重组抗EGFR人鼠嵌合单克隆抗体原液生产车间工艺设计

浅析单抗原液的生产工艺单抗即单克隆抗体，是通过将抗原注入到宿主动物体内启动机体免疫应答而产生的。

单抗药物在病毒性疾病、自身免疫性疾病、恶性肿瘤及烈性传染病的防治领域有着突出的作用。

单抗都是采用哺乳动物细胞进行表达，主要以中国仓鼠卵巢细胞系（CHO）为主。

在抗体纯化过程中除了要考虑回收率和纯度以外，还需有效的灭活和清除病毒。

单抗原液车间生产的原液不适用热力灭菌工艺，通常选择无菌操作的非最终灭菌生产工艺。

单抗生产中病毒污染风险：CHO细胞系是制造许多治疗性蛋白质的主力。

CHO细胞的生物安全等级为一级，CHO本身存在内源性逆转录病毒，这是已经被证实了的，但这种病毒对人类不具有致病性。

从药物质量安全角度出发，遵循SFDA 公布的《人用单克隆抗体质量控制技术指导原则》，加入病毒去除和灭活方法。

此外，基于哺乳动物细胞进行的培养发酵，产品被病毒污染是考虑的主要生产风险之一。

病毒污染的其他潜在来源可能还有：使用已经被污染了的主细胞种子库或工作细胞种子库；操作员可能带进病毒，污染工艺；细胞线残留上一级仍有活力的病毒。

因为哺乳动物细胞为带入的病毒污染物提供了合适的宿主细胞，因此病毒量可能会随着细胞培养而放大，进而可能增加生产过程的整体风险。

单克隆抗体药品生产通常包含四个模块：上游培养、下游纯化、分析质控和制剂。

单抗的生产工艺：单抗原液的生产工艺主要概括为两个阶段：上游细胞的培养、发酵和下游的纯化。

细胞种子经摇瓶、WAVE反应器、一、二、三级种子培养扩增后进入发酵罐进行发酵培养。

发酵结束后经离心机进入下游进行纯化。

离心后的料液经过层析、超滤后变成原液。

具体的工艺流程描述如下：（1）细胞复苏：细胞复苏和冻存讲究“慢冻快溶”，复苏时一定要将冻存在液氮或-80℃中凝固的细胞冻存液快速融化至37℃，使胞外冻存时的冰晶迅速融化，避免冰晶缓慢融化时进入细胞形成再结晶，对细胞造成损害。

（2）细胞传代培养：①悬浮细胞培养：是指细胞在培养液中呈悬浮状态进行生长繁殖，能连续培养和连续收获的培养技术。

上海张江单克隆抗体药物洁净车间工程设计要点抗体技术是20世纪最重大的科学成就和目前最重要的科学技术前沿之一，被誉为生命科学和生物技术产业产业将发生重大突破性进展的领域。

这个领域未来的市场前景非常广阔，在设计生产车间时，如何提高生产线的使用效率，节约建设资金，保证产品质量，并且符合GMP的要求？下面我们就EPC工程（总承包）集服务CEIDI西递项目来聊聊单克隆抗体药物洁净车间工程设计要点。

规划分区及平面设计在单克隆抗体药物研发周期长达十多年，排除前期的实验室（动物研究）阶段，到中试洁净车间内，无论是原料车间还是制剂车间都需依据生产工艺和制备流程进行设计分区。

譬如在种子、发酵、收获、纯化、超滤和原液过滤除菌主要的生产区域，根据工艺流程，配置合适的培养基配置和储存区以及缓冲液配置和储存区。

设置两个清洗间，一个为缓冲液和培养基配置区服务，一个为发酵和纯化工序服务。

CEIDI西递在平面布置满足工艺生产和GMP以及其他国家法规和标准的条件下，做到人、物分开不交叉，工艺线路顺畅、物流线路短捷、不交叉、不迂回。

CEIDI西递为了合理利用空间，将按照人流和物流单向流的理念进行整体空间布局。

分别设计清洁物料、不洁物料的进入口；人员的进入通道和出车间通道分开，以避免人员退出时对清洁区域造成污染；设立独立的出污口。

空调净化系统空调系统将依据生产区的分区原则和防止交叉污染的原则进行分区。

培养基配置和缓冲液配置定义为一个区，人进和清洁走道、种子、发酵、收获、纯化以及污物走道和清洗间分别设立独立的空调系统。

CEIDI西递考虑到纯化采用开放系统因此不同的纯化工段，包括超滤和除病毒过滤均设置在一个空调分区内。

单克隆抗体因其产品对温度的敏感性，对生产环境的温度有较高要求。

为了防止生产过程产生过多的二聚体或者多聚体，原液的加工温度控制在4~12℃。

要求储存和处理设备均有严格的温度控制，如储存罐、超滤等。

单抗药物的长期储存条件为2~8℃，无论是冻干粉针还是水针。

人鼠嵌合抗体的实验方案概述人鼠嵌合抗体是一种由人类和小鼠的基因序列构建而成的抗体，具有更好的兼容性和更强的亲和力。

本文将介绍人鼠嵌合抗体的实验方案，帮助研究人员了解如何制备和应用这种抗体。

实验材料和设备1.鼠源性抗体：可以根据实验需要选择目标抗原的鼠源性抗体。

2.人源性抗体：选择与鼠抗体相应的人源性抗体。

3.PC R引物：用于扩增鼠和人源性抗体的基因序列。

4.载体：提供基因组合和表达的载体。

5.细菌：用于负责抗体基因的表达和生产。

实验步骤步骤一：基因扩增1.从鼠源性抗体和人源性抗体中提取基因组DN A。

2.设计合适的P CR引物，用于扩增鼠源性抗体的可变区和人源性抗体的框架区。

3.进行PC R反应，得到鼠源性抗体的可变区和人源性抗体的框架区。

步骤二：基因重组1.将鼠源性抗体的可变区和人源性抗体的框架区进行酶切。

2.使用连接酶将两个片段连接起来，形成人鼠嵌合抗体的基因序列。

步骤三：载体构建1.将人鼠嵌合抗体的基因序列插入选择的载体中。

2.转化合适的细菌菌株，如大肠杆菌，用于基因的表达和生产。

步骤四：抗体表达1.需要选择适当的表达条件，例如温度、培养基、诱导剂等。

2.培养细菌并收集细菌培养液。

3.通过亲和层析等方法纯化抗体。

数据分析和结果通过实验可以获得人鼠嵌合抗体，并进行最终的纯化。

可以通过酶联免疫吸附试验（E LIS A）等技术来评估抗体的兼容性和亲和力。

此外，可以通过细胞实验和动物模型验证人鼠嵌合抗体的生物学活性和疗效。

结论人鼠嵌合抗体的实验方案详细介绍了制备和应用这种抗体的步骤。

这种抗体具有更好的兼容性和亲和力，适用于生物医学研究和治疗。

通过严谨的实验设计和操作，我们可以成功制备和应用人鼠嵌合抗体来解决相关的科学问题。

重组抗人表皮生长因子受体（EGFR）嵌合单克隆抗体CH225非还原电泳纯度分析作者：付换成卢秋丽刘浩张文秋赵云来源：《中国医学创新》2014年第15期【摘要】目的：分析CH225在非还原电泳时抗体条带主条带以外在高分子量和低分子量产生杂条带的原因。

方法：在不同的供试品缓冲液和不同电泳条件下进行SDS-PAGE电泳比较。

结果：上样前100 ℃煮样1 min与加碘乙酰胺结果相同。

结论：高分子量和低分子量杂条带可以用电泳上样前100 ℃煮样1 min消除即可。

【关键词】非还原SDS-PAGE；重组单抗； EGFR；重组抗人表皮生长因子受体药品生产过程中，重组蛋白类药物的质量检测和控制十分重要，SDS-PAGE（聚丙烯酰胺凝胶电泳）是蛋白类药物的纯度分析的常用手段[1-2]。

CH225（重组抗人表皮生长因子受体（EGFR）嵌合单克隆抗体）是四川恒星生物制药有限公司采用基因工程技术，利用NS/0细胞表达的人源化抗体，属于IgG1亚型，已用于转移性结直肠癌、头颈癌等多种癌症的治疗，并且现有研究表明可能适用于鼻咽癌、肺癌等其他癌症的治疗[3-4]。

在CH225的临床前研发，质量检测的过程中发现，除抗体主条带以外，还存在一些分子量大小不同的杂条带，特别在非还原性实验中，情况尤为明显。

本文采用不同温度和不同试剂的条件下对样品进行预处理，比较最佳的SDS-PAGE结果，为CH225批量生产的质量检测和控制提供参考和依据。

1 材料与方法1.1 药品参比品（批号C201105002）：四川恒星生物制药有限公司于2011年5月第2批生产的CH225注射液；对照品（批号C201107006）：四川恒星生物制药有限公司于2011年7月第6批生产的CH225注射液；爱比妥（Erbitux）：通用名西妥昔单抗（cetuximab），默克公司生产。

1.2 主要试剂和仪器 SDS-PAGE电泳装置和扫描仪为Bio-Rad公司产品；水为超纯水，其余试剂均为分析纯。

---文档均为word文档，下载后可直接编辑使用亦可打印---摘要尼妥珠单抗（Nimotuzumab），是一个IgG1 型的人源化单克隆抗体，作用机理为特异性结合EGFR 胞外的结构域的抗原表位 [1]，阻止其活化。

临床上主要应用于与放疗联合治疗，以稳固化疗治疗效果。

根据现有尼妥珠单抗氨基酸序列，人工合成尼妥珠单克隆抗体重链与轻链基因，将尼妥珠单抗重链的pSV2-gpt质粒和编码轻链的pSV-hyg质粒转入CHO 宿主细胞，获得可稳定表达尼妥珠克隆抗体的工程细胞。

应用细胞灌流培养技术，通过细胞的扩增培养和发酵表达培养，在哺乳动物细胞表达系统利用CHO细胞高效稳定的产生尼妥珠单克隆抗体，然后使用重组protein A层析提纯以及纳米滤膜过滤等纯化工艺进行纯化，再经过无菌灌装单体原液程序产生尼妥珠单抗原液。

针对单克隆抗体生产工艺特性，遵循GMP和国家相关设计规范的要求，根据尼妥珠单克隆抗体的生产工艺流程、设计符合GMP要求的尼妥珠单克隆抗原液生产车间。

关键词：尼妥珠单抗，灌流培养工艺，生产车间设计Design of Nituzumab Antigen Solution ProductionWorkshopAbstractimotuzumab (Nimotuzumab) is an IgG1 humanized monoclonal antibody that specifically binds to the epitope of the extracellular domain of EGFR [1], preventing its activation. Clinically, it is mainly used in combination with radiotherapy for the treatment of stage III / IV nasopharyngeal carcinoma with positive expression of epidermal growth factor receptor (EGFR).According to the existing amino acid sequence of nimotuzumab, the heavy chain and light chain genes of the monoclonal antibody of nimotuzumab were artificially synthesized, and the pSV2-gpt plasmid of the heavy chain of nimotuzumab and the pSV-hyg plasmid encoding the light chain were transferred into CHO host cells to obtain engineered cells that can stably express Nitozol clone antibodies. Using cell perfusion culture technology, through cell expansion culture and fermentative expression culture, the monoclonal antibody of Nitozol is produced in CHO cells of mammalian cell expression system, which is then purified using recombinant protein A, virus inactivation and nanofiltration membrane filtration. The purification process within the purification, and then aseptically fill the production process of the monoclonal antibody stock solution.According to the characteristics of monoclonal antibody production process, follow the requirements of GMP and relevant national design specifications, according to the production process of Nitrozine monoclonal antibody, design the production workshop of Nitrozine monoclonal antigen solution that meets GMP requirements.Keywords: Nitozumab, perfusion culture process, workshop design目录1.前言 (4)1.1尼妥珠单克隆抗体研究现状 (4)1.1.1尼妥珠单克隆抗体的作用机理 (5)1.1.2尼妥珠单克隆抗体的临床应用 (5)1.1.3尼妥珠单克隆抗体的临床应用进展 (5)1.1.4尼妥珠单克隆抗体的优点 (5)1.2单克隆抗体生产的特点 (5)1.3生产车间设计要点 (6)1.3.1生产车间洁净度要求 (6)1.3.2生产车间人流与物流控制要求 (6)1.4细胞培养工艺研究现状 (7)1.4.1细胞截留 (7)1.5设备选型 (14)2.5工艺流程 (8)2.5.1 工程细胞的构建 (8)2.5.2种子细胞的复苏 (9)2.5.3种子逐级扩增与生产 (9)2.5.4连续灌流培养 (9)2.5.5抗体提纯 (10)2.5.6 病毒灭活 (10)2.5.7 核酸与内毒素的去除 (10)2.5.8 精细纯化 (10)2.5.9 病毒过滤 (11)2.5.10原液保存 (11)3.物料衡算 (11)3.1水 (11)3.1.1自来水 (11)3.1.2 纯化水 (11)3.2 物料 (12)3.2.1培养基原料 (12)3.2.2缓冲液原料 (12)3.2.3 层析柱填料 (14)4.生产车间设计 (17)4.2 生产车间平面布置 (18)4.2.1 上游生产区域 (18)4.2.2 下游生产区 (18)5.结束语 (19)参考文献 (19)谢辞 (20)1.前言1975年克勒和米尔斯坦发明了淋巴杂交瘤技术，使单克隆抗体拥有实现的可能性。

CAR-T细胞车间设计要点1. 背景介绍CAR-T细胞（Chimeric Antigen Receptor T-cell），即嵌合抗原受体T细胞，是一种基因工程技术在免疫细胞治疗领域的创新疗法。

CAR-T细胞疗法通过改造患者自身的T细胞，使其具有能识别和攻击癌细胞的能力，并将改造后的细胞注入患者体内，以治疗癌症。

为了满足CAR-T细胞疗法的生产需求，需要设计一个专门的CAR-T细胞车间。

本文将介绍CAR-T细胞车间设计的要点，以确保生产过程的安全性、高效性和一致性。

2. 设计要点2.1 设计合理的空间布局CAR-T细胞车间应具备合理的空间布局，以确保生产过程的流畅性和工作效率。

其中，包括：•生产区、无菌区和洁净区的合理划分；•各个工作区域之间的合理连接；•根据生产工艺流程确定工作区域的大小和位置；•考虑到人员和设备的移动路径设计通道和出入口。

2.2 提供适宜的环境条件CAR-T细胞的生产需要特定的环境条件，以确保细胞的生长和扩增过程的安全和稳定。

在车间设计中，需要考虑以下环境条件：•恒定的温度和湿度控制；•合适的通风系统，确保新鲜空气的进入和废气的排出；•合适的废液处理系统，确保废液的安全处理。

2.3 实施严格的洁净措施由于CAR-T细胞的生产需要无菌环境，因此车间设计应考虑实施严格的洁净措施。

主要包括：•空气过滤系统，以净化空气并控制微生物污染；•无菌操作室，以进行细胞培养和扩增过程；•严格的消毒和清洁程序，以确保无菌环境的维护。

2.4 设备选择与安装CAR-T细胞车间的设备选择和安装对于生产的质量和效率至关重要。

以下是重要的考虑因素：•考虑生产规模和需求，选择适合的设备；•确保设备符合相关的GMP（Good Manufacturing Practice）标准；•设备的布局和位置应与工艺流程和操作人员的工作流程相适应；•安装设备时需考虑其使用情况、维护和维修的便捷性。

2.5 培训与操作程序CAR-T细胞车间的设计要考虑培训和操作程序。

重组牛碱性成纤维细胞生长因子原液生产车间工艺设计重组牛碱性成纤维细胞生长因子原液生产车间工艺设计摘要重组牛碱性成纤维细胞生长因子（Recombinant bovine basic fibroblast growth factor，简称rb-bFGF）是一种用于急慢性溃疡、创伤等症状的药品。

能刺激来源于中胚层和神经外胚层细胞的生长，如成纤维细胞、血管内皮细胞、角膜细胞、上皮细胞、神经细胞、肌细胞、骨细胞等，有广泛的生物活性。

日常生活中常应用于美容行业和各种溃疡、创伤、烧伤等治疗，能显著地缩短伤口愈合周期。

具有良好的市场前景。

本设计主要包括：根据发酵、纯化工艺对生产工艺选择、生产所需设备的选型、成本估算、物料衡算、生产车间的设计和CAD图纸的绘制等。

对车间的设计符合GMP标准加上适当的创新，实现人与物料分离，保证了车间的生产效率，有效地避免污染和交叉污染，便与车间的清洁操作和维护。

稳定生产质量的同时尽可能减少成本，确保车间的经济效益。

关键词：重组牛碱性成纤维细胞生长因子；设备选型；物料衡算；CAD图纸绘制；车间设计；Process design of production plant of recombinant bovine basicfibroblast growth factor stock solutionAbstractRecombinant bovine basic fibroblast growth factor (RB bFGF) is a kind of drug for acute and chronic ulcer, trauma and other symptoms. It can stimulate the growth of mesoderm and neuroectoderm cells, such as fibroblasts, vascular endothelial cells, corneal cells, epithelial cells, nerve cells, muscle cells, bone cells, etc. it has a wide range of biological activities. In the daily life, it is often used in the beauty industry and treatment of various ulcers, wounds, burns, etc., which can significantly shorten the wound healing cycle. It has a good market prospect. The design mainly includes: according to fermentation and purification process, production process selection, selection of equipment required for production,cost estimation, material balance, design of production workshop and drawing of CAD drawings, etc. The design of the workshop conforms to GMP standard and appropriate innovation, realizes the separation of people and materials, ensures the production efficiency of the workshop, effectively avoids pollution and cross pollution, and facilitates the clean operation and maintenance of the workshop.Stabilize the production quality while reducing the cost as far as possible, ensure the economic benefit of the workshop.Keywords: Recombinant bovine basic fibroblast growth factor; Equipment selection; Material balance;CAD drawing;Workshop design目录1前言 (1)1.1概述 (1)1.1.1碱性成纤维细胞生长因子简介 (1)1.1.2牛碱性成纤维细胞生长因子简介 (1)1.1.3牛碱性成纤维细胞生长因子作用机理 (1)1.1.4重组牛碱性成纤维细胞生长因子的应用 (2)1.2bFGF在国内外的发展概况及存在的问题 (2)1.3本设计的目的、意义及应达到的技术要求 (3)2工艺流程 (3)2.1种子复苏 (3)2.2一级种子制备 (3)2.3二级种子制备 (4)2.3发酵罐发酵 (4)2.3.1使用前的准备 (4)2.3.2 接种，发酵 (5)2.4 rb-bFGF的分离纯化 (5)2.4.1粗提 (5)2.4.1.1磷酸缓冲液的配制 (5)2.4.2 CM层析 (6)2.4.2.1 CM琼脂糖凝胶操作说明[13] (6)2.4.3肝素亲和层析 (7)2.5工艺流程图 (8)3物料衡算 (8)3.1 物料衡算的基准 (8)3.2 物料衡算的条件 (8)3.3 物料衡算的过程 (9)3.3.1 确定每批的时间 (9)3.3.2 每批次投料量的计算 (9)3.3.3纯化水用量计算 (11)3.3.4注射用水用量计算 (12)3.4热量衡算 (14)3.4.1二级种子制备 (14)3.4.2发酵罐发酵 (14)3.5蒸汽用量计算 (15)3.5.1种子罐实消 (15)3.6.2发酵罐实消 (15)3.7无菌空气用量计算 (15)3.7.1种子罐用无菌空气量 (15)3.7.2发酵罐用无菌空气量 (15)4设备选型 (15)4.1设备选型原则 (16)4.2恒温摇床 (16)4.3电子秤 (17)4.4超低温保存箱 (18)4.5酸度计 (18)4.6分光光度计 (19)4.7种子罐 (19)4.8超声波细胞粉碎机 (20)4.9离心机 (21)4.10发酵罐 (22)4.11注射用水机 (23)4.12纯化水机 (23)4.13层析系统 (24)4.14CM层析柱 (24)4.15肝素层析柱 (25)5车间设计 (25)5.1 设计原则说明 (26)5.2车间布置说明 (26)参考文献 (27)谢辞 (28)附录1 (29)附录2 (30)1前言1.1概述1.1.1碱性成纤维细胞生长因子简介碱性成纤维细胞生长因子（Basic fibroblast growth factor，bFGF）是一种很有应用潜力的生长因子，目前主要应用于细胞体外培养增殖、诱导分化以及体外组织再生领域。

年产7000万支新冠疫苗制剂车间工艺设计说明书新冠疫苗制剂车间工艺设计说明书随着新冠疫情的爆发，全球疫苗研发机构纷纷加入疫苗研发的行列。

为应对疫情，我国也迅速响应并投入大量资源，加快新冠疫苗研制进程。

经过数月的紧张攻关，我国成功研发出新冠疫苗，并已开始批量生产。

为了确保疫苗的质量和供应稳定，我们特别编写了这份年产7000万支新冠疫苗制剂车间工艺设计说明书。

一、工艺流程设计1. 疫苗原液制备：首先，收集到的新冠病毒复制基因片段和载体经酶切后进行连接。

然后，得到的质粒经转染至宿主细胞进行培养、扩增。

最后，通过离心、过滤、纯化等步骤得到疫苗原液。

2. 疫苗制剂生产：将疫苗原液注入灭菌罐中，通过疫苗分装机进行分装。

然后，将分装好的疫苗进行冷冻保存，并进行初级包装。

最后，进行复包装和标签粘贴，准备出厂。

二、关键环节控制1. 原料检验：对病毒复制基因片段、载体和其他辅料进行全面检验，确保符合质量要求。

2. 生物安全操作：工作人员必须穿戴符合生物安全要求的防护设备，严格按照操作规程进行操作，防止病毒泄漏和交叉感染。

3. 清洁消毒：车间设备、操作区域、容器等必须定期进行彻底清洁和消毒，确保无任何污染。

4. 环境监测：安装必要的设备监测空气质量、温湿度等参数，确保生产环境符合要求，不对疫苗质量产生影响。

5. 质量控制：建立完善的质量控制体系，包括原料、半成品和成品的抽检、检测和记录，确保疫苗的质量稳定。

三、工艺改进与创新1. 自动化生产线：引进先进的自动化设备，提高生产效率，降低人为操作对疫苗质量的影响。

2. 高效过滤技术：采用先进的过滤技术，确保疫苗原液的纯度和安全性。

3. 制剂稳定性研究：与相关科研机构合作，深入研究新冠疫苗的制剂稳定性，以确保疫苗在生产、储存和运输过程中不发生质量变化。

四、质量保障措施1. 培训与考核：对从事疫苗制剂生产的工作人员进行全面培训，并定期进行考核，确保操作规范符合要求。

2. 审计与验证：定期对车间的工艺流程进行内部审核，同时请第三方机构进行外部验证，确保工艺设计和执行符合质量管理体系要求。