基于GC_MS策略的奶牛热应激血液代谢组学研究_郭延生.compressed

畜牧兽医学报　２０１５，４６（８）：１３５６－１３６２Ａｃｔａ　Ｖｅｔｅｒｉｎａｒｉａ　ｅｔ　Ｚｏｏｔｅｃｈｎｉｃａ　Ｓｉｎｉｃａｄｏｉ：１０．１１８４３／ｊ．ｉｓｓｎ．０３６６－６９６４．２０１５．０８．０１１基于ＧＣ－ＭＳ策略的奶牛热应激血液代谢组学研究郭延生，贾启鹏，陶金忠＊（宁夏大学农学院动物科学系，银川７３００２０）摘　要：为了系统揭示热应激对奶牛血液代谢物及其代谢通路的影响。

本研究根据奶牛热应激的判定标准，选择１０头处于热应激状态的荷斯坦高产泌乳牛为热应激组，至次日凌晨直肠温度和呼吸频率恢复到正常范围时，再次被视为恢复组。

各组奶牛尾静脉采血，制备血浆。

然后采用ＧＣ－ＭＳ代谢组学技术，结合模式识别策略寻找两组奶牛血液差异代谢物，并将差异代谢物输入ＫＥＧＧ数据库进行代谢通路的构建与功能分析。

结果表明，８个内源性代谢物可作为奶牛热应激的潜在生物标志物。

其中，葡萄糖、α－亚麻酸、亚油酸、甘油、棕榈酸、β－羟丁酸和甘氨胆酸盐含量在热应激过程中显著降低，而乳酸含量显著升高。

提示热应激加剧了奶牛能量负平衡状态，主要通过增强脂肪酸氧化和甘油分解代谢途径活性，抑制糖酵解过程进行调节和应答，在此过程中伴有肝功能障碍的生理现象。

研究结果可为进一步阐明奶牛热应激的生理机制提供科学依据。

关键词：热应激；奶牛；代谢组学；ＧＣ－ＭＳ；血液代谢物中图分类号：Ｓ８１５．４ 文献标志码：Ａ 文章编号：０３６６－６９６４（２０１５）０８－１３５６－０７Ｂｌｏｏｄ　Ｍｅｔａｂｏｌｏｍｉｃ　Ｓｔｕｄｉｅｓ　ｏｆ　Ｈｅａｔ　Ｓｔｒｅｓｓ　Ｃｏｗ　ｗｉｔｈ　ＧＣ－ＭＳＧＵＯ　Ｙａｎ－ｓｈｅｎｇ，ＪＩＡ　Ｑｉ－ｐｅｎｇ，ＴＡＯ　Ｊｉｎ－ｚｈｏｎｇ＊（Ｄｅｐａｒｔｍｅｎｔ　ｏｆ　Ａｎｉｍａｌ　Ｓｃｉｅｎｃｅ，Ｓｃｈｏｏｌ　ｏｆ　Ａｇｒｉｃｕｌｔｕｒｅ，Ｎｉｎｇｘｉａ　Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ，Ｙｉｎｃｈｕａｎ　７３００２０，Ｃｈｉｎａ）Ａｂｓｔｒａｃｔ：Ｔｈｅ　ｓｔｕｄｙ　ａｉｍｅｄ　ｔｏ　ｒｅｖｅａｌ　ｔｈｅ　ｅｆｆｅｃｔｓ　ｏｆ　ｈｅａｔ　ｓｔｒｅｓｓ　ｏｎ　ｄａｉｒｙ　ｃｏｗ　ｂｌｏｏｄ　ｍｅｔａｂｏｌｉｔｅｓ　ａｎｄｉｔｓ　ｍｅｔａｂｏｌｉｃ　ｐａｔｈｗａｙｓ　ｉｎ　ａ　ｓｙｓｔｅｍａｔｉｃ　ｗａｙ．Ａｃｃｏｒｄｉｎｇ　ｔｏ　ｔｈｅ　ｃｒｉｔｅｒｉａ　ｆｏｒ　ｅｖａｌｕａｔｉｎｇ　ｃｏｗ　ｈｅａｔｓｔｒｅｓｓ，１０ｈｉｇｈ　ｍｉｌｋ　ｙｉｅｌｄ　Ｈｏｌｓｔｅｉｎ　ｃｏｗｓ　ｉｎ　ｈｅａｔ　ｓｔｒｅｓｓ　ｓｔａｔｕｓ　ｗｅｒｅ　ｓｅｌｅｃｔｅｄ　ａｓ　ｈｅａｔ　ｓｔｒｅｓｓ　ｇｒｏｕｐ，ｔｈｅｓｅ　ｃｏｗｓ　ｗｅｒｅ　ｒｅｇａｒｄｅｄ　ａｓ　ｒｅｃｏｖｅｒｙ　ｇｒｏｕｐ　ａｇａｉｎ　ｕｎｔｉｌ　ｔｈｅｉｒ　ｒｅｃｔａｌ　ｔｅｍｐｅｒａｔｕｒｅ　ａｎｄ　ｒｅｓｐｉｒａｔｏｒｙｒａｔｅ　ｒｅｔｕｒｎｅｄ　ｔｏ　ｔｈｅ　ｎｏｒｍａｌ　ｒａｎｇｅ　ａｔ　ｎｅｘｔ　ｍｏｒｎｉｎｇ．Ｂｌｏｏｄ　ｓａｍｐｌｅｓ　ｏｆ　ｅａｃｈ　ｇｒｏｕｐ　ｗｅｒｅ　ｃｏｌｌｅｃｔｅｄ　ｖｉａｔａｉｌ　ｖｅｉｎ　ａｎｄ　ｔｈｅ　ｐｌａｓｍ　ｗｅｒｅ　ｓｅｐａｒａｔｅｄ．Ａｎｄ　ｔｈｅｎ　ｗｅ　ｄｅｖｅｌｏｐｅｄ　ａｎｄ　ａｐｐｌｉｅｄ　ａ　ｇａｓ　ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙ－ｍａｓｓ　ｓｐｅｃｔｒｏｍｅｔｒｙ　ＧＣ－ＭＳ　ｍｅｔａｂｏｌｏｍｉｃｓ　ｐｒｏｔｏｃｏｌ　ｃｏｍｂｉｎｅｄ　ｗｉｔｈ　ｐａｔｔｅｒｎ　ｒｅｃｏｇｎｉｔｉｏｎ　ａｐｐｒｏａｃｈｅｓｔｏ　ｓｅａｒｃｈ　ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｌ　ｍｅｔａｂｏｌｉｔｅｓ　ｂｅｔｗｅｅｎ　ｔｈｅ　ｈｅａｔ　ｓｔｒｅｓｓ　ａｎｄ　ｒｅｃｏｖｅｒｙ　ｇｒｏｕｐｓ，ａｎｄ　ｔｈｅ　ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｌｍｅｔａｂｏｌｉｔｅｓ　ｗｅｒｅ　ａｎａｌｙｚｅｄ　ｂｙ　ＫＥＧＧ　ｆｏｒ　ｒｅｃｏｎｓｔｒｕｃｔｉｎｇ　ｔｈｅ　ｍｅｔａｂｏｌｉｃ　ｐａｔｈｗａｙ　ａｎｄ　ｆｕｎｃｔｉｏｎａｌａｎａｌｙｓｉｓ．８ｍｅｔａｂｏｌｉｔｅｓ　ｗｅｒｅ　ｓｅｌｅｃｔｅｄ　ａｓ　ｈｅａｔ　ｓｔｒｅｓｓ　ｐｏｔｅｎｔｉａｌ　ｂｉｏｍａｋｅｒｓ　ａｎｄ　ｉｎｄｅｎｔｉｆｉｅｄ．Ｔｈｅｓｅ　ｂｉｏ－ｍａｒｋｅｒｓ　ｉｎｃｌｕｄｅｄ　ａｌｐｈａ－ｌｉｎｏｌｅｎｉｃ　ａｃｉｄ，ｌｉｎｏｌｅｉｃ　ａｃｉｄ，ｌａｃｔａｔｅ，Ｄ－ｇｌｕｃｏｓｅ，ｇｌｙｃｅｒｏｌ，ｈｅｘａｄｅｃａｎｏｉｃ　ａｃｉｄ，ｇｌｙｃｏｃｈｏｌａｔｅ　ａｎｄβ－Ｈｙｄｒｏｘｙｂｕｔａｎｏａｔｅ．Ｔｈｅ　ｃｏｎｔｅｎｔ　ｏｆ　ｌａｃｔａｔｅ　ｉｎ　ｈｅａｔ　ｓｔｒｅｓｓ　ｓｔａｔｕｓ　ｉｎｃｒｅａｓｅｄ，ｔｈｅｏｔｈｅｒ　ｍｅｔａｂｏｌｉｔｅｓ　ｄｅｃｒｅａｓｅｄ．Ｆｕｎｃｔｉｏｎａｌ　ｐａｔｈｗａｙ　ａｎａｌｙｓｉｓ　ｒｅｖｅａｌｅｄ　ｔｈａｔ　ｈｅａｔ　ｓｔｒｅｓｓ　ａｇｇｒａｖａｔｅｄ　ｔｈｅｓｔａｔｅ　ｏｆ　ｅｎｅｒｇｙ　ｎｅｇａｔｉｖｅ　ｂａｌａｎｃｅ　ｉｎ　ｃｏｗ，ａｎｄ　ｔｈｅ　ｌａｃｔａｔｉｎｇ　ｄａｉｒｙ　ｃｏｗ　ｂｌｏｏｄ　ｍｅｔａｂｏｌｉｃａｌｌｙ　ｒｅｓｐｏｎｄｅｄｔｏ　ｈｅａｔ　ｓｔｒｅｓｓ　ｔｈｒｏｕｇｈ　ｉｎｃｒｅａｓｉｎｇβ－ｏｘｉｄａｔｉｏｎ　ｏｆ　ｆａｔｔｙ　ａｃｉｄ　ａｎｄ　ｇｌｙｃｅｒｏｌ　ｍｅｔａｂｏｌｉｃ　ａｎｄ　ｄｅｃｒｅａｓｉｎｇ　ｉｎｇｌｙｃｏｌｏｓｉｓ　ａｃｔｉｖｉｔｙ　ａｃｃｏｍｐａｎｉｅｄ　ｗｉｔｈ　ｌｉｖｅｒ　ｄｙｓｆｕｃｔｉｏｎ．Ｔｈｅ　ｓｔｕｄｙ　ｍａｙ　ｐｒｏｖｉｄｅ　ａ　ｓｔｒｏｎｇ　ｅｖｉｄｅｎｃｅ　ｆｏｒｆｕｒｔｈｅｒ　ｒｅｓｅａｒｃｈｉｎｇ　ｔｈｅ　ｐｈｙｓｉｏｌｏｇｉｃａｌ　ｍｅｃｈａｎｉｓｍ　ｏｆ　ｈｅａｔ　ｓｔｒｅｓｓ　ｃｏｗ．Ｋｅｙ　ｗｏｒｄｓ：ｈｅａｔ　ｓｔｒｅｓｓ；ｄａｒｉｙ　ｃｏｗｓ；ｍｅｔａｂｏｎｏｍｉｃｓ；ＧＣ－ＭＳ；ｂｌｏｏｄ　ｍｅｔａｂｏｌｉｔｅｓ收稿日期：２０１４－１１－１２基金项目：宁夏自然科学基金（ＮＺ１２１５１）作者简介：郭延生（１９７８－），男，甘肃庄浪人，博士，副教授，主要从事临床兽医学研究，Ｅ－ｍａｉｌ：ｇｕｏｙａｎｓｈｅｎｇ１９７８＠１６３．ｃｏｍ＊通信作者：陶金忠，副教授，Ｅ－ｍａｉｌ：ｔａｏ＿ｊｚ＠ｎｘｕ．ｅｄｕ．ｃｎ　８期郭延生等：基于ＧＣ－ＭＳ策略的奶牛热应激血液代谢组学研究 奶牛热应激是指奶牛受到超过本身体温调节能力的过高温度刺激时，引起机体发生的一系列异常反应。

为了适应热应激，奶牛开始动用物理、生化和生理过程进行调节，以维持热平衡和正常体温。

高产泌乳牛处于能量负平衡状态，而热应激时奶牛为了降低体内代谢热，本能的减少干物质采食量［１－２］，进一步加剧了高产泌乳牛的能量负平衡［３］。

大量研究表明，热应激时奶牛产奶量和繁殖性能显著降低与其血液代谢物变化和能量负平衡密切相关［４－９］。

因此检测血液内源性小分子物质代谢轮廓的变化有助于进一步揭示热应激引起奶牛泌乳性能和繁殖性能下降的生理机制。

但目前研究仅局限于对血液中某些有限的生理指标的检测，并且这些生理指标来自不同的试验和报道，缺乏整体系统的检测方法研究热应激奶牛血液生理指标的代谢轮廓。

代谢组学技术已应用于多种疾病生物标志物的挖掘和筛选中，它以生物体内小分子物质的动态规律变化来表征生物体的生理病理变化趋势，最终通过还原相关联生物事件提示生物体的病理生理变化实质和机制所在，其高通量的特性可以使体内同时出现的多个生理指标相互关联起来。

本研究采用ＧＣ－ＭＳ代谢组学技术，结合模式识别方法研究热应激对泌乳奶牛血液内源性代谢物的变化，以进一步阐明奶牛热应激的生理机制。

１　材料与方法１．１　仪器和试剂美国安捷伦６８９０Ｎ／５９７３Ｎ型ＧＣ－ＭＳ气质联用仪，梅特勒ＡＬ１０４电子分析天平，美国ＢＥＣＫ－ＭＡＮ公司ＯＰＴＩＭＥ　Ｌ－８０低温高速离心机。

吡啶、乙腈、二十二烷、正庚烷等均为分析纯（北京北化康泰临床试剂有限公司）；甲氧胺盐酸盐、Ｎ－甲基－三甲基硅烷－三氟乙酰胺（ＭＳＴＦＡ）：三甲基－氯硅烷（ＴＭＣＳ）＝１００∶１（瑞士Ｆｌｕｋａ公司）。

１．２　试验动物和样品采集试验奶牛来自宁夏某私人养殖场，在当地气候最炎热的月份（８月），连续检测该场的圈舍温度和湿度，以湿温指数作为评价该场奶牛是否出现热应激的条件。

根据奶牛热应激的判定标准，当圈舍湿度指数大于７２时，奶牛处于热应激状态。

据此标准１０头２～３胎，泌乳６０～９０ｄ的荷斯坦高产泌乳母牛被选为热应激组，检查试验牛直肠温度均高于３９℃，呼吸频率在９０～１２０次·ｍｉｎ－１。

用含肝素的采血管于尾静脉采血，３　０００ｒ·ｍｉｎ－１，４℃离心分离１０ｍｉｎ制备血浆，编号１～１０，于－８０℃冰箱保存。

次日０６：００上述奶牛直肠温度和呼吸频率恢复到正常范围，被再次视为恢复组采集血样，用同样方法制备血浆并保存，编号１１～２０。

１．３　血浆样品的衍生化将血浆样品从－８０℃取出，在室温条件下解冻，取其解冻后的样品１００μＬ放入离心管中，加入乙腈２５０μＬ以除去蛋白；在冰浴冷却的条件下超声１０ｍｉｎ，４℃离心机中以１０　０００ｒ·ｍｉｎ－１离心分离１０ｍｉｎ，离心后的样品取其上清液于１．５ｍＬ离心管中；将上清液放入４０℃条件下的真空干燥箱中使其挥发至干；取出干燥的离心管，加入１５ｍｇ·ｍＬ－１甲氧胺吡啶溶液５０μＬ使其充分混匀，再在７０℃条件下肟化１ｈ，加入ＭＳＴＦＡ：ＴＭＣＳ＝１００∶１硅烷化试剂５０μＬ，进行衍生化处理，充分混匀后静置１ｈ，而后加入含有二十二烷的正庚烷（内标，０．１ｍｇ·ｍＬ－１）１５０μＬ，使其充分混匀，于４℃１０　０００ｒ·ｍｉｎ－１离心１０ｍｉｎ［１０］，然后移取全部上清液于微量进样管中，以备ＧＣ－ＭＳ分析。

１．４　ＧＣ－ＭＳ分析ＧＣ－ＭＳ分析条件：进样量１μＬ，初始温度为８５℃，保持５ｍｉｎ，程序升温以１０℃·ｍｉｎ－１的速度上升至２８０℃，保持１０ｍｉｎ；进样口温度：２７０℃；接口温度：２７０℃；离子源（ＥＩ）温度：２３０℃；电离电压：７０ｅＶ；四极杆温度：１５０℃；载气（高纯氦气）：流速１．０ｍＬ·ｍｉｎ－１；扫描方式：全扫描６０～６００ｍ·ｚ－１。

色谱柱：ＯＶ－１７０１［１１］。

１．５　代谢组学数据分析从Ａｇｌｉｅｎｔ　６８９０Ｎ／５９７３Ｎ型ＧＣ－ＭＳ气质联用仪Ｃｈｅｍｓｔａｔｉｏｎ采集的信号和质谱数据以ＡＳＣＩＩ的文件的格式（＊．ｃｓｖ）输出，导出的原始数据采用Ｍａｔｌａｂ７．０软件对每一个峰进行校准并积分，积分后峰匹配后得到峰表，峰表由化学成分的保留时间和相应的峰面积组成。