向200μL根癌农杆菌LBA4404感受态细胞中分别加入20 ng质粒DNA,轻轻混匀。

在冰浴中共放置30min。

置液氮中速冻5 min。

37℃热激5 min之后。

置冰上5 min,然后加入600μl YEB液体培养基。

于28℃、200 r/min培养4 h。

取100μL菌液均匀涂布于筛选培养基上,28℃放置36-48 h后可见抗性菌落长出。

阳性鉴定
挑去菌落过夜培养，进行菌液PCR！（注意做对照即：空的LBA4404也摇上，同时PCR）。

农杆菌感受态细胞的制备（以GV3101菌株为例）：1.在新铺制的加有20 mg/L Gen（庆大霉素）、50 mg/L Rif的YEB固体培养基上，用接种环或灭菌牙签“平板划线法”通过分区划线稀释分离得到农杆菌GV3101菌株的单克隆菌落。

2.挑选一个单克隆菌落，接种到5 mL新鲜的加有20 mg/L Gen、50 mg/L Rif的YEB液体培养基中，置摇床上28℃振荡培养过夜。

3.将过夜摇浓的GV3101菌液按1: 100比例接种到50 mL新鲜YEB液体培养基中，置28℃摇床，200 r/min振荡培养至OD600为0.5左右，将菌液转移至50 mL离心管，冰浴30 min。

4.集菌：将菌液置于4℃预冷的离心机中离心，4,000 r/min，10 min。

5.重悬：弃上清，加入10 mL预冷的0.15 M NaCl溶液，在冰上旋转震荡将菌块悬起，4,000 r/min，4℃离心10 min。

6.重悬：弃上清，加入1 mL预冷的20 mM CaC12溶液，在冰上旋转震荡将菌块悬起，分装至预冷的1.5 mL无菌离心管中，液氮速冻后，-80℃保存备用。

农杆菌感受态细胞的转化（冻融法）：将农杆菌感受态细胞从-80℃取出后置冰上自然解冻，在超净台中用无菌枪头吸取2 μL质粒加入到感受态细胞中，轻轻吹打混匀后于冰上静置30 min，再经液氮速冻2 min，37℃水浴热激5 min，在超净台内加入900 μL YEB液体培养基，置28℃摇床100 r/min慢速震荡复苏培养4-6 h。

复苏后的菌液离心，弃去约800灿上清，余下上清将菌体重悬起，均匀涂布到抗性筛选YEB固体培养基上，培养平板倒置于280C恒温培养箱内避光培养36—48 h。

菌落PCR初步鉴定阳性克隆：用灭菌牙签蘸一点菌落作为模板材料将其溶解在PCR反应体系中，PCR程序中的预变性时间相应延长，使细菌细胞壁裂解释放出核质。

通过比较电泳条带的大小，初步确定是否为阳性克隆。

1.1农杆菌感受态细胞的制备1.1.1. 取-70℃保存的EHA105于含50μg/ml链霉素平板划线，28℃培养。

1.1.2. 挑取单菌落接种于50ml YEB液体培养基中，220rpm 28℃振荡培养12-16 hr。

1.1.3. 取2ml菌液转接于100ml（含有抗生素） YEB液体培养基中，28℃220rpm振荡培养至OD600=0.5。

1.1.4.（将菌液冰浴30min后）转入无菌离心管，5000rpm离心5min,去上清液。

1.1.5. 加入10ml预冷的0.1M的CaCl2溶液，轻轻悬浮细胞，冰上放置20min。

4℃5000rpm离心5min，去上清。

1.1.6. 加入4ml预冷的含15%甘油的0.1M的CaCl2溶液，轻轻悬浮。

1.1.7. 农杆菌悬浮液分装于无菌Eppendorf管中，每管200μl冻存于-70℃。

农杆菌感受态细胞的制备(l)将农杆菌接种于5一10mlYEB液体培养基中(Str 100mg/L)，28℃震荡过夜。

(2)取lml活化的菌液接种于50ml含有抗生素的YEB培养基中，同样条件下培养至OD600值为0.4一0.5左右。

(3)将菌液冰浴30min后，装至50ml离心管中。

(4)4℃，5000g离心10min，收集菌体。

(5)弃上清，用lml 20mmol/L的冰预冷CaCl2重悬沉淀，并加入0.5ml，80%的甘油，混匀。

(6)按每管200ul分装，液氮速冻后于一70℃保存。

冻融法转化土壤农杆菌(l)取1ug载体DNA加到200ul冰上溶化的感受态细胞中，轻混，冰浴30min。

(2)液氮中速冻5min，37℃水浴5min，再迅速冰浴2min。

(3)加入800ul YEB液体培养基，28℃轻摇4一6hr。

(4)取50一200ul菌液涂布于YEB选择平板上（含有相应的抗生素），28℃倒置培养2天。

1.2. 双元载体转化农杆菌EHA105取1μg左右的质粒DNA加入到200ml EHA105感受态细胞中，混匀后，冰浴30min，-70℃放置10min 。

农杆菌感受态细胞制备第一天晚至第三天晚： 1）取-80℃保存的GV3101于含50μg/ml 利福平的LB （千分之一的利福平）平板划线，28℃培养（一般要两天）。

注意：划线的时候要少沾一点原菌株，不必等到菌株融化就可轻轻沾一点，一定要少量，然后轻轻地划在板上。

挑得太多不容易长出单菌落，如果太用力也容易伤到菌株。

第三天下午或晚： 2) 挑取单菌落接种于灭菌的50ml 新管子加10ml 50μg/ml （千分之一）利福平的LB 液体培养基中，200rpm 28℃振荡培养12-16 hr （过夜可以）。

注意：管子最好用灭菌过的报纸包一下，摇菌时。

第四天早： 3) 取1-2ml （按1:50或者1:100的比例）菌液转接于含有50μg/ml （千分之一）利福平的100ml LB 液体培养基中（用500 ml 的三角瓶来摇菌28℃，200rpm 振荡培养至OD 600=0.5）。

注意：摇菌的过程可能需要3-4小时，要随时监控菌的浓度，可以平行的摇两瓶，其中一瓶用来测浓度，避免污染；并且为了保证检测菌液与未检测菌液的一致性，平行的两瓶菌液，最好来源于同一个50 ml 管子的菌液。

摇菌的过程中可以预先把NaCl 置于冰上预冷。

4) 转移菌液到新的灭过菌的50 ml 离心管中，冰上30min ； 5) 4℃，5000rpm 离心5min 。

6) 在超净台中弃上清，将管子倒立在灭过菌的吸水纸上，尽量倒干，可以用预冷的NaCl 快速冲洗一遍。

7) 加入10ml 预冷的0.15M 的NaCl 溶液，轻轻悬浮细胞，冰上放置20min 。

注意：要用5ml 枪调到3ml 挡，轻轻抽打。

8) 4℃，5000rpm 离心5min 。

9) 在超净台中弃上清，将管子倒立在灭过菌的吸水纸上，尽量倒干。

10）加入2 ml 预冷的含15%甘油的20mM 的CaCl 2溶液，轻轻悬浮。

注意：要用1ml 枪轻轻抽打。

11）按200ul 的量分装到1.5 ml 无菌Eppendorf tube 中，液氮速冻，-80℃保存，一般不要存放超过2-3个月。

版本一1.1农杆菌感受态细胞的制备1.1.1. 取-70 C保存的EHA105于含50用/ml链霉素平板划线，28 C培养。

1.1.2. 挑取单菌落接种于 5ml YM液体培养基中，220rpm 28 C振荡培养12-16 hr。

1.1.3. 取2ml菌液转接于100ml YM 液体培养基中，28 C 220rpm 振荡培养至 OD600=0.5。

1.1.4. 转入无菌离心管，5000rpm 离心5min,去上清液。

1.1.5. 加入10ml预冷的0.1M的CaCI2溶液，轻轻悬浮细胞，冰上放置20min °4C 5000rpm离心5min，去上清。

1.1.6. 加入4ml预冷的含15%甘油的0.1M的CaCl2溶液，轻轻悬浮。

1.1.7. 农杆菌悬浮液分装于无菌Eppendof管中，每管200 M冻存于-70 C。

1.2.双元载体转化农杆菌 EHA105取1⑷左右的质粒 DNA加入到200ml EHA105 感受态细胞中，混匀后，冰浴30min , -70 C放置10min。

再在37 C水浴5min或42 C水浴1min，接着冰浴 2min，加入800mlYM 液体培养基 28 C, 175rpm 摇培3hr后涂在含50旧/ml Kanamycin 的YM平板上。

28 C培养到形成单菌落。

其中 YM 可以用LB代替，第一次的 CaCl2 溶液可用溶液（0.1MCaCI2 0.01Tris-HCI （7.0）0.01 DTT ）替代。

版本二普通农杆菌感受态制备与转化：1. 挑单菌落于2ml YEP培养基（含Rif20mg/ml ）中28 C过夜活化。

2. 取2ml过夜菌液接种于 50ml YEP培养基中28 C生长至 OD600约等于0.5左右（4hr ）。

3. 5k rpm离心5分钟。

4. 在10ml 0.15M NaCI 中悬浮细胞。

5. 5 krpm 离心5分钟，悬浮细胞于 20ml冰预冷的CaCI2。

双元载体的农杆菌转化
1.1农杆菌感受态细胞的制备
1.1.1. 取-70℃保存的EHA105于含50μg/ml链霉素平板划线，28℃培养。

1.1.
2. 挑取单菌落接种于5ml YM液体培养基中，220rpm 28℃振荡培养12-16 hr。

1.1.3. 取2ml菌液转接于100ml YM液体培养基中，28℃220rpm振荡培养至OD600=0.5。

1.1.4. 转入无菌离心管，5000rpm离心5min,去上清液。

1.1.5. 加入10ml预冷的0.1M的CaCl2溶液，轻轻悬浮细胞，冰上放置20min。

4℃5000rpm离心5min，去上清。

1.1.6. 加入4ml预冷的含15%甘油的0.1M的CaCl2溶液，轻轻悬浮。

1.1.7. 农杆菌悬浮液分装于无菌Eppendorf管中，每管200μl冻存于-70℃。

1.
2. 双元载体转化农杆菌EHA105
取1μg左右的质粒DNA加入到200ml EHA105感受态细胞中，混匀后，冰浴30min，-70℃放置10min(液氮一分钟)。

再在37℃水浴5min或42℃水浴1min，接着冰浴2min，加入800mlYM液体培养基28℃，175rpm摇培3hr后涂在含50μg/ml Kanamycin的YM平板上。

28℃培养到形成单菌落。

其中YM 可以用LB 代替，第一次的CaCl2溶液可用溶液（0.1MCaCl2
0.01Tris-HCl（7.0）0.01 DTT）替代。

1.农杆菌感受态的制备感受态制备溶液:8% PEG 4000, 4% DMSO,50mM CaCl220Mm重悬细胞效果更好？挑取农杆菌(EHA105和LBA4404)单菌落接种于含氯霉素或链霉素和利福平5mLYEB液体培养基中,28℃,200～250r/min振荡培养30～36h,转入100mLYEB液体培养基中(1:20比例接种),在相同条件下培养至菌液OD600=0.4-0.6(约10h)。

然后冰上放置菌液15min，4℃,4000r/min离心10min,用适量50mmol/L冰浴CaCl2溶液重悬后在相同条件下离心,再用1/10原体积50mmol/L冰浴感受态制备溶液重悬,用1.5mL离心管分装成50μL小份,置于冰上，液氮速冻之后现用或-80℃保存备用。

Not Iike E.coli cells, fresh A.bacterium competent cells had higher transformation efficiency . As time went on . the transformation efficiency was decreased. When the storage time was longer than7 days and the temperature is higher than 4℃, A. bacterium lost the competent ability.2.冻融法转化农杆菌50μl农杆菌感受态细胞中加入质粒DNA 0.1～1μg（5－10ul），与质粒混合均匀之后, 放置冰上30 min，然后置于液氮速冻3-5min,28℃水浴热激5min,然后加入无抗生素的LB培养基，28℃，200～250r/min振荡培养2h，涂布抗性平板，28℃静置培养36小时后挑菌落鉴定。

1. 根癌农杆菌GV3101感受态细胞的制备1) 挑取单菌落GV3101，接种于5mL附加有50mg/L的利福平的液体LB培养基中，28℃，200rpm，过夜；2) 取2mL培养物至50mL液体LB培养基中，继续培养至OD600为0.5左右；3) 将培养物冰浴30min，4℃，5000rpm，离心5min，弃上清；4) 用l0mL 0.lmol/L冷的NaCl悬浮菌体；5) 4℃，5000rpm，离心5min，弃上清；6) 1 mL 20mmo1/L冷的CaCl2悬浮，分装成50uL/管，液氮速冻后，-80℃保存。

农杆菌的感受态制备和转化-冻融法
农杆菌感受态细胞的制备
(l)将农杆菌接种于5一10mlYEB液体培养基中(Str 100mg/L)，28℃震荡过夜。

(2)取lml活化的菌液接种于200ml含有抗生素的YEB培养基中，同样条件下培养至OD600值为0.4一0.5左右。

(3)将菌液冰浴30min后，装至50ml离心管中。

(4)4℃，5000g离心10min，收集菌体。

(5)弃上清，用4ml 20mmol/L的冰预冷CaCl2重悬沉淀，并加入1.7ml，50%的甘油，混匀。

(6)按每管200ul分装，液氮速冻后于一70℃保存。

冻融法转化土壤农杆菌
(l)取1ug载体DNA加到200ul冰上溶化的感受态细胞中，轻混，冰浴30min。

(2)液氮中速冻5min，37℃水浴5min，再迅速冰浴2min。

(3)加入800ul YEB液体培养基，28℃轻摇4一6hr。

(4)取50一200ul菌液涂布于YEB选择平板上（含有相应的抗生素），28℃倒置培养2天。

CaCl2 20mM 50ml 20*mM/1000*110*50ml/1000=0.11g至50ml。

农杆菌感受态细胞的制备原理和实验步骤及验证农杆菌电击感受态的制备及电击转化表达载体pB-2mb-FRO-1.7A和pB-2mb-1.7A空载体的农杆菌（EHA105）电击转化（1）抽提纯化pB-2mb-FRO-1.7A和pB-2mb-1.7A空载体的重组质粒 pB-2mb-FRO-1.7A重组载体和pB-2mβ-1.7A空载体的（DH5α）菌种接种于5ml LB（含卡那霉素50mg/L）液体培养基中，37℃，200rpm震荡培养过夜。

按V-GENE公司的质粒提取试剂盒提取pB-2mb-FRO-1.7A重组质粒。

（2）取200ml型号的电击杯用无水乙醇浸泡，晾干。

（3）农杆菌EHA105电击预备处理。

I. 接种于5ml YEP（含链霉素Sm50mg/L）液体培养基中，28℃，200rpm震荡培养过夜至OD600值为0.4。

EHA105 II. 离心管中收集1ml菌液，4℃，8000rpm，离心30s。

1.5mlIII. 去残液，沉淀用200μl ddH2O充分悬浮，4℃，8000rpm，离心30s。

IV. 重复步骤�Ｈ�次。

V. 去残液，沉淀用200ml ddH2O充分悬浮，即为电击用农杆菌EHA105感受态。

加入200μl灭菌甘油混匀后置于-80℃备用。

（4）电击I. 分别取10ml pB-2mb-FRO1-1.7A和pB-2mb-1.7A重组质粒至200μl EHA105感受态中，轻打混匀，然后转移至电击杯中，置冰上。

II. 准备好电击装置（BioRad），电压为2.5V，用手按住电击按钮，直到啪的一声电击完毕。

III. 室温静置2min后加入800ml YEP培养液，28℃静置1h，然后28℃，200rpm培养2h。

IV. 离心30s，收集菌液，沉淀用200ml ddH2O悬浮，用玻璃棒涂布含含卡那霉素50mg/L和含链霉素Sm50mg/L的YEP固体培养基平板，28℃培养48h。

8000rpm1. 制备农杆菌电转感受态(1)挑取根癌农杆菌EHA 105单菌落，接种于5mlLB〔含利福平(Rif) 50mg/L,；链霉素100mg/L)液体培养基中，28'C, 220rpm震荡培养过夜。