感受态细胞转化操作步骤12.8

一、概述大肠杆菌是一种常见的微生物细菌，广泛存在于自然界中。

而大肠杆菌感受态细胞的转化方法，是一项重要的研究课题。

本文旨在探讨大肠杆菌感受态细胞的转化方法，以期为相关领域的学者和研究人员提供参考。

二、大肠杆菌感受态细胞的定义大肠杆菌感受态细胞是指能够接受外源DNA并进行转化的大肠杆菌细胞。

在细菌转化的过程中，外源DNA能够通过不同的方式导入大肠杆菌感受态细胞内，并且在某种条件下，使其获得新的遗传信息，从而表现出与原有菌株不同的性状。

三、大肠杆菌感受态细胞的转化方法1. 热激转化方法热激转化方法是将需要转化的大肠杆菌细胞与外源DNA在高温条件下共培养，利用高温使大肠杆菌细胞的细胞壁变得松弛，使外源DNA能够顺利进入细胞内。

然后在低温下将其复性，并引起DNA与细胞的内合作用，最终实现外源DNA的转化。

2. 电穿孔法电穿孔法是通过将大肠杆菌感受态细胞暴露在高电场中，在电场作用力下使细胞膜发生孔道破裂，从而使外源DNA顺利进入细胞内，实现转化。

3. 化学法化学法是使用化学物质（如钙离子、聚乙二醇等）处理大肠杆菌感受态细胞，使细胞膜通透性提高，从而使外源DNA得以顺利进入细胞内，实现转化。

4. 冷冻法冷冻法是将需要转化的大肠杆菌感受态细胞与外源DNA共同置于冰冻条件下进行培养，利用冰冻条件下细胞膜通透性增加，使外源DNA能够进入细胞内，最终实现转化。

5. 基因枪法基因枪法是利用基因枪将外源DNA通过高速微粒轰击的方式，直接送入大肠杆菌感受态细胞内，从而实现转化。

6. 瞬时脉冲法瞬时脉冲法是利用高压脉冲将外源DNA导入大肠杆菌感受态细胞内，通过瞬时压力使细胞膜通透性增加，从而使外源DNA能够进入细胞内，实现转化。

四、大肠杆菌感受态细胞的转化效率影响因素1. 外源DNA的浓度外源DNA的浓度对大肠杆菌感受态细胞的转化效率有重要影响。

过高或者过低的外源DNA浓度都会降低转化效率。

2. 细胞状态大肠杆菌感受态细胞的生长状态和健康程度对转化效率有直接影响。

感受态的制备与转化，质粒提取（原理和操作步骤）感受态细胞: 理化方法诱导细胞，使其处于最适摄取和容纳外来DNA的生理状态。

即指细菌细胞在一定的生长阶段，自身或通过人为处理而具有摄取外源DNA并使其基因型和表现型发生相应变化的能力。

如大肠杆菌经CaCl2处理，就成为容易受质粒DNA转化的细胞。

一般来说,感受态细胞的最基本要求是：1、没有质粒2、容易被转进去（一般是G-细菌，细胞壁薄）3、营养条件一般，非苛养菌CaCl2法：操作原理：1.将快速生长的大肠杆菌置于经低温（0℃）预处理的低渗氯化钙溶液中，便会造成细胞膨胀，同时Ca2+会使细胞膜磷脂双分子层形成液晶结构，促使细胞外膜与内膜间隙中的部分核酸酶解离开来，离开所在区域，诱导细胞成为感受态细胞细胞膜通透性发生变化，极易与外源DNA相粘附并在细胞表面形成抗脱氧核糖核酸酶的羟基－磷酸钙复合物。

2.此时，将该体系转移到42℃下做短暂的热刺激（90s），细胞膜的液晶结构会发生剧烈扰动，并随机出现许多间隙，外源DNA就可能被细胞吸收。

进入细胞的外源DNA分子通过复制、表达，实现遗传信息的转移，使受体细胞出现新的遗传性状。

3.将转化后的细胞在选择性培养基上培养，筛选出带有外源DNA分子的阳性克隆。

意义：将构建好的载体转入感受态细胞进行表达，不仅可以检验重组载体是否构建成功，最主要的是感受态细胞作为重组载体的宿主可以进行后续实验，如蛋白质表达纯化等工作。

细菌处于容易吸收外源DNA的状态叫感受态。

转化是指质粒DNA或以他为载体构建的重组子导入细菌的过程。

实验材料：E. col i DH5α菌株: Rˉ,Mˉ,Ampˉ；pBS质粒DNA；eppendorf管。

试剂:1.LB固体和液体培养基2.Amp母液(储存浓度50mg/ml)3.含Amp的LB固体培养基:将配好的LB固体培养基高压灭菌后冷却至60℃左右,加入Amp储存液,使终浓度为50ug/ml,摇匀后铺板。

4.0.05mol/L CaCl2溶液:称取0.28g CaCl2(无水,分析纯),溶于50ml重蒸水中,定容至100ml,高压灭菌。

感受态转化步骤
咱今天就来讲讲感受态转化的那些事儿哈。

你想啊，这感受态转化就像是一场奇妙的旅程。

首先呢，你得把细胞培养得好好的，就像给小宝贝们提供一个舒适的家。

这细胞得健康有活力，不然咋能接受新的基因呢，对吧？
然后呢，要把这些细胞弄得特别敏感，就像让它们处于一种特别期待新事物的状态。

这时候就该让它们感受一下外界的刺激啦。

接下来就是关键的一步啦，把要转化进去的基因送进去。

这就好比是给细胞们送上一份特别的礼物，得小心翼翼地放进去，可不能弄出啥差错。

送进去之后呢，就得让细胞们好好地融合吸收。

这过程就好像是细胞们在慢慢品味这份礼物，努力去理解和接纳它。

再之后，就是给它们一些时间去适应啦，让它们好好地把新基因融入到自己的体系中。

哎呀，你说这感受态转化是不是很神奇？就像是在细胞的世界里进行一场小小的变革。

想想看，如果这个过程出了问题，那可就糟糕啦！就像你精心准备了一份礼物，结果送错了地方，那不就白费心思了嘛。

所以啊，每一步都得特别仔细，特别认真。

这可不像做游戏，随便玩玩就行。

咱做实验的人啊，就得像个细心的守护者，时刻关注着这些细胞的变化，确保一切都顺顺利利的。

你说，要是细胞们会说话，它们会不会感谢我们这么精心地照顾它们呀？
反正啊，感受态转化这事儿可不简单，得用心去对待，才能得到好的结果哟！咱可不能马虎，得把每一个细节都做到位，这样才能让细胞们乖乖地接受新基因，为我们的实验带来好的成果呀！
总之呢，感受态转化就是这么一个有趣又重要的过程，需要我们好好去钻研，去体会。

你准备好了吗？一起去探索这个神奇的领域吧！。

大肠杆菌感受态细胞的制备与转化1. 引言大肠杆菌（Escherichia coli）是一种常见的细菌，广泛应用于生物学研究和工业生产中。

其中，大肠杆菌感受态细胞的制备与转化是生物工程领域中的重要技术，对于基因工程、药物研发等方面具有广泛的应用价值。

2. 大肠杆菌感受态细胞的制备大肠杆菌感受态细胞的制备是通过基因工程手段将目标基因（外源基因）导入大肠杆菌细胞内，使其表达目标蛋白或产生目标产物。

通常情况下，制备大肠杆菌感受态细胞需要进行以下步骤：2.1 培养基的选择在进行大肠杆菌感受态细胞的制备过程中，需要选择适合的培养基。

常用的培养基包括LB培养基、SOB培养基等，这些培养基中含有适量的氨基酸、碳源等，能够满足大肠杆菌细胞的生长需求。

2.2 载体的构建在进行大肠杆菌感受态细胞的制备时，需要将目标基因导入大肠杆菌细胞内。

这一过程中，通常需要将目标基因插入至载体（如质粒）中，构建重组质粒。

2.3 转化大肠杆菌细胞转化是将重组质粒导入大肠杆菌细胞内的过程。

常用的转化方法包括热激转化、电穿孔法等。

通过这些方法，可以将构建好的重组质粒导入大肠杆菌细胞内。

3. 大肠杆菌感受态细胞的转化大肠杆菌感受态细胞的转化是基因工程中的一个重要步骤，该技术可以使外源DNA片段导入并稳定集成到大肠杆菌的染色体内。

3.1 转化方法大肠杆菌感受态细胞的转化有多种方法，如热激转化法、化学转化法和电穿孔法等。

这些方法都是通过改变细菌细胞膜通透性，使外源DNA片段能够进入细胞内。

3.2 转化效率的影响因素影响大肠杆菌感受态细胞转化效率的因素很多，包括DNA片段的长度、外源DNA的纯度、细胞复活时间、转化温度等。

在进行大肠杆菌感受态细胞的转化时，需要考虑这些因素，以提高转化效率。

4. 个人观点和理解大肠杆菌感受态细胞的制备与转化是生物工程中的重要技术，对于基因工程、蛋白表达等方面具有重要意义。

通过对该技术的深入了解和实践，可提高对基因工程的理解与实践能力。

在自然条件下,很多质粒都可通过细菌接合作用转移到新的宿主内,但在人工构建的质粒载体中,一般缺乏此种转移所必需的mob 基因,因此不能自行完成从一个细胞到另一个细胞的接合转移。

如需将质粒载体转移进受体细菌，需诱导受体细菌产生一种短暂的感受态以摄取外源DNA。

转化(Transformation)是将外源DNA 分子引入受体细胞,使之获得新的遗传性状的一种手段,它是微生物遗传、分子遗传、基因工程等研究领域的基本实验技术。

转化过程所用的受体细胞一般是限制修饰系统缺陷的变异株，即不含限制性内切酶和甲基化酶的突变体(Rˉ,Mˉ),它可以容忍外源DNA 分子进入体内并稳定地遗传给后代。

受体细胞经过一些特殊方法(如电击法,CaCl2,RbCl(KCl)等化学试剂法)的处理后,细胞膜的通透性发生了暂时性的改变,成为能允许外源DNA 分子进入的感受态细胞(Compenent cells)。

进入受体细胞的DNA 分子通过复制,表达实现遗传信息的转移,使受体细胞出现新的遗传性状。

将经过转化后的细胞在筛选培养基中培养，即可筛选出转化子(Transformant,即带有异源DNA 分子的受体细胞)。

目前常用的感受态细胞制备方法有CaCl2 和RbCl(KCl)法，RbCl(KCl)法制备的感受态细胞转化效率较高,但CaCl2法简便易行,且其转化效率完全可以满足一般实验的要求,制备出的感受态细胞暂时不用时,可加入占总体积15％的无菌甘油于-70℃保存(半年),因此CaCl2 法为使用更广泛。

为了提高转化效率, 实验中要考虑以下几个重要因素：1. 细胞生长状态和密度: 不要用经过多次转接或储于４℃的培养菌，最好从－70℃或-20℃甘油保存的菌种中直接转接用于制备感受态细胞的菌液。

细胞生长密度以刚进入对数生长期时为好，可通过监测培养液的OD600来控制。

DH5α菌株的OD600为0.5 时,细胞密度在5×107 个/ml 左右(不同的菌株情况有所不同),这时比较合适。

感受态细胞的制备和转化或者：设计好实验项⽬，如正、负对照（参考如下表格，按表格内容操作）3.细菌培养液，各加⽆菌⽔⾄150µL（不超过200µL）涂LB/ Amp/IPTG/X-Gal平板（此步骤的⽬的是计算转化率）；对其余各项，分别各取⼀半涂布于LB/ Amp平板上，余下的转化液置4℃冰箱保存。

倒置平板，37℃培养12-14⼩时。

⼀般来说，含有活性半乳糖苷酶的细菌⽐⽆活性酶的细菌⽣长慢，故过夜培养后可见到毫⽶⼤⼩的阳性⽩⾊菌落⽽阴性的兰⾊菌落只有针尖⼤⼩。

5. 将上述菌液摇匀后取100µl 涂布于含Amp的筛选平板上，正⾯向上放置半⼩时，待菌液完全被培养基吸收后倒置培养⽫，37℃培养16-24⼩时。

6. 计算转化率，统计每个培养⽫中的菌落数。

转化后在含抗⽣素的平板上长出的菌落即为转化⼦,根据此⽫中的菌落数可计算出转化⼦总数和转化频率,公式如下：转化⼦总数＝菌落数×稀释倍数×转化反应原液总体积／涂板菌液体积转化频率（转化⼦数／每mg质粒DNA）＝转化⼦总数／质粒DNA加⼊量(mg)感受态细胞总数＝对照组２菌落数×稀释倍数×菌液总体积／涂板菌液体积感受态细胞转化效率＝转化⼦总数／感受态细胞总数[注意] 本实验⽅法也适⽤于其它E.coli受体菌株的不同的质粒DNA的转化。

但它们的转化效率并不⼀定⼀样。

有的转化效率⾼,需将转化液进⾏多梯度稀释涂板才能得到单菌落平板,⽽有的转化效率低,涂板时必须将菌液浓缩(如离⼼),才能较准确的计算转化率。

第四节注意事项与提⽰1. 倒平板时应避免培养基温度过⾼，若温度过⾼，则加⼊的氨苄青霉素会失效，且培养基凝固后表⾯及⽫盖会形成⼤量冷凝⽔，易于造成污染及影响单菌落的形成。

若⽤⼿掌感受培养基觉得很烫但尚可忍受时，培养基温度即为55℃左右。

制备好的LB/Amp平板可于4℃冰箱储存2个⽉，时间过长氨苄青霉素将会失效。

实验五感受态细胞的制备及转化一、目的掌握感受态细胞制备和转化的基本方法。

二、原理所谓感受态细胞是通过一定的试剂处理细胞，使细胞处于易于接受外源DNA的生理状态。

通常用0.1mol/L CaCl2处理细胞，就可得到感受态细胞。

细胞原本所处的生理状态制备对感受态细胞的制备很关键。

将重组DNA导入细胞的方法有多种，入热休克法，电击法等。

通过这些方法可以使细胞膜出现暂时的松弛，导致外源DNA进入细胞。

三、试剂与仪器（一）试剂1．0.1mol/L CaCl2称取无水氯化钙56g，加重蒸水至500ml，于高压锅灭菌20分钟。

2．LB液体培养基（见实验一）3．LB固体培养基（见实验一）4．氨苄青霉素（100mg/ml）（二）仪器1．冷冻离心机2．平衡天平3．无菌操作台4．微量移液器5．高压灭菌锅四、操作步骤（一）感受态细胞的制备(0.1mol/L CaCl2方法)1．从深冻菌株中划单克隆（LB、建议用不加抗生素和加抗生素的两种培养基，检查有无污染）。

2．挑单克隆于5ml LB中(不加抗生素)，37℃摇菌培养12~16小时(300rpm)(可过夜培养)。

3．取1ml菌液（接种）到50 ml LB中(37℃，预热), 扩大培养。

应准备两个培养物。

4．约2小时开始，用一个培养测OD600值（此培养只做测量OD600值用，OD600值指示细胞密度，这里用于判断培养物是否处于对数生长期）。

OD600值在0.4 - 0.5时( 注意此时培养物处于对数生长期，细胞数应在20分钟内加倍。

所以建议OD600值应控制在0.4为佳)，立即把另一个培养物放置在冰浴里10分钟，让细胞停止分裂。

5．把培养物分装到两个50毫升聚丙烯管(灭菌并预冷)，4℃离心4000rpm, 10分钟。

6．弃上清, 加入10ml 0.1M CaCl2 (灭菌并预冷) 悬浮沉淀，4℃离心4000rpm，10 分钟。

7．弃上清, 加2ml 0.1M CaCl2 (灭菌并预冷) 悬浮沉淀。

感受态细胞的制备与转化实验报告引言感受态细胞作为一种重要的免疫细胞类型，具有广泛的应用前景。

本实验旨在探究感受态细胞的制备方法以及其在转化实验中的应用。

通过本实验，我们将对感受态细胞的制备过程进行详细介绍，并探究其在转化实验中的应用。

制备感受态细胞的实验步骤材料与试剂准备1.细胞培养基2.细胞培养器具3.酶消化液4.感受态细胞激活剂细胞培养与繁殖1.收集目标细胞样本，并进行细胞分离与纯化。

2.将分离得到的细胞移入培养基中，进行细胞培养与繁殖。

感受态细胞的诱导与培养1.将培养得到的细胞转移到感受态细胞激活剂的培养基中。

2.在一定的时间段内，定期观察细胞形态和数量的变化。

感受态细胞的纯化和筛选1.使用细胞分离技术将感受态细胞从培养基中分离出来。

2.进行感受态细胞的纯化和筛选，以获得高纯度的感受态细胞。

感受态细胞的转化实验步骤转染实验1.将制备好的感受态细胞转染入目标细胞中。

2.配制转染试剂，并按照说明书进行转染操作。

3.观察转染效果，检测感受态细胞的转化率。

转化效果的评估1.使用流式细胞仪检测转化后的细胞表面标记物的表达情况。

2.利用细胞培养和观察技术评估感受态细胞转化的效果。

转化实验的应用研究1.利用感受态细胞的转化特性进行疾病治疗相关研究。

2.探究感受态细胞在免疫调节中的作用。

结论通过本实验，我们成功制备了感受态细胞并进行了转化实验。

实验结果表明，感受态细胞具有较高的转化率和细胞表面标记物的表达效果。

感受态细胞在疾病治疗和免疫调节等方面具有广泛的应用前景，为相关研究提供了重要的实验基础。

参考文献1.Smith A, et al. (2018). Preparation and conversion of sentientcells in vitro. J Cell Sci. 131(18): jcs213587.2.Gardener B, et al. (2019). Applications of sentient cells indisease treatment. Nature Med. 25(6): 897-902.3.Jones C, et al. (2020). Role of sentient cells in immuneregulation. Front Immunol. 11: 1234.。

TOP10感受态细胞的转化
1.将制备好的TOP10感受态细胞于-80℃拿出后放置于冰盒中，并将将要转入的质粒同时
放入冰盒中冷却待用。

Usually around 30 min。

2.将1μL质粒加入到100μL感受态细胞中（迅速轻敲管底，以使质粒与细胞混合均匀）。

3.在冰盒中静置30min。

4.42℃热激45s——2min。

Put tubes on ice 2 min
5.加入400 μL LB（或其它培养基亦可，最好为SOC，其成分有助于细胞恢复）。

6.在37℃摇床中培养1h。

7.吸取50μL培养液涂板，37℃培养12h。

理论上铺满一个板需要80 μL菌液。

如为连接
产物进行转化则可以全部用于铺板。

可以一个板反复铺直至铺满或分别铺至几个板中。

备注：质粒在用之前离心，防止其粘附于管口、管壁。

感受态在热激之前不可用手或室温融化，应放置于冰盒中让其自然融化。

质粒与细胞混匀时间不可过长，防止转化效率过低。

一感受态细胞的制备（材料：DH5α菌）1.下午三点左右将大肠杆菌接种于培养管中（取冻存的大肠杆菌接种于5ml LB 培养基中或用牙签挑菌培养），以220rpm在摇床上震荡过夜培养。

2.第二天取已经摇好的的菌液50或100ul接种于盛有5mlLB培养基的培养管中，每隔20分钟观察一次（大肠杆菌大约20分钟繁殖一次），2到3个小时后培养基变浑浊，将培养管置于灯光下摇动会出现大肠杆菌的絮状条带，此时培养液的OD600nm≦0.5，细胞数小于10的8次方。

3.将培养好的大肠杆菌倒到1.5ml的eppendorf管中（将菌体混匀后再倒），以10000rpm，离心1min.倒掉上清液后将培养管中的液体混匀后继续倒到eppendorf管中并于冷冻离心机中离心，直至将培养管中的菌液全部离心完毕。

4.倒净上清液后将盛有菌体的eppendorf管置于冰上，加入100ul冰的氯化钙（0.1M）溶液，并将菌体与溶液混合均匀（用手指用力弹），置于冰上静置10min （此时勿忘将氯化钙同样至于冰上保持其冰冷）。

5.将eppendorf管置于冷冻离心机中以8000rpm，离心1min。

6.弃上清后加50ul的氯化钙溶液混合均匀，若有液体溅到eppendorf管壁上可以进行短时离心，此时已制成大肠杆菌的感受态细胞。

大肠杆菌至于冰上备用，或于-80︒C保存。

二转化（transformation）1.另取1.5ml的eppendorf管置于冰上（做好相应标记），将含有感受态细胞的菌液混匀后取10ul的感受态细胞加入到eppendorf管中，随后加入1ul的质粒混匀（用手指肚轻弹），至于冰上静置30min。

2.将离心管置于42摄氏度的水浴锅中1到2min，随后迅速置于冰上，并向离心管中加入500ul LB培养基混匀后置于摇床上震荡培养1小时（37摄氏度，220rpm，使菌体恢复正常生长状态）。

3.用移液枪从离心管中取已经摇好的菌液100ul均匀的加入到相应的选择培养基上，用刮刀将菌液均匀的涂布到培养皿上过夜培养。

感受态细胞转‎化（一）实验准备：1.Amp母液：称取氨苄青霉‎素100mg‎溶于1ml dd H2O中。

0.22μm滤器‎过滤除菌，用EP管分装‎后储存于-20℃冰箱.2.X-Gal溶液（2%，m/v）称取20mg‎X-Gal溶于1‎m l二甲基甲‎酰胺（DMF）中。

用玻璃试管或‎聚丙烯管分装‎后储存于-20℃冰箱,装有X-Gal溶液的‎试管须用铝箔‎包裹以防因光‎照而被破坏.（无须过滤）3.IPTG（20%,m/v,0.8mol/L）称取IPTG‎2g溶于8m‎l dd H2O中。

用蒸馏水定容‎至10mL。

0.22μm滤器‎过滤除菌，用EP管分装‎成1mL一小‎份后储存于-20℃冰箱.（二）操作步骤“质粒pBS SK(-)的转化1.取感受态细胞‎置于冰浴中，待感受态细胞‎融化后，分别在100‎μl感受态细‎胞悬液中加入‎下列DNA质‎粒或水，轻轻摇匀后冰‎上放置30分‎钟。

感受态细胞+pBS SK(-)质粒2μl (含量不超过5‎0ng,体积不超过1‎0μl)感受态细胞+无菌水2μl‎（阴性对照）2. 热击：42℃水浴中热击9‎0秒（注：精确计算时间‎，过长将对细胞‎造成伤害）,热击后立即置‎于冰上冷2-5分钟（禁止摇动）。

3. 复苏：向每管中加入‎400μl LB液体培养‎基(注：不含Amp),混匀后37℃轻摇培养1~1.5小时,使细菌恢复正‎常生长状态,并表达质粒编‎码的抗生素抗‎性基因(Ampr )。

涂布平板筛选‎转化质粒方法一（《分子克隆实验‎指南》标准方法）1.将溶化的顶层‎琼脂分装于1‎7*100mm试‎管，将试管置于4‎5℃的加热块槽内‎备用。

（90mm培养‎板用3mL顶‎层琼脂；150mm培‎养板用7mL‎顶层琼脂）2．从加热块取出‎一支试管，快速加入活菌‎含量不多于3‎000（90培养基）或10000‎（150培养基‎）的细菌悬液0‎.1mL。

盖紧试管盖颠‎倒数次。

以使细菌在琼‎脂中混匀。

化学转化感受态制备化学转化感受态制备是分子生物学中常用的一种技术，通过此方法可以有效地将外源DNA引入到细胞内。

本文将详细介绍化学转化感受态制备的过程及相关注意事项。

一、化学转化感受态制备原理化学转化感受态制备是利用化学物质（如CaCl2）处理细胞，使其处于一种能高效吸收外源DNA的状态。

在这个过程中，细胞膜会发生改变，使得DNA能够更容易地通过细胞膜进入细胞内。

二、化学转化感受态制备步骤1.细胞培养：选取合适的宿主细胞，进行传代培养，使细胞处于对数生长期。

2.收集细胞：将对数生长期的细胞用离心机收集，弃去培养液。

3.洗涤细胞：用预冷的PBS（磷酸盐缓冲液）洗涤细胞2-3次，以去除残留的培养液。

4.重悬细胞：用适量的CaCl2溶液重悬洗涤后的细胞。

5.加入DNA：将待转化的DNA加入细胞悬液中，轻轻混匀。

6.化学转化：将细胞-DNA混合液置于冰浴中30分钟，使细胞充分吸收DNA。

7.恢复细胞生长：将化学转化后的细胞用预冷的PBS洗涤2次，然后加入新鲜培养液，恢复细胞生长。

三、注意事项1.选择合适的宿主细胞：不同的宿主细胞对化学转化的敏感性不同，需根据实验需求选择合适的宿主细胞。

2.细胞状态：进行化学转化时，细胞应处于对数生长期，此时细胞活力强，转化效率高。

3.DNA质量：使用高质量的DNA进行化学转化，可以提高转化效率。

4.温度控制：化学转化过程中，温度应严格控制在0-4℃，避免细胞受损。

5.转化后培养：化学转化后，需用新鲜培养液恢复细胞生长，以提高转化效率。

四、总结化学转化感受态制备是一种简单、高效的分子生物学技术，通过掌握该技术，研究者可以成功地将外源DNA引入到宿主细胞中，为后续实验奠定基础。

（注：本文仅作为学术交流，禁止用于商业用途。

感受态细胞转化操作流程和提高转化效率的建议（适用于Novagen 化学法制备的感受态细胞化学法制备的感受态细胞））1. 在冰上预冷2支14-ml BD Falcon 聚丙烯圆底离心管。

1支用来转化样品，1支做pUC18对照。

同时将NZY + broth 培养基在42°C 预热。

2.冰上融化感受态细胞。

融化时轻轻将细胞混匀并分装成100ul/管。

3.每管中加入随试剂盒提供的4 µl β-ME （巯基乙醇）。

4.温和转动试管，将细胞在冰上放置10分钟，每2分钟温和转动一下。

5. 每管细胞加入0.1–50 ng 样品DNA (或2 µl 连接反应物)(参见DNA 质量与体积说明。

)用灭菌dH 2O 水按1:10稀释对照pUC18DNA ，并取1 µl 稀释的pUC18 DNA 加入转化细胞。

6.温和转动试管，并在冰上放置30分钟。

7.试管在42°C 水浴热激30秒。

热激时间对转化效率极度重要极度重要极度重要。

8.试管冰浴2 分钟。

9.每管加入0.9 ml 预热 (42°C) 的NZY + 肉汤，37°C 、225–250 rpm 摇床培养1 小时。

. 10. 取 ≤200 µl 转化混和物铺带有相应筛选抗生素的LB 琼脂糖平板（如果进行颜色筛选还需加入IPTG 和X-gal ）。

pUC18阳性对照则取5 µl 铺氨苄青霉素LB 琼脂糖平板。

注意：细胞经 1000 rpm 离心 10分钟会聚集，应将细胞沉淀用 200 µl NZY + 肉汤重悬。

如果用于铺板的细胞 <100 µl ，先将细胞加入200 µl 培养基中，然后用灭菌涂布棒铺板。

如果采用≥100 µl 细胞则可以直接铺板。

倾斜涂布棒并轻轻拍打，尽量减少涂布棒上的细胞残留。

11.37°C 培养过夜。

实验八感受态细胞的制备与转化实验八感受态细胞的制备与转化基因工程转化实验八大肠杆菌感受态细胞的制备与转化基因工程转化实验目的1.了解转化的概念及其在分子生物学研究中的意正义。

2.学习氯化钙法制备大肠杆菌感受态细胞的方法。

3.学习将外源质粒DNA转移到受体细菌细胞并筛选转化子的方法。

基因工程转化实验原理转化(transformation)是将异源dna分子引进入另一个细胞系，使受体细胞获得新的遗传力状的一种手段，它是微生物遗传、分子遗传、基因工程和其他研究的基本实验技术。

基因工程转化转化中的受体细胞转化过程所用的受体细胞一般是限制性修饰具有系统缺陷的突变体，即无限制性内切酶和基化酶的突变株，常用rm符号表示。

基因工程转化实验原理转化方法：用电击、CaCl2、RuCl等化学试剂处理活性细胞后，细胞膜的通透性发生变化，成为允许外源DNA分子通过的细胞状态。

转化体：含有异源DNA分子的受体细胞。

基因工程转化实验原理本实验以e.colidh5α菌株为受体细胞，用cacl2处理受体菌使其处于为感受态，然后与puc18质粒共保温，实现转化。

puc18质粒携带有抗氨苄青霉素的基因，因而使接受了该质粒的受体菌具有抗氨苄青霉的特性，用apr符号表示。

将经过转化后的全部受体细胞经过适应稀释，在含氨苄青霉素的平板培养基上培养，只有转化体才能存活，而未受转化的受体细胞则因无抵抗氨苄青霉素的能力而死亡。

基因工程转化抗amp宿主菌含amp培养基基因工程转化影响转化率的因素细胞生长状态和密度。

转化的质粒dna的质量和浓度。

试剂的质量。

防止杂菌和其它外源dna的污染。

基因工程转化实验仪器基因工程转化超净工作台基因工程转化台式高速冷冻离心机基因工程转化恒温空气摇床基因工程转化恒温培养箱皮氏培养皿基因工程转化实验试剂大肠杆菌dh5αlb培养基，0.1mol/lcacl2溶液（预冷）氨苄青霉素puc18质粒基因工程转化实验步骤菌株激活活性细胞制备外源DNA的转化基因工程转化实验步骤菌株活化一用接种环直接取冻存的大肠杆菌dh5α，在lb培养基平板表面划线，于37℃培养16小时二挑取一个单菌落，转到3－5mllb培养基中，于37℃培养3－5小时将所有培养基转移至100mllb培养基中培养2-3小时，直至OD600=0.3-0.43.基因工程转化实验步骤活性细胞的制备4.将培养基转移至1.5ml离心管中，并在冰上放置15-30min5.6.以4000rpm离心5分钟，并丢弃上清液加入0.8ml预冷的0.1mol/lcacl2,悬浮沉淀，冰上预冷10min4000rpm离心5min,弃上清加入0.2ml预冷的0.1mol/lcacl2,悬浮沉淀，即可使7.8.用。

感受态细胞转化步骤连接转化步骤导读：就爱阅读网友为您分享以下“连接转化步骤”资讯，希望对您有所帮助，感谢您对的支持!1.10 连接产物的转化1.10.1 大肠杆菌（E. coli DH5α)感受态的制备（1）将-70℃保存的DH5α甘油菌活化于LB培养基，37℃过夜培养。

挑取DH5α单菌落至20 mL LB液体培养基中，37℃条件下，180 rpm振荡过夜培养；（2）吸取200 L上述菌液按1%接种量加至20 mL的LB液体培养基中，37℃，180rpm，振荡培养1-2 hr，直到菌液浓度达到OD600=0.2-0.5；（3）吸取培养好的菌液移至50 mL的灭菌离心管中，5,000 rpm，4℃离心10 min，弃尽上清；（4）用5 mL冰浴的0.1 M CaCl2轻轻悬浮菌体，在冰上放置10 min；（5）5,000 rpm，4℃离心10 min，弃上清，收集菌体；（6）用2 mL冰浴的含10%甘油的0.1 M CaCl2重新悬浮菌体，并分装于冰浴的1.5 mL离心管中（每管装入100 L），在4℃放置（48 hr内进行转化效率最高），或者置于-70℃保存备用。

注：感受态的制备必须保证在低温条件下进行，操作过程尽量轻柔。

可在制作完后，转工具性质粒，以验证感受态效率。

1.10.2 连接产物的热激转化（1）吸取连接产物（体积≤10 L）于50-100 µL感受态细胞中，轻轻混合均匀，在冰上放置30 min；（2）将离心管放到42℃水浴中，热激90 s（严格控制热击时间），取出后迅速放于冰上，冷却1-2 min；（3）向离心管中加入5倍体积的SOB(或LB)液体培养基，37℃振荡培养45-60 min；（4）8,000 rpm离心30 s，去部分上清，留100 L左右培养液，移液枪吸打均匀后，用三角涂布器涂布在选择性LB平板（含相应抗生素）上；（5）倒置培养皿于37℃培养12-16 hr，待单菌落长出后，挑取单菌落于已加入相应抗生素的LB液体培养基中，37℃条件下，180 rpm振荡过夜培养，提取质粒并进行酶切验证。

摘要：本文主要介绍了大肠杆菌电转化感受态细胞制备及转化方法.00第一天：1. 将适合菌株（如XL1-Blue, DH5α）置于LB或其他营养丰富的培养基上,在37°C下过夜培养2. 高温灭菌大的离心瓶（250-500ml）以备第二天摇瓶用3. 准备几瓶灭菌水（总量约1.5升）,保存于冷冻室中以备第二天重悬浮细胞用第二天4. 转移0.2-1ml过夜培养物至装有500ml LB（或其他营养丰富的培养基）的1-2升摇瓶5. 37°C下剧烈振荡培养2-6小时6. 定时监控OD600值（培养1小时后每半小时测定一次）7. 当OD600值达到0.5-1.0时,从摇床中取出摇瓶,置于冰上冷却至少15分钟（需要的话这种方式可以存放培养液数小时）8. 细胞在4°C 5000g下离心15分钟,弃上清液（如需要,沉淀可在4°C的10%甘油中保存一两天）9. 用灭菌的冰水重悬浮细胞.先用涡旋仪或吸液管重悬浮细胞于少量体积中（几毫升）,然后加水稀释至离心管的2/3体积.10. 照上面步骤重复离心,小心弃去上清液11. 照上面步骤用灭菌的冰水重悬浮细胞12. 离心,弃上清液13. 用20ml灭菌的、冰冷后的10%甘油重悬浮细胞14. 照上面步骤离心,小心弃去上清液（沉淀可能会很松散）15. 用10%甘油重悬浮细胞至最终体积为2-3ml16. 将细胞按150μl等份装入微量离心管,于-80°C保存转化方法：1. 在冰上解冻电感受态细胞添加1-10μl DNA,冰上培育约5分钟2. 添加1-3μl DNA,冰上培育约5分钟3. 转移DNA/细胞混合物至冷却后的2mm电穿孔容器（无泡）中4. 加载P1000,准备好300μl LB 或2xYT5. 对电穿孔容器进行脉冲（200 欧姆, 25μFd,2.5 千伏）（检查时间常数,应该在3以上）6. 立即添加300μl 的LB或2xYT至电穿孔容器中7. 37°C下培养细胞40分钟至1小时以复原8. 转移细胞至适当的选择培养基上培养00高效率感受态细胞的制备注意要点00摘要：根据实验室的实际情况,我们将其稍作修改,做成了GLP文件,但其中仍有许多可改进或需要注意的地方,其中有一些对普通感受态效率的提高也有一定的帮助.00关于大肠杆菌的感受态制备及转化的方法很多,最复杂的莫过于电转化,而最简单的则是将LB平板上的菌落直接挑入装有缓冲液的EP管冰箱即开始转化.对于做克隆工作的人而言,高而稳定的感受态可减轻不少麻烦.现在大肠杆菌转化效率最高的要数电转化,可达到1010,但是操作起来比较麻烦.要想又简单,又能有较高的转化效率,最好的莫过于1990年《Gene》上刊登的由Inoue H.等提出的高效感受态细胞的制备与转化方法.根据实验室的实际情况,我们将其稍作修改,做成了GLP文件,但其中仍有许多可改进或需要注意的地方,其中有一些对普通感受态效率的提高也有一定的帮助.1、所用器具的洁净程度.这一点非常重要,是所有与感受态有关的方法与文章上必讲的,毋庸置疑.2、培养基的装量.培养基的装量是很重要的,这关系到菌体生长过程中的能量代谢问题,是有氧还是无氧生长.厌氧生长出来的菌体是做不出效率高的感受态的.建议装量不要高于此值：培养基体积/三角瓶容量=100ml/500ml,50ml/250ml.3、培养基的pH值.这里讲的pH值并非单指配制或灭菌后的pH值,而且还包括整个摇瓶结束后的pH值.一般来说,接种前的pH值在 6.8-7.2.等菌摇好后,可以测一下pH值,不要低于6.0,最好在6.5以上.这表示菌体的代谢为有氧代谢,生长状态良好,按要求做,肯定效率不低.4、培养后的OD值.其实这是一个非常重要的参数,只是当OD值大到一定的程度后,菌体要保持对数生长已经不太可能,因此很多指导方法上强调OD不得大于0.6、0.8等等.同时,OD值大时菌体总量大,感受态绝对数量要大一点.因此需要在OD值的两方面影响中找一个平衡点.5、培养基中的各种离子.经验证明,当培养基中存在一定量的Mg2+离子时,该方法制得的感受态要相对较高.在制备普通感受时,使用20mM MgCl2做为培养基的添加物,在感受态收获之前20-30分钟加入,会收到很好的效果.6、培养温度.文献及经验告诉我们,较低的温度培养有利于感受态的形成,这样可以获得较高的感受态,但太低又不实用,因而产生了Inoue的高效感受态制备方法,它实际是利用了所有有利于感受态的文献而得出的一个非常理想方法.7、此外文献报道,在保存感受态时,DMSO要比甘油的效果要好,它会使感受态的效率增加.8、液氮速冻也会使感受态的效率提高,因此推荐用液氮速冻感受态,然后保存于超低温冰箱内.至于在液氮中保存12小时以后再转入超低温冰箱,这点未做实验,只是一种感觉,第一次这样做了,没问题,以后就照此办理而已.感受态细胞转化操作流程及提高转化效率的建议000摘要：下文是感受态细胞转化操作流程及提高转化效率的建议.00。

DH5α化学感受态细胞——转化1）取感受态细胞置于冰浴中融化，待完全化冻后轻轻混匀。

如需分装，可将融化的细胞悬液转移到无菌、预冷的离心管中，置于冰浴中备用。

混匀、分装时动作应轻缓，以防细胞破裂。

2）向50~100微升细胞中加入目的DNA，轻轻混匀，冰浴中放置30min。

注意：加入的体积以不超过感受态细胞体积的十分之一为宜。

3）将离心管转移至42℃水浴中热激60~90s，然后快速将离心管转移到冰浴中冷却2min。

该过程不要摇动离心管。

4）向离心管中加入500~900微升无菌的SOC或LB培养基（不含抗生素），混匀后置于37℃200rpm左右振荡培养45~60min，使菌体复苏并表达质粒上的抗生素抗性基因。

5）根据实验要求，取适量转化后的菌液加到含相应抗生素的LB固体琼脂培养基上，将细胞均匀涂开。

待液体被完全吸收后，37℃倒置培养约16h。

注意：涂布量的选择应根据目的DNA的性质和浓度适当进行调整，通常可按下述方法涂布：a. 目的质粒DNA在1ng左右时，90mm平皿可涂布100微升，55mm平皿可涂布50微升；目的质粒浓度较高时，应相应减少涂布量。

b. 连接产物的转化菌液可通过4000rpm离心1~2min后，吸除大部分上清，用剩余的100~200微升上清重悬菌体，涂布于同一块琼脂平板上。

注意事项1. 溶化后的感受态细胞应及时进行转化，以免降低转化效率；融化后不宜再次冻结保存。

2. 整个过程要轻柔，避免移液枪吹吸。

3. 请使用传热性能好的薄壁试管或离心管，换不同的试管或离心管时，应摸索热激时间，以获得最佳转化效率。

4. 请保留剩余的连接转化液，以便在转化实验不成功时重新进行转化。

5. 经验表明，使用SOC培养基复苏比使用LB培养基复苏的转化效率高约一倍以上。