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实验四聚丙烯酰胺凝胶电泳实验目的1.掌握聚丙烯酰胺凝胶电泳的原理及其应用范围；2.熟悉聚丙烯酰胺凝胶电泳相关缓冲液的配制方法。
实验原理1.聚丙烯酰胺凝胶简称为PAGE为网状结构，具有分子筛效应。
它有两种形式：非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳（Native-PAGE）及十二烷基硫酸钠——聚丙烯酰胺凝胶（SDS-PAGE）；2.非变性聚丙烯酰胺凝胶，在电泳的过程中，蛋白质能够保持完整状态，并依据蛋白质的分子量大小、蛋白质的形状及其所附带的电荷量而逐渐呈梯度分开。
而SDS-PAGE仅根据蛋白质亚基分子量的不同就可以分开蛋白质。
3.SDS是一种阴离子去污剂，具有变性和助溶特性，可按一定的比例和蛋白质分子结合成复合物，并打断蛋白质的氢键和疏水键，使蛋白质带负电荷的量远远超过其本身原有的电荷，使SDS蛋白质复合物在电泳时的迁移率，不再受原有电荷和分子形状的影响；4.SDS-PAGE可使蛋白质在Tris-甘氨酸(pH8.3)缓冲液中，通过电泳的方法分离不同分子量蛋白质或测定蛋白质分子量的实验技术。
实验步骤（一）相关溶液的制备1. 30%丙烯酰胺（Acr）：称Acr 29g，甲叉双丙烯酰胺（Bis）1g，加蒸馏水至100mL，过滤后置棕色瓶中，4℃贮存可用1-2月。
2. 10%SDS（十二烷基磺酸钠）：10g SDS 68℃助溶于纯水。
3. 1.5mol/L pH8.8 Tris-HCl缓冲液：称取Tris18.2g，加入50mL水，用1mol/L盐酸调pH8.8，最后用蒸馏水定容至100ml。
4. 1.0mol/LpH6.8Tris-HCl缓冲液：称取Tris12.1g，加入50mL水，用1mol/L盐酸调pH6.8，最后用蒸馏水定容至100mL5. 10%过硫酸铵(AP)6. TEMED（四甲基乙二胺）7. 2×样品溶解液：1.0mol/L Tris-HCl(pH6.8) 1mL，SDS200mg，β-巯基乙醇0.5mL （临用前加入，也可以200mmol/L二硫苏糖醇代替），溴酚蓝3mg，甘油2mL，最后定容至10mL。
非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳实验原理，步骤
和结果分析
一、实验原理
非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳是一种常用的蛋白质分离和纯化技术，其原理基于蛋白质在凝胶电泳过程中受到凝胶孔隙大小及电场力的影响而发生迁移分离。
在非变性条件下，蛋白质保持其原有的构象，通过电泳进行分离。
二、实验步骤
1. 制备凝胶：首先准备非变性聚丙烯酰胺凝胶，通常是通过聚丙烯酰胺单体聚合成凝胶板。
2. 样品加载：将待分离的蛋白样品混合添加载体缓冲液，并加热变性处理，然后加载到凝胶槽中。
3. 电泳分离：将已加载样品的凝胶槽浸入电泳缓冲液中，施加电场进行电泳分离，蛋白质根据其分子大小及电荷迁移至不同的位置，最终形成条带。
4. 凝胶染色：分离完成后，应用染色方法将蛋白质条带可视化。
5. 结果分析：根据蛋白质条带的迁移位置以及染色效果，分析样品中含有的蛋白种类及相对含量。
三、实验结果分析
通过非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳实验，我们可以获得样品中蛋白质的分子量信息，并进一步分析样品中可能存在的杂质及纯度。
在电泳过程中，蛋白质根据其分子大小在凝胶中迁移的速度不同，从而实现了蛋白质的分离。
根据蛋白质在凝胶上的位置，我们可以对样品进行定性和定量分析，从而获得关于样品组成和含量的重要信息。
综上所述，非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳是一种简单有效的蛋白质分离技术，广泛应用于生物学和生物化学研究中。
通过实验结果的分析和解读，可以更好地了解样品中蛋白质的组成及结构，为进一步的实验研究提供重要参考。
Native-PAGE实验方法非变性聚丙烯酰胺凝胶和变性sds-page电泳在操作上基本上是相同的，只是非变性聚丙烯酰胺凝胶的配制和电泳缓冲液中不能含有变性剂如SDS等。
一般蛋白进行非变性凝胶电泳要先分清是碱性还是酸性蛋白。
分离碱性蛋白时候，要利用低pH凝胶系统，分离酸性蛋白时候，要利用高pH凝胶系统。
酸性蛋白通常在非变性凝胶电泳中采用的pH是的缓冲系统，蛋白会带负电荷，蛋白会相阳极移动；而碱性蛋白通常电泳是在微酸性环境下进行，蛋白带正电荷，这时候需要将阴极和阳极倒置才可以电泳。
分离酸性蛋白工作液配制1. 40%胶贮液(Acr:Bis=29：1）；2. 4×分离胶Buf M Tris-HCl，pH ： g Trisbase 溶于80ml 水，用浓HCl调pH ，加水定容到10 0ml，4℃贮存；3. 4×堆积胶Buf M Tris-HCl，pH ：6 g Trisbase 溶于80ml 水，用浓HCl调pH ，加水定容到1 00ml，4℃贮存；4. 10×电泳Buf（ Tris-Gly）: g Trisbase， 144 g 甘氨酸，加水定容到1l ，4℃贮存；5. 2×溴酚蓝上样Buf: , Tris-Cl，甘油， % 溴酚蓝， dH2O； -20℃贮存；6. 10%APS；7. %考马斯亮蓝染色液:Coomassie red R-250 ，甲醇450ml，HAc 100ml, dH2O 450ml；8. 考马斯亮蓝脱色液: 100ml甲醇，100冰醋酸，800ml dH2O电泳胶的配制及电泳条件（上槽电极为负，下槽电极为正）1. 碱性非变性胶 17%分离胶(10 ml) 4%堆积胶(5 ml)2. 40%胶贮液(40%T,%C）3. 4×分离胶Buf M Tris-HCl，pH4. 4×堆积胶Buf M Tris-HCl，pH5. 水6. 10%APS 35 μl7. TEMED 15 μl8. 10×电泳Buf（ Tris-Gly）:100ml稀释到1L电泳条件 :100V恒压约20min，指示剂进入浓缩胶；改换160V恒压，当指示剂移动到胶板底部时，停止电泳，整个过程约80min。
聚丙烯酰胺凝胶电泳（英语：polyacrylamide gel electrophoresis，简称PAGE），是以聚丙烯酰胺凝胶作为支持介质的一种常用电泳技术，用于分离蛋白质和寡核苷酸。
作用原理：聚丙烯酰胺凝胶是具有分子筛作用的网络结构。
它有两种形式：非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳（Native-PAGE）和变性聚丙烯酰胺凝胶。
在蛋白质的非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳中，蛋白质可以保持完整的状态，并根据蛋白质的分子量，蛋白质的形状和附着的电荷量逐渐彼此分离。
在DNA的非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳中，DNA以双链状态游动，其迁移率受碱基组成和序列的影响。
在变性聚丙烯酰胺凝胶电泳中，变性剂通常为SDS（SDS-PAGE），变性剂通常为尿素和甲酰胺。
蛋白质的SDS-PAGE技术由Shapiro于1967年首次建立。
他们发现，蛋白质亚基的电泳迁移率主要取决于亚基的分子量（电荷因子可忽略不计），加入离子去污剂和强还原剂（SDS，十二烷基样品介质和丙烯酰胺凝胶。
SDS是一种阴离子洗涤剂。
作为变性剂和增溶剂，SDS可以破坏分子之间的氢键，展开分子并破坏蛋白质分子的二级和三级结构。
诸如巯基乙醇和二硫苏糖醇之类的强还原剂可以破坏半胱氨酸残基之间的二硫键。
将还原剂和SDS加入样品和凝胶后，分子解聚成多肽链。
解聚的氨基酸侧链与SDS结合形成蛋白质SDS胶束。
聚合物的负电荷远高于蛋白质的原始电荷，因此消除了不同分子之间的电荷和结构差异。
通常，不连续缓冲系统用于SDS-PAGE，其分辨率高于连续缓冲系统。
浓缩胶的作用是积聚，凝胶小，孔径大，将较薄的样品加入到增稠胶中，通过大孔胶的迁移作用将其浓缩到狭窄区域。
当选择Tris / HCl缓冲溶液作为样品溶液和浓缩凝胶时，选择Tris /甘氨酸作为电极溶液。
电泳开始时，HCl分解为氯离子，甘氨酸分解为甘氨酸离子。
蛋白质带负电荷，因此它们一起移动到正电极。
氯离子最快，甘氨酸离子最慢，蛋白质在中间。
Native-PAGE原理非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳(Native-PAGE)是在不加入SDS 疏基乙醇等变性剂的条件下，对保持活性的蛋白质进行聚丙烯酰胺凝胶电泳，常用于同工酶的鉴定和提纯。
未加SDS的天然聚丙烯酰胺凝胶电泳可以使生物大分子在电泳过程中保持其天然的形状和电荷，它们的分离是依据其电泳迁移率的不同和凝胶的分子筛作用，因而可以得到较高的分辨率，尤其是在电泳分离后仍能保持蛋白质和酶等生物大分子的生物活性，对于生物大分子的鉴定有重要意义，其方法是在凝胶上进行两份相同样品的电泳，电泳后将凝胶切成两半，一半用于活性染色，对某个特定的生物大分子进行鉴定，另一半用于所有样品的染色，以分析样品中各种生物大分子的种类和含量。
实验方法非变性聚丙烯酰胺凝胶和变性sds-page电泳在操作上基本上是相同的，只是非变性聚丙烯酰胺凝胶的配制和电泳缓冲液中不能含有变性剂如SDS等。
一般蛋白进行非变性凝胶电泳要先分清是碱性还是酸性蛋白。
分离碱性蛋白时候，要利用低pH凝胶系统，分离酸性蛋白时候，要利用高pH凝胶系统。
酸性蛋白通常在非变性凝胶电泳中采用的pH是8.8的缓冲系统，蛋白会带负电荷，蛋白会相阳极移动；而碱性蛋白通常电泳是在微酸性环境下进行，蛋白带正电荷，这时候需要将阴极和阳极倒置才可以电泳分离酸性蛋白。
工作液配制1.40%胶贮液(Acr:Bis=29：1）；2.4×分离胶Buf(1.5 M Tris-HCl，pH 8.8)：18.2 g Trisbase 溶于ml 水，用浓HCl调pH 8.8，加水定容到100ml，4℃贮存；3. 4×堆积胶Buf(0.5 M Tris-HCl，pH 6.8)：6g Trisbase 溶于80ml 水，用浓HCl调pH 6.8，加水定容到100ml，4℃贮存；4.10×电泳Buf（pH8.8 Tris-Gly）:30.3 g Trisbase，144g 甘氨酸，加水定容到L，4℃贮存；5.2×溴酚蓝上样Buf:1.25ml pH6.8, 0.5M Tris-Cl，3.0ml甘油，.2ml 0.5% 溴酚蓝，5.5ml dH2O；-20℃贮存；6. 10％APS；7. 0.25％考马斯亮蓝染色液:Coomassie blue R-250 2.5g，甲醇ml，HAc 100ml, dH2O 450ml；8.考马斯亮蓝脱色液:100ml甲醇，100冰醋酸，800ml dH2O电泳胶的配制及电泳条件（上槽电极为负，下槽电极为正）1. 碱性非变性胶17%分离胶(10 ml) 4%堆积胶(5 ml)2. 40%胶贮液(40%T,3.3%C）4.25ml 0.5ml3. 4×分离胶Buf(1.5 M Tris-HCl，pH 8.8)2.5ml4. 4×堆积胶Buf(0.5 M Tris-HCl，pH 6.8) 1.25ml5. 水3.2ml6. 10％APS 35ul7. TEMED 15 ul8. 10×电泳Buf（pH8.8 Tris-Gly）:100ml稀释到L电泳条件:100V恒压约20min，指示剂进入浓缩胶；改换160V恒压，当指示剂移动到胶板底部时，停止电泳，整个过程约80min。
Native-PAGE实验方法与问题及其解答主要内容：分离酸性蛋白步骤分离碱性蛋白步骤问题和解答步骤非变性聚丙烯酰胺凝胶和变性sds-page电泳在操作上基本上是相同的，只是非变性聚丙烯酰胺凝胶的配制和电泳缓冲液中不能含有变性剂如SDS等。
一般蛋白进行非变性凝胶电泳要先分清是碱性还是酸性蛋白。
分离碱性蛋白时候，要利用低pH凝胶系统，分离酸性蛋白时候，要利用高pH凝胶系统。
酸性蛋白通常在非变性凝胶电泳中采用的pH是8.8的缓冲系统，蛋白会带负电荷，蛋白会相阳极移动；而碱性蛋白通常电泳是在微酸性环境下进行，蛋白带正电荷，这时候需要将阴极和阳极倒置才可以电泳。
酸性蛋白通常在非变性凝胶电泳中采用的pH是8.8的缓冲系统，蛋白会带负电荷，蛋白会相阳极移动；而碱性蛋白通常电泳是在微酸性环境下进行，蛋白带正电荷，这时候需要将阴极和阳极倒置才可以电泳分离酸性蛋白。
分离酸性蛋白工作液配制1. 40%胶贮液(Acr:Bis=29：1）；2. 4×分离胶Buf(1.5 M Tris-HCl，pH 8.8)：18.2 g Trisbase 溶于80ml 水，用浓HCl调pH 8.8，加水定容到100ml，4℃贮存；3. 4×堆积胶Buf(0.5 M Tris-HCl，pH 6.8)：6 g Trisbase 溶于80ml 水，用浓HCl调pH 6.8，加水定容到100ml，4℃贮存；4. 10×电泳Buf（pH8.8 Tris-Gly）:30.3 g Trisbase，144 g 甘氨酸，加水定容到1l ，4℃贮存；5. 2×溴酚蓝上样Buf:1.25ml pH6.8, 0.5M Tris-Cl，3.0ml甘油，0.2ml 0.5% 溴酚蓝，5.5ml dH2O；-20℃贮存；6. 10%APS；7. 0.25%考马斯亮蓝染色液:Coomassie red R-250 2.5g，甲醇450ml，HAc 100ml, dH2O 450ml；8. 考马斯亮蓝脱色液: 100ml甲醇，100冰醋酸，800ml dH2O电泳胶的配制及电泳条件（上槽电极为负，下槽电极为正）1. 碱性非变性胶17%分离胶(10 ml) 4%堆积胶(5 ml)2. 40%胶贮液(40%T,3.3%C）4.25ml 0.5ml3. 4×分离胶Buf(1.5 M Tris-HCl，pH 8.8) 2.5ml4. 4×堆积胶Buf(0.5 M Tris-HCl，pH 6.8) 1.25ml5. 水 3.2ml6. 10%APS 35 μl7. TEMED 15 μl8. 10×电泳Buf（pH8.8 Tris-Gly）:100ml稀释到1L电泳条件:100V恒压约20min，指示剂进入浓缩胶；改换160V 恒压，当指示剂移动到胶板底部时，停止电泳，整个过程约80min。
聚丙烯酰氨凝胶电泳一简介作用原理：聚丙烯酰胺凝胶为网状结构，具有分子筛效应。
它有两种形式：非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳（Native-PAGE）及SDS-聚丙烯酰胺凝胶（SDS-PAGE）；非变性聚丙烯酰胺凝胶，在电泳的过程中，蛋白质能够保持完整状态，并依据蛋白质的分子量大小、蛋白质的形状及其所附带的电荷量而逐渐呈梯度分开。
而SDS-PAGE仅根据蛋白质亚基分子量的不同就可以分开蛋白质。
该技术最初由shapiro 于1967年建立，他们发现在样品介质和丙烯酰胺凝胶中加入离子去污剂和强还原剂（SDS即十二烷基磺酸钠）后，蛋白质亚基的电泳迁移率主要取决于亚基分子量的大小（可以忽略电荷因素）。
二作用SDS是阴离子去污剂，作为变性剂和助溶试剂，它能断裂分子内和分子间的氢键，使分子去折叠，破坏蛋白分子的二、三级结构。
而强还原剂如巯基乙醇，二硫苏糖醇(DTT)能使半胱氨酸残基间的二硫键断裂。
在样品和凝胶中加入还原剂和SDS后，分子被解聚成多肽链，解聚后的氨基酸侧链和SDS结合成蛋白- SDS胶束，所带的负电荷大大超过了蛋白原有的电荷量，这样就消除了不同分子间的电荷差异和结构差异。
SDS-PAGE一般采用的是不连续缓冲系统，与连续缓冲系统相比，能够有较高的分辨率。
浓缩胶的作用是有堆积作用，凝胶浓度较小，孔径较大，把较稀的样品加在浓缩胶上，经过大孔径凝胶的迁移作用而被浓缩至一个狭窄的区带。
当样品液和浓缩胶选TRIS/HCl缓冲液，电极液选TRIS/甘氨酸。
电泳开始后，HCl解离成氯离子，甘氨酸解离出少量的甘氨酸根离子。
蛋白质带负电荷，因此一起向正极移动，其中氯离子最快，甘氨酸根离子最慢，蛋白居中。
电泳开始时氯离子泳动率最大，超过蛋白，因此在后面形成低电导区，而电场强度与低电导区成反比，因而产生较高的电场强度，使蛋白和甘氨酸根离子迅速移动，形成以稳定的界面，使蛋白聚集在移动界面附近，浓缩成一中间层。
此鉴定方法中，蛋白质的迁移率主要取决于它的相对分子质量，而与所带电荷和分子形状无关。
Native-PAGE实验方法与问题及其解答主要内容：分离酸性蛋白步骤分离碱性蛋白步骤问题和解答步骤非变性聚丙烯酰胺凝胶和变性sds-page电泳在操作上基本上是相同的，只是非变性聚丙烯酰胺凝胶的配制和电泳缓冲液中不能含有变性剂如SDS等。
一般蛋白进行非变性凝胶电泳要先分清是碱性还是酸性蛋白。
分离碱性蛋白时候，要利用低pH凝胶系统，分离酸性蛋白时候，要利用高pH凝胶系统。
酸性蛋白通常在非变性凝胶电泳中采用的pH是8.8的缓冲系统，蛋白会带负电荷，蛋白会相阳极移动；而碱性蛋白通常电泳是在微酸性环境下进行，蛋白带正电荷，这时候需要将阴极和阳极倒置才可以电泳。
酸性蛋白通常在非变性凝胶电泳中采用的pH是8.8的缓冲系统，蛋白会带负电荷，蛋白会相阳极移动；而碱性蛋白通常电泳是在微酸性环境下进行，蛋白带正电荷，这时候需要将阴极和阳极倒置才可以电泳分离酸性蛋白。
分离酸性蛋白工作液配制1. 40%胶贮液(Acr:Bis=29：1）；2. 4×分离胶 Buf(1.5 M Tris-HCl ，pH 8.8)：18.2 g Trisbase溶于 80ml 水，用浓 HCl 调 pH 8.8，加水定容到 100ml ，4℃ 贮存；3. 4×堆积胶 Buf(0.5 M Tris-HCl ，pH 6.8)：6 g Trisbase 溶于 80ml 水，用浓 HCl 调 pH 6.8，加水定容到 100ml ，4℃ 贮存；4. 10×电泳 Buf （pH8.8 Tris-Gly ）:30.3 g Trisbase ， 144 g 甘氨酸，加水定容到 1l ，4℃ 贮存；5. 2×溴酚蓝上样 Buf:1.25ml pH6.8, 0.5M Tris-Cl ，3.0ml 甘油， 0.2ml 0.5% 溴酚蓝，5.5ml dH 2 O ； -20℃贮存；6. 10%APS ；7. 0.25%考马斯亮蓝染色液:Coomassie red R-250 2.5g ，甲醇 450ml ，HAc 100ml, dH 2O 450ml ；8. 考马斯亮蓝脱色液: 100ml 甲醇，100 冰醋酸，800ml dH 电泳胶的配制及电泳条件（上槽电极为负，下槽电极为正） 1. 碱性非变性胶17%分离胶(10 ml) 4%堆积胶(5 ml)2. 40%胶贮液(40%T,3.3%C ）4.25ml 0.5ml3. 4×分离胶 Buf(1.5 M Tris-HCl ，pH 8.8) 2.5ml4. 4×堆积胶 Buf(0.5 M Tris-HCl ，pH 6.8)1.25ml5. 水3.2ml6. 10%APS 35 μl7. TEMED 15 μl8. 10×电泳 Buf （pH8.8 Tris-Gly ）:100ml 稀释到 1L2 O电泳条件 :100V 恒压约 20min ，指示剂进入浓缩胶；改换160V 恒压，当指示剂移动到胶板底部时，停止电泳，整个过程约 80min 。
非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳(Native-PAGE)原理、方法步骤与常见问题分析[转]2009-12-09 20:27Native-PAGE原理非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳(Native-PAGE)是在不加入SDS 疏基乙醇等变性剂的条件下，对保持活性的蛋白质进行聚丙烯酰胺凝胶电泳，常用于同工酶的鉴定和提纯。
未加SDS的天然聚丙烯酰胺凝胶电泳可以使生物大分子在电泳过程中保持其天然的形状和电荷，它们的分离是依据其电泳迁移率的不同和凝胶的分子筛作用，因而可以得到较高的分辨率，尤其是在电泳分离后仍能保持蛋白质和酶等生物大分子的生物活性，对于生物大分子的鉴定有重要意义，其方法是在凝胶上进行两份相同样品的电泳，电泳后将凝胶切成两半，一半用于活性染色，对某个特定的生物大分子进行鉴定，另一半用于所有样品的染色，以分析样品中各种生物大分子的种类和含量。
实验方法非变性聚丙烯酰胺凝胶和变性sds-page电泳在操作上基本上是相同的，只是非变性聚丙烯酰胺凝胶的配制和电泳缓冲液中不能含有变性剂如SDS等。
一般蛋白进行非变性凝胶电泳要先分清是碱性还是酸性蛋白。
分离碱性蛋白时候，要利用低pH凝胶系统，分离酸性蛋白时候，要利用高pH凝胶系统。
酸性蛋白通常在非变性凝胶电泳中采用的pH是8.8的缓冲系统，蛋白会带负电荷，蛋白会相阳极移动；而碱性蛋白通常电泳是在微酸性环境下进行，蛋白带正电荷，这时候需要将阴极和阳极倒置才可以电泳分离酸性蛋白。
工作液配制1.40%胶贮液(Acr:Bis=29：1）；2.4×分离胶Buf(1.5 M Tris-HCl，pH 8.8)：18.2 g Trisbase 溶于ml 水，用浓HCl调pH 8.8，加水定容到100ml，4℃贮存；3. 4×堆积胶Buf(0.5 M Tris-HCl，pH 6.8)：6g Trisbase 溶于80ml 水，用浓HCl调pH 6.8，加水定容到100ml，4℃贮存；4.10×电泳Buf（pH8.8 Tris-Gly）:30.3 g Trisbase，144g 甘氨酸，加水定容到L，4℃贮存；5.2×溴酚蓝上样Buf:1.25ml pH6.8, 0.5M Tris-Cl，3.0ml甘油，.2ml 0.5% 溴酚蓝，5.5ml dH2O；-20℃贮存；6. 10％APS；7. 0.25％考马斯亮蓝染色液:Coomassie blue R-250 2.5g，甲醇450ml，HAc 100ml, dH2O 450ml；8.考马斯亮蓝脱色液:100ml甲醇，100冰醋酸，800ml dH2O电泳胶的配制及电泳条件（上槽电极为负，下槽电极为正）1. 碱性非变性胶17%分离胶(10 ml) 4%堆积胶(5 ml)2. 40%胶贮液(40%T,3.3%C）4.25ml 0.5ml3. 4×分离胶Buf(1.5 M Tris-HCl，pH 8.8)2.5ml4. 4×堆积胶Buf(0.5 M Tris-HCl，pH 6.8) 1.25ml5. 水3.2ml6. 10％APS 35ul7. TEMED 15 ul8. 10×电泳Buf（pH8.8 Tris-Gly）:100ml稀释到L电泳条件:100V恒压约20min，指示剂进入浓缩胶；改换160V恒压，当指示剂移动到胶板底部时，停止电泳，整个过程约80min。
非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳(Native-PAGE)原理、方法步骤与常见问题分析[转] 2009-12-09 20:27Native-PAGE原理非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳(Native-PAGE)是在不加入SDS 疏基乙醇等变性剂的条件下，对保持活性的蛋白质进行聚丙烯酰胺凝胶电泳，常用于同工酶的鉴定和提纯。
未加SDS的天然聚丙烯酰胺凝胶电泳可以使生物大分子在电泳过程中保持其天然的形状和电荷，它们的分离是依据其电泳迁移率的不同和凝胶的分子筛作用，因而可以得到较高的分辨率，尤其是在电泳分离后仍能保持蛋白质和酶等生物大分子的生物活性，对于生物大分子的鉴定有重要意义，其方法是在凝胶上进行两份相同样品的电泳，电泳后将凝胶切成两半，一半用于活性染色，对某个特定的生物大分子进行鉴定，另一半用于所有样品的染色，以分析样品中各种生物大分子的种类和含量。
实验方法非变性聚丙烯酰胺凝胶和变性sds-page电泳在操作上基本上是相同的，只是非变性聚丙烯酰胺凝胶的配制和电泳缓冲液中不能含有变性剂如SDS等。
一般蛋白进行非变性凝胶电泳要先分清是碱性还是酸性蛋白。
分离碱性蛋白时候，要利用低pH凝胶系统，分离酸性蛋白时候，要利用高pH凝胶系统。
酸性蛋白通常在非变性凝胶电泳中采用的pH是8.8的缓冲系统，蛋白会带负电荷，蛋白会相阳极移动；而碱性蛋白通常电泳是在微酸性环境下进行，蛋白带正电荷，这时候需要将阴极和阳极倒置才可以电泳分离酸性蛋白。
工作液配制1.40%胶贮液(Acr:Bis=29：1）；2.4×分离胶Buf(1.5 M Tris-HCl，pH 8.8)：18.2 g Trisbase 溶于ml 水，用浓HCl调pH 8.8，加水定容到100ml，4℃贮存；3. 4×堆积胶Buf(0.5 M Tris-HCl，pH 6.8)：6g Trisbase 溶于80ml 水，用浓HCl调pH 6.8，加水定容到100ml，4℃贮存；4.10×电泳Buf（pH8.8 Tris-Gly）:30.3 g Trisbase， 144g 甘氨酸，加水定容到L，4℃贮存；5.2×溴酚蓝上样Buf:1.25ml pH6.8, 0.5M Tris-Cl，3.0ml甘油，.2ml 0.5% 溴酚蓝，5.5ml dH2O； -20℃贮存；6. 10％APS；7. 0.25％考马斯亮蓝染色液:Coomassie blue R-250 2.5g，甲醇ml，HAc 100ml, dH2O 450ml；8.考马斯亮蓝脱色液:100ml甲醇，100冰醋酸，800ml dH2O电泳胶的配制及电泳条件（上槽电极为负，下槽电极为正）1. 碱性非变性胶 17%分离胶(10 ml) 4%堆积胶(5 ml)2. 40%胶贮液(40%T,3.3%C）4.25ml 0.5ml3. 4×分离胶Buf(1.5 M Tris-HCl，pH 8.8)2.5ml4. 4×堆积胶Buf(0.5 M Tris-HCl，pH 6.8) 1.25ml5. 水 3.2ml6. 10％APS 35ul7. TEMED 15 ul8. 10×电泳Buf（pH8.8 Tris-Gly）:100ml稀释到L电泳条件:100V恒压约20min，指示剂进入浓缩胶；改换160V恒压，当指示剂移动到胶板底部时，停止电泳，整个过程约80min。
非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳(Native-PAGE)的分类有三种常用的非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳方法：blue native（BN-PAGE），clear native （CN-PAGE），quantitative preparative native continuous（QPNC-PAGE）。
在一个典型的native PAGE方法中，复合物被CN-PAGE或BN-PAGE分离。
然后可以用其它分离方法如SDS-PAGE或等电聚焦做进一步分离。
随后切割凝胶，蛋白复合物每一个部分都被分开。
蛋白的每个条带可以消化后做肽链指纹图谱或重新测序。
这样就可以提供一个蛋白复合物中单个蛋白的重要信息。
1. Blue Native PAGEBlue Native PAGE是最古老的Native-PAGE技术。
是以考马斯亮蓝作为电泳分离后蛋白质鉴定染料的一种电泳方法。
这种方法的缺点是：考马斯亮蓝与蛋白的结合起到了去垢剂的作用，可能导致复合物的分离；并对化学发光或蛋白质辅基的荧光或荧光染料的标记具有潜在的猝灭作用。
Blue Native PAGE在分析蛋白质-蛋白质相互作用以及膜蛋白复合物方面有很大的优势，其分离范围在100KDa-10MDa。
在Blue native PAGE过程中，最重要的化合物就是考马斯亮蓝，除了增溶作用以外，蛋白质表面结合了大量的考马斯亮蓝染料而带上负电荷，这会导致即使碱性蛋白在pH7.5条件下也会向阴极迁移。
但是，蛋白质虽然带有大量的负电荷，然而其分离依据的根本还是根据不连续的凝胶梯度-凝胶孔径的逐渐减小，蛋白质最终迁移到其自身大小与凝胶孔径相近似的位置而停止。
并且在分离膜蛋白的过程中，由于带有负电荷，而不会引起蛋白聚合，与酸性染料的结合，膜蛋白也由疏水性变成亲水性，溶解性大大提高。
1.2 Clear Native PAGEClear Native PAGE是通过除染色以的其它方法如SLS鉴定蛋白的电泳技术。
然而，这种方法最大的应用还是研究蛋白质-蛋白质相互作用，特别是和质谱联用。
Clear Native PAGE是在聚丙烯酰胺凝胶中分离酸性水溶性蛋白和膜蛋白（PI<7）的电泳技术，分辨率通常比BN-PAGE低。
迁移距离决定于蛋白的固有电荷和凝胶孔径大小。
因此，BN-PAGE比CN-PAGE应用更广泛。
然而CN-PAGE在考马斯染料分析天然混合物干扰进一步分析时存在着优势。
如测定催化活性（例如线粒体ATP合酶）或分离用于荧光共振能量分析的微量膜蛋白，CN-PAGE比BN-PAGE更温和，特别是使用洋地黄皂苷时，CN-PAGE 可以保持膜蛋白的超分子组合体的结构而BN-PAGE会导致分解。
线粒体ATP合酶中的具有酶活性的低聚物可以用CN-PAGE检出，但BN-PAGE无法检出。
CN-PAGE起源于无色非变性PAGE，是BN- PAGE之后出现的技术。
既然CN-PAGE中没有带电荷的染料，蛋白在电场中的迁移完全取决于这个蛋白的固有电荷。
大分子和低聚蛋白必须有合适的物理参数才能在CN-PAGE中分开，特别是PI低于5.4，分辨率低。
由此看来，CN-PAGE除了获得未染色的蛋白以外在分析膜蛋白中没有什么优势了。
优点是条件更温和，在蛋白质组学研究中具有更大优势。
BN-PAGE和CN-PAGE的缓冲液和电泳条件一致，但是CN-PAGE的阴极缓冲液中不含考马斯染料，而是将0.025%的洋地黄皂苷加入到凝胶中。
1.3 QPNC-PAGEQPNC-PAGE（quantitative preparative native continuous polyacrylamide gel electrophoresis）是一种应用于生物化学和生物有机化学的根据等电点分离蛋白的高分辨技术。
这种凝胶电泳被生物学家应用于独立活性或天然金属蛋白样品或正确或非正确折叠的可溶性的与金属辅助因子结合的蛋白混合物的鉴定。
1.3.1电泳缓冲液QPNC-PAGE是在特殊的装置里进行的分离生物活性分子的电泳过程。
在特殊的电泳缓冲系统（基于Tris-HCl和NaN3）中，一个生物系统中的大多数蛋白都会带电荷，在电场的正负极之间迁移。
尽管PH（10.00）的电泳缓冲液并不与细胞或组织中的生理PH相符，但是在生理PH（8.00）的缓冲体系下蛋白会连续洗脱并分成不同的部分。
分离系统包括电泳槽和分部收集器，这些装置要置于冰箱中。
1.3.2凝胶特征为了得到一个PAGE所需的聚合完全的凝胶，聚丙烯酰胺凝胶需要在室温下凝聚69hr。
最后，得到均质的含机械稳定和自由的单体或原子。
凝胶的孔径很大，因此分子筛作用在电泳分离中最小化。
基于上述原因，凝胶和活性分子之间的相互作用可以忽略。
待分离的金属蛋白（如金属分子伴侣，蛋白酶感染性初级因子，金属运输蛋白，淀粉状蛋白，金属酶，金属肽等）不会分解成脱辅蛋白和金属辅助因子。
孤立蛋白的生物活性结构（天然或3D构象）在QPNC-PAGE后不会发生构象变化。
所以，金属蛋白和蛋白异构体在PAGE中被定量的分成高纯度的部分。
QPNC与其它电泳技术如SDS-PAGE，2-DE，等速电泳和CN- PAGE 等相比被称为“突破性的方法”。
1.3.3 实验方法（1）储备液1）200mM Tris-HCl 10mM NaN3 PH10.00，室温2）200mM Tris-HCl 10mM NaN3 PH8.00，室温3）40%丙烯酰胺/双丙烯酰胺2.67C，4℃（新鲜）（2）电泳缓冲液20mM Tris-HCl 1mMNaN3 PH10.00（除气），4℃电泳槽上部：500ml电泳缓冲液电泳槽下部：2000ml电泳缓冲液（3）洗脱液20mM Tris-HCl 1mMNaN3 PH8.00（除气），4℃洗脱室：700ml洗脱缓冲液（4）分离胶丙烯酰胺4%T 体积40ml成分：4ml40%丙烯酰胺/双丙烯酰胺2.67C4ml 200mM Tris-HCl 10mM NaN3 PH10.0032 mL H2O200 μL 10% APS20 μL TEMEDAPS和TEMED最后加入。
轻轻搅拌烧瓶中的混合物，注意不能产生气泡。
然后把溶液移入内径为28mm，长为40mm有刻度的玻璃柱中。
加入3ml正丙醇。
60分钟聚合后用电泳缓冲液冲洗凝胶，然后用4ml电泳缓冲液覆盖凝胶表面。
在室温下凝集69小时。
（5）样品的准备和收集保持样品（生物液体）温度为4℃。
0.3ml甘油和2.7ml样品在分离前混合5分钟。
然后把处理好的样品加入到电泳缓冲液的上层。
这些蛋白在此电泳缓冲液中不是带负电（PI<10.0）就是带负电（PI>10.0），因此在电场中不是从正极迁移到负极就是从负极迁移到正极。
已分离的蛋白分子用特殊的生理洗脱液连续洗脱，并用分部收集器收集。
整个分离系统必须在4℃冰箱中进行。
纯化的，半纯化的和未处理的样品都可以用于QPNC。
样品分离纯化中应该避免类似于蛋白质沉淀等过程以防止蛋白变性。
化学稳定的金属蛋白可以用非变性的凝胶渗透层析来进行进一步纯化。
1.3.4 定量和鉴定Fe，Cu，Zn，Ni，Mo，Pd，Co，Mn，Pt，Cr，Cd和其它金属辅因子可以通过ICP-MS（Inductively coupled plasma mass spectroscopy，电感耦合等离子体质谱）来定性和定量。
因为PAGE条带的高纯度和选择性凝集，相关的结构可以用非变性条件下的NMR来分析。
1.3.5 应用QPNC的应用对象为分子量6-200kDa的酸性、碱性和中性金属蛋白。
在测定血液或其它临床样品中独立的金属蛋白结构和功能关系方面具有重要应用，因为不正确的金属陪伴蛋白的折叠。
例如超氧化物歧化酶（SOD）的铜陪伴蛋白出现在这些基质中或许预示着神经病变疾病如肌萎侧索硬化病等。
QPNC-PAGE，SEC，ICP-MS和NMR等技术的连用可以得到病人或潜在的病人液体基质中相关金属蛋白的生理状态的结构。
这一技术可以提高蛋白错折叠相关疾病的诊断和治疗水平。
非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳(Native-PAGE)原理、方法步骤与常见问题分析分离碱性蛋白要用低pH凝胶系统，并使用以下缓冲液体系：1. 分离胶：0.06M KOH，0.376M Ac，pH4.3（7.7% T，2.67% C）；2. 堆积胶：0.06M KOH，0.063M Ac，pH6.8（3.125% T，25% C）；3. 电泳缓冲液：0.14M 2-丙氨酸，0.35M Ac，pH4.5将正负电极倒置，用甲基绿（0.002%）为示踪剂实验操作同分离酸性蛋白。
回收native-PAGE结束以后，采用电泳的方法进行回收，方法如下：电泳结束以后，切取部分染色，然后根据染色结果切取含有蛋白质的胶带装入处理过的透析袋中，加入适量的缓冲液，最后把透析袋放入普通的核酸电泳槽中，并在电泳槽中加入适量的缓冲液（和透析袋中的缓冲液相同），低温电泳2-3小时即可。
回收蛋白所用的缓冲液一般和电泳所用的缓冲液相同。
SDS-PAGE和Native-PAGE的比较非变性凝胶电泳，也称为天然凝胶电泳，与非变性凝胶电泳最大的区别就在于蛋白在电泳过程中和电泳后都不会变性。
最主要的有以下几点：1. 凝胶的配置中非变性凝胶不能加入SDS，而变性凝胶的有SDS。
2. 电泳载样缓冲液中非变性凝胶的不仅没有SDS，也没有巯基乙醇。
3. 在非变性凝胶中蛋白质的分离取决于它所带的电荷以及分子大小，不像SDS-PAGE电泳中蛋白质分离只与其分子量有关。
4. 非变性凝胶电泳中，酸性蛋白和碱性蛋白的分离是完全不同的，不像SDS-PAGE中所有蛋白都朝正极泳动。
非变性凝胶电泳中碱性蛋白通常是在微酸性环境下进行，蛋白带正电荷，需要将阴极和阳极倒置才可以电泳。
5. 因为是非变性凝胶电泳，所有的电泳时候电流不能太大，以免电泳时产生的热量太多导致蛋白变性，而且步骤都要在0-4度的条件下进行，这样才可以保持蛋白质的活性，也可以降低蛋白质的水解作用。
这点跟变性电泳也不一样。
所以与SDS-PAGE电泳相比，非变性凝胶大大降低了蛋白质变性发生的机率问题和解答1. 非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳时预电泳是怎么回事的？预电泳时要加6×DNA上样缓冲液吗？电泳1－2小时再加结合反应产物吗？预电泳是除去凝胶中没有聚合的单体和双体和聚合引发剂，提高分辨率，不加任何物质，一般３０－６０分钟后加样电泳。
现在大家都是做SDS-PAGE或者双向电泳比较多，而做非变性电泳的似乎少一些。
而我本人接触非变形电泳较多，一直认为它还是很有特点的，能够有很多独特应用之处的，所以在此结合我本人经历向大家介绍一下非变性电泳。
非变性电泳，蛋白质在电泳过程中是处于非变性的，电泳时蛋白的迁移率取决于蛋白的电荷和分子量，非变性电泳在完成电泳后，可以进行蛋白质活性测定（如果是酶的话，可以进行酶活检测）或者检测同功酶，或含亚基的完整蛋白的分子量，这些特点是SDS-PAGE所不具备的，因为像SDS-PAGE使蛋白变性，亚基解离，无法体现含有亚基的蛋白的真实分子量，也无法进行后续的蛋白活性检测了。
