人鼠嵌合抗体名词解释

什么是抗体人源化目前，用细胞工程制备人单抗在技术上和伦理上都存在一些难题，治疗性抗体的开发就集中在具有治疗前景的鼠源单抗上。

但是鼠源单抗对人体具有异源性反应，可诱发人抗鼠抗体效应（Human anti-mouse antibodies, HAMA反应），使得单抗的治疗效果明显滞后。

随着基因重组技术的发展和人们对抗体结构认识的深入，研究者们尝试对鼠源性抗体进行改造，致力于在保留与抗原结合的高亲和力的基础上，减少异源性抗体的免疫原性，推动抗体人源化研发的进程。

人源化抗体主要指以用基因克隆及DNA重组技术对鼠源单克隆抗体改造，重新表达产生的抗体。

其大部分氨基酸序列被人源序列取代，基本保留亲本鼠单克隆抗体的亲和力和特异性，又降低了其异源性，有利应用于人体。

嵌合抗体和CDR移植抗体根据人源化程度不同，单抗又可分为嵌合抗体（60%-70%人源化氨基酸序列）和CDR(complementarity-determining region)移植抗体（90%-95%人源化氨基酸序列）。

1、人-鼠嵌合抗体人-鼠嵌合抗体（chimeric antibody）：第一代人源化抗体。

其是在基因水平上将鼠源单克隆抗体的V区和人抗体的C区(variable region, 可变区)连接，在合适的宿主细胞内表达可得到人-鼠嵌合抗体。

嵌合抗体用于人体所产生的HAMA反应比鼠源单抗明显减弱；另外，人源C区(constant region，恒定区)可更有效地介导人体一些免疫反应，如CDC（complement-dependent cytotoxicity, CDC, 依赖补体的细胞毒性作用），ADCC（antibody dependent cell mediated cytotoxicity, 抗体依赖的细胞介导的细胞毒性作用）。

2、CDR移植抗体嵌合抗体虽然可以部分解决异种蛋白的排斥问题，但由于其还含有鼠源V区，依然有可能会诱发HAMA反应，干扰抗体疗效，诱发超敏反应，在临床上其应用会受到一定限制。

蛋白质工程一、名词解释：1.蛋白质工程:是研究蛋白质结构和定点改造蛋白质结构的一门学科。

它运用基因工程手段，通过有控制的基因修饰和基因合成，对现有蛋白质进行定向改造，以期获得性能更加优良、更符合人类社会需要的蛋白质分子。

2. 抗体:指机体的免疫系统在抗原刺激下产生的可与相应抗原发生特异性结合的免疫球蛋白。

3. 人-鼠嵌合抗体：用鼠可变区和人恒定区融合形成的抗体。

4.人源化抗体：将鼠杂交瘤抗体的超变区嫁接到人抗体上形成的抗体。

5. 一级结构：是多肽链中氨基酸残基从N-末端到C-末端的排列顺序及二硫键的位置。

6.二级结构：是指多肽链主链借助氢键排列成特有的规则的反复构象。

7.超二级结构（结构模体）：一级顺序上相邻的二级结构在三维折叠中，彼此靠近、按特定的几何排布形成排列规则的、在空间结构上可以辨认的、可以同一结构模式出现在不同蛋白质中的二级结构组合体，称为结构模体。

8.发夹式β模体（或ββ组合单位）：两段相邻的反平行β链被一环链连接在一起构成的组合单位，其形貌与发夹相似，称为发夹式β模体。

9.希腊钥匙模体：四段紧邻的反平行β链以特定的方式来回往复组合，其形貌类似于古希腊钥匙上特有的回形装饰纹，故称为希腊钥匙型模体。

11.结构域：二级结构和结构模体以特定的方式组织连接，在蛋白质分子中形成两个或多个在空间上可以明显区分的三级折叠实体，称为结构域。

12.三级结构：在二级结构、结构模体的基础上，进一步盘曲、折叠形成的，涉及主链、侧链在内的所有原子和基团的空间排布。

13.四级结构：是指在多条肽链组成的一个蛋白质分子中，各亚单位在寡聚蛋白质中的空间排布及亚单位间的互相作用。

14.优势构象：任何氨基酸侧链中的组成基团都可以绕着其间的C-C单键旋转，从而产生各种不同的构象。

AA分子的各种构象异构体并不是平均分布的, 总是以其最稳定的构象为重要的存在形式即为优势构象。

15.交错构象：是能量上最有利的排布，在这种构象中，一个碳原子的取代基正好处在另一个碳原子的两个取代基之间。

人鼠嵌合抗体人鼠嵌合抗体特点（1）既保留了亲本鼠抗体的高特异性和亲和力，又使鼠源性成分减少70%左右；（2）其人源Fc段能有效介导生物学效应功能，如抗体依赖性细胞介导的细胞毒作用（ADCC）、补体依赖性细胞毒作用（CDC）等；（3）能自由地选择抗体的型、亚型、类、亚类、大小、结构域及添加糖基化位点等，以利用其不同的生物学特点及理化特性；（4）由高效真核表达载体和人抗体恒定区组成的嵌合抗体表达“盒子”可以容许插入不同的鼠单克隆抗体的可变区，缩短操作和研制周期；（5）操作相对简单。

技术与方法1.可变区基因克隆RNA提取及反转录取对数生长期的杂交瘤细胞株（约107个细胞），按照Trizol RNA提取试剂盒的说明书抽提细胞的总RNA，再进行RT-PCR扩增，回收纯化扩增产物备用。

扩增轻链、重链的V区基因根据Orlandi等（1989）设计的扩增小鼠可变区基因的引物，以上述扩增产物为模板扩增抗体基因的可变区。

回收重链VH(约360bp)、轻链VL（约330bp）片段，插入T-easy载体，各送3份样品测序。

测序所得序列在GeneBank核酸数据库中进行分类及同源性分析。

两端加入酶切位点根据上述PCR产物序列设计含酶切位点的引物，再次进行扩增，以使抗体可变区基因片段具有与载体相吻合的酶切位点，便于插入表达载体。

回收纯化扩增产物备用。

2.嵌合抗体表达载体构建改造含信号肽及人工Ig重链和轻链C区基因片段的单克隆位点（1）设计含重链信号肽起始位点序列及酶切位点Nhe I的上游引物HLF(KOZAK+4G，即GCCGCCATGG),和含Xho I工位点的下游引物HLR，以质粒pAc-κ-CH3为模板，扩增出重链信号肽基因片段；（2）设计含Xho I和Kpn I位点上游引物HCF,和含Furin(RKRR)序列及酶切位点Xba I 的下游引物HCR，以质粒pAc-κ-CH3为模板，扩增出重链恒定区基因片段；用Xho I 连接上述片段得到含重链信号肽、MCS及重链恒定区的基因片段；（3）设计含酶切位点Apa I的上游引物LLF,和含EcoR I位点的下游引物LLR,以质粒pAc-κ-CH3为模板，扩增出轻链信号肽基因片段；（4）设计含EcoR I和Hind III位点上游引物LCF,和含Pme I的下游引物LCR，以质粒pAc-κ-CH3为模板，扩增出轻链恒定区基因片段；用EcoR I连接上述片段得到含轻链信号肽、MCS及轻链恒定区的基因片段。

生物制药复习题（有答案）《生物技术制药》习题（课后作业）一、下列概念：⑴生物制药：⑵生物药物：包括生物技术药物，天然生化药物，微生物药物，海洋药物和生物制品。

(3)生物技术制药：采用现代生物技术,借助某些微生物、植物、动物生产医药品。

(4)生物技术药物：采用DNA重组技术或其他生物新技术研制的蛋白质或核酸类药物。

（5）现代生物技术：以现代生命科学为基础, 把生物体系与工程学技术有机结合在一起，按照预先的设计，定向地在不同水平上改造生物遗传性状或加工生物原料, 产生对人类有用的新产品(或达到某种目的)之综合性科学技术。

（6）基因表达：⒈转录：在RNA聚合酶的催化下以DNA为模板合成mRNA的过程。

2、翻译：以mRNA为模板,tRNA作为运载工具,将活化的氨基酸在核糖体上合成蛋白质的过程（7）质粒的分裂不稳定：基因工程菌分裂时产生一定比例不含质粒的子代菌的现象,即重组分子从受体细胞中逃逸。

（8）质粒的结构不稳定：DNA从质粒上丢失或碱基重排、缺失所致工程菌性能的改变。

重组DNA分子某一区域发生变异，导致表观生物学功能的丧失；（9）显微注射：显微注射就是借助光学显微镜的放大作用，利用显微操作仪，直接把DNA注射到动物早期胚胎、胚胎干细胞、体细胞或卵母细胞中，然后生产动物个体的技术。

经过显微注射DNA发育而成的动物中，有少数整合了被注射的DNA分子，成为转基因动物。

（10）悬浮细胞：（11）补料分批培养：是指分批培养过程中，间歇或连续地补加新鲜培养基的培养方法。

（12）连续培养行下去的一种培养方法。

（13）接触抑制：细胞在生长分裂时达到相互接触而停止分裂的现象,称为接触性抑制（14）单克隆抗体：由一个抗原决定簇刺激的、单一的B细胞和骨髓瘤细胞融合增殖后所产生的、高度均一的抗体。

（15）多克隆抗体：一种抗原具有多个抗原决定簇,每个抗原决定簇都能刺激一个B细胞产生一种抗体。

这样所获得的免疫血清是多种抗体的混和物。

嵌合抗体的制备抗体在生物医学领域中的应用极为广泛，其制备技术经历了从多克隆抗血清、单克隆抗体到基因工程抗体等3个发展阶段。

基因工程抗体是继多克隆抗体和单克隆抗体之后的第三代抗体，主要包括两部分：一是对已有的单克隆抗体进行改造，包括单克隆抗体的人源化(嵌合抗体、人源化抗体)、小分子抗体(Fab，ScFv，dsFv，diabody，minibody等)以及抗体融合蛋白的制备；二是通过抗体库的构建，使得抗体不需抗原免疫即可筛选并克隆新的单克隆抗体。

基因工程抗体，即应用基因工程技术将抗体的基因重组并克隆到表达载体中，在适当的宿主中表达并折叠成有功能的一种抗体分子。

基因工程抗体具有分子小、免疫原性低、可塑性强及成本低等优点。

此技术的基本原理是，首先从杂交瘤或免疫脾细胞、外周血淋巴细胞等中提取mRNA，逆转录成cDNA，再经PCR 分别扩增出抗体的重链及轻链基因，按一定的方式将两者连接克隆到表达载体中，并在适当的细胞(如大肠杆菌、CHO细胞、酵母细胞、植物细胞及昆虫细胞等)中表达并折叠成有功能的抗体分子，筛选出高表达的细胞株，再用亲和层析等手段纯化抗体片段。

基因工程抗体技术的着眼点在于尽量减少鼠源成分，保留原有抗体的亲和力和特异性。

借助于基因工程技术，既可以对完整抗体，又可以对抗体片段进行改造。

单克隆抗体(McAb)以其高特异性、高亲和力等优点，在许多疾病的诊疗中得到广泛应用，成为新型药物研制的一条有效途径。

然而大多数McAb都是鼠源的，众多的临床研究表明，将鼠源McAb重复注入人体内会引起患者的人抗鼠抗体(HAMA)反应，出现全身过敏毒性反应并阻断抗体功效的发挥。

为了降低鼠源McAb在人体内的免疫原性，尽可能地避免患者出现HAMA反应，从而可以给患者重复应用McAb来实施治疗现在已经发展了三种技术来克服抗体的免疫原性：(1)将鼠源McAb的恒定区(c区)置换为人抗体的C区，构建成人／鼠嵌台抗体；(2)在采用人的C区的基础上，将鼠源McAb的互补决定区( cDR)移植到人抗体的框架区( FR)中，构建成人源化改形抗体；(3)从人类噬菌体抗体库中获得针对特异性抗原的人抗体的可变区(V区)基因，再构建完整的人抗体或抗体片段。

表达载体应具备的条件：1载体能够独立复制，有复制起点（2）应有灵活的克隆位点和方便的筛选标记，利于外源基因的克隆、鉴定和筛选。

（3）应具有很强的启动子，能为大肠杆菌的RNA聚合酶所识别。

（4）应具有阻遏子，使启动子受到控制，只有当诱导时才能进行转录。

（5）应具有很强的终止子，以便使RNA聚合酶集中力量转录克隆的外源基因，而不转录其他无关的基因，同时很强的终止子所产生的mRNA较为稳定。

（6）所产生的mRNA必须有翻译的起始信号。

影响目的基因在大肠杆菌中表达的因素？外源基因的拷贝数外源基因的表达效率表达产物的稳定性细胞的代谢负荷工程菌的培养条件基因工程药物的分离纯化？胞内产物：细胞破碎→固液分离→包含体→变性→复性→浓缩→初步分离→高度纯化→制剂→产品胞外产物，直接经过浓缩→初步分离→高度纯化→制剂→产品。

蛋白质工程的主要步骤通常包括*：1从生物体中分离纯化目的蛋白；（2）测定其氨基酸序列；（3）借助核磁共振和X射线晶体衍射等手段，尽可能地了解蛋白质的二维重组和三维晶体结构；（4）设计各种处理条件，了解蛋白质的结构变化，包括折叠与去折叠等对其活性与功能的影响；（5）设计编码该蛋白质的基因改造方案，如点突变；（6）分离、纯化新蛋白，功能检测后投入实际使用生物技术药物的特征分子结构复杂具有种属特异性治疗针对性强、疗效高稳定性差基因稳定性免疫原性内的半衰期短受体效应多效性和网络性效应检验的特殊性基因工程克隆载体的特点：1有复制子②有单一限制内切酶切位点或多克隆位点③有选择性遗传标记如抗性基因④拷贝数高⑤生物安全性好真核基因在原核细胞中表达载体必须具备条件⑴载体能够独立复制。

载体本身是一个复制子，具有复制起点。

⑵应具有灵活的克隆位点和方便的筛选标记，以利于外源基因的克隆鉴定和筛选。

且克隆位点位于启动子序列后，以便外源基因表达。

⑶应具有很强的启动子，能为大肠杆菌RNA聚合酶所识别。

⑷应具有阻遏子，使启动子受到控制，只有当诱导时才能进行转录。

生物制药技术重点归纳第一章生物技术：（Biotechnology）是人类对生物资源（包括微生物、植物、动物）的利用、改造并为人类服务的技术。

生物技术制药：就是利用基因工程技术、细胞工程技术、微生物工程技术、酶工程技术、蛋白质工程技术、分子生物学技术等来研究和开发药物，用来诊断、治疗和预防疾病的发生。

第二章基因工程技术：基因工程技术又叫基因拼接技术或DNA重组技术。

将重组对象的目的基因插入载体，拼接后转入新的宿主细胞，构建成工程菌；实现遗传物质的重新组合，并使目的基因在工程菌内进行复制和表达的技术。

补料分批培养：补料分批培养是将种子接入发酵反应器中进行培养，经过一段时间，间歇或连续地补加新鲜培养基，使菌体进一步生长的培养方法。

连续培养：连续培养是将种子接入发酵反应器中，搅拌培养至菌体浓度达到一定程度后，开动进料和出料蠕动泵，以一定稀释率进行不间断培养。

透析培养技术：透析培养技术是利用膜的半透性原理使培养物和培养基分离，其主要目的是通过去除培养液中的代谢产物来解除其对生产菌的不利影响。

高密度发酵：是指培养液中菌体的浓度在50gDCW/L以上，目的是降低成本，提高效率。

离子交换层析：是依据流动相中的组分离子与交换剂上的平衡离子进行可逆交换时结合力大小的差别而进行分离的一种层析方法。

疏水层析：是利用蛋白质表面的疏水区域和固定相上疏水基团之间的相互作用力差异，对蛋白组分进行分离的层析方法。

亲和层析：是利用固定化配体与目的蛋白质之间非常特异的生物亲和力进行吸附，这种结合既是特异的，又是可逆的，改变条件可以使结合解除。

凝胶过滤层析：是以多孔性凝胶填料为固定相，按分子大小对溶液中各组分进行分离的液相层析方法。

利用基因工程技术生产药物的优点？答：1大量生产过去难以获得的生理活性蛋白和多肽，为临床使用提供有效的保障；2、可以提供足够数量的生理活性物质，以便对其生理、生化和结构进行深入的研究，从而扩大这些物质的应用范围；3、可以发现、挖掘更多的内源性生理活性物质；4、内源生理活性物质在作为药物使用时存在的不足之处，可通过基因工程和蛋白质工程进行改造和去除；5、可获得新型化合物，扩大药物筛选来源。