抗汉坦病毒鼠_人嵌合抗体真核表达载体的构建及表达_张晓晓

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人-鼠嵌合单链抗体的构建及其在大肠杆菌中的高效可溶性表达和发

关键词人源化嵌合抗体；ｓｃＦｖ；可溶性表达；酶联免疫吸附；发酵条件优化
中图分类号Ｑ７８文献标识码Ａ文章编号２０９５—１７３６（２０１６）０６— ０００１ — ０６
Ｃｏｎｓｔｒｕｃｔｉｏｎｏｆｃｈｉｍｅｒｉｃｓｉｎｇｌｅ — ｃｈａｉｎａｎｔｉｂｏｄｙｅｉｃｆｉｅｎｔｓｏｌｕｂｌｅｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ
第３３卷第６期２０１６年１２月
生物学杂志
ＪＯＵＲＮＡＬＯＦＢＩＯＬＯＧＹ
Ｖｏｌ＿３ｏｉ：１０．３９６９／ｊ．ｉｓｓｎ．２０９５—１７３６．２０１６．０６．００１
ｉｎｃｈｅｒｉｃｈｉａｃｏｌｉａｎｄｏｐｔｉｍｉｚａｔｉｏｎｏｆｆｅｒｍｅｎｔａｔｉｏｎｃｏｎｄｉｔｉＯｉｌＳ
ＬＩＵＭｅｎｇ，，一，ＳＵＮＹａｎｇ，，ＹＡＮＧＹａｎ — ｋｕｎ，，一，ＢＡＩＺｈｏｎｇ．ｈｕ，，
（１．ＮａｔｉｏｎａｌＥｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇＬａｂｏｒａｔｏｒｙｆｏｒＣｅｒｅａｌＦｅｒｍｅｎｔａｔｉｏｎＴｅｃｈｎｏｌｏｇｙ；２．ＴｈｅＫｅｙＬａｂｏｒａｔｏｙｒｏｆＩｎｄｕｓｔｒｉａｌ

CD80鼠-人嵌合抗体的CHO细胞表达及体外生物学功能的初步研究

ＣＥＨＮＭｉ－ｉＱＵ一ｎＸｎ，Ｉｇ
．ｎｔｕＩｓｔｅｆＭｅｉｌｉｅｈｏｇ，ｏｃｏｎｖｓｙ，ｕｈｕ２５０，ｈａｉｔｏｄａｏｃｎｌｙＳｏｈｗＵｉｒｔＳｚｏ１０７ＣｉｃＢｔｏｅｉｎ
ｌｂｔｃ］Ｏｊｃｖ：ｏｅｐｓｈｍｎｍｕｅｃｉｅｉａｔｏｙａａｓｈｍｎＣ８ｃ４５ａｔｏｙｎＣＯｃｌ，ｎ — ｓａｔＡｒｂｅｔｅＴｘｒｓｕａ－ｏｓｈｍｒｎｂｄｇｉｔｕａＤ０（ｈＥｎｂｄ）ｉＨｅｓａｄｔｒｉｅｃｉｎｉｌｏｅ
ｃ４ＥｏｃｎｔｕｔｓａｌｅｌｌｅｓｃｅｉｇｃｉｒｃｎｔｂｄＴｈｈＥ５ａｔｏｙｗａｕｆｄｆｏｃｌｕｅｓｐｍａａｔｗｉｏｔｆｔｌｃｌｈ５ｔｏｓｒｃｔｂｅｃｌｉｅｒｔｎｈｍｅａｉｏｙ．ｅｃ４ｎｉｄｓｐｒｉｒｍｕｔｒｕｅｔｔｕｅａａｆｎｉｂｉｅｎｈ
中国图书分类号Ｒ９．３２１文献标识码Ａ文章编号１０－８Ｘ（０９０－１４０００４４２０）２０１．４
［摘
要］目的：ＨＣＯ细胞表达抗人Ｃ８Ｄ０鼠一人嵌合抗体ｃ４５并研究其在体外阻断Ｃ８ｈＥ，Ｄ０介导的共刺激信号转导的生
物学功能。方法：构建含有嵌合重、轻链基因的表达载体ｐＲＳｃ４５表达载体先转染２３ＩＥ／ｈＥ；９Ｔ细胞，ＣＦＭ检测到ｃ４５抗体的ｈＥ瞬时表达后，表达载体再转染ＣＯ细胞，Ｈ构建稳定表达细胞株ＣＯｃ４５ＰｏｉＧ亲和层析法从ＣＯｃ４５Ｈ —ｈＥ；ｒｅｔｎＨ —ｈＥ细胞无血清培养上清中纯化ｃ４５ｈＥ抗体，ＣＦＭ检测ｃ４５抗体对膜型Ｃ８ｈＥＤ０的识别；以丝裂霉素处理的正常人外周血单核细胞ＰＭｓＢＣ为刺激细胞，以异体正常人外周血淋巴细胞Ｐｋ为反应细胞，ＭＦＢ用Ｔ法分析ｃ４５抗体的阻断作用。结果：ｈＦｈＥｃ４５抗体在２３＿９Ｔ细胞的

抗CD25人鼠嵌合抗体基因真核表达质粒的构建与瞬时表达

【Abstract】 Objective To construct a eukaryot-mouse chimeric antibody gene and express tran－ siently in 293T cells. Methods The genes encoding variable regions of heavy and light chains of CD25 hybridoma cells were ampli－ fied by RT-PCR using the designed degenerate primers specific to signal peptide. The genes encoding constant regions of heavy and light chains of human IgG1 were amplified using plasmid PAG4622 as a template. The amplified genes encoding variable regions of heavy and light chains were spliced to the corresponding genes encoding constant regions. The obtained chimeric genes encoding heavy and light chains were inserted into eukaryotic expression vectors pOptiVEC and pcDNA3.3 respectively, and the constructed re － combinant plasmids were co-transfected to 293T cells for expression. The transcription level of chimeric antibody gene was determined by RT-PCR, the expression level of chimeric antibody by ELISA, and the binding activity of chimeric antibody by flow cytometry （FCM）. Results The eukaryotic expression vector for human-mouse chimeric antibody gene was constructed correctly. RT-PCR proved that the chimeric antibody gene was successfully transcribed in 293T cells. The chimeric antibody contents in culture super － natant of 293T cells 48, 72, 96 and 120 h after transfection were 7. 47, 11. 72, 8. 02 and 18. 28 ng ／ ml respectively. FCM showed specific binding of the chimeric antibody to IL-2Rα chain. Conclusion The eukaryotic expression vector for human-mouse chimeric antibody gene was successfully constructed and expressed transiently in 293T cells.

抗汉坦病毒糖蛋白细胞内抗体的构建和稳定表达

抗汉坦病毒糖蛋白细胞内抗体的构建和稳定表达王涛;李建东;李川;梁米芳;李德新【期刊名称】《中华实验和临床病毒学杂志》【年(卷),期】2003(017)002【摘要】目的在内质网和细胞质内表达抗汉坦病毒糖蛋白G1,G2细胞内抗体. 方法 PCR分别扩增抗汉坦病毒糖蛋白抗体VH和VL段基因,克隆入单链抗体表达载体pOPE-101-215(Yol),转化大肠埃希菌XLI-Blue,IPTG诱导表达并鉴定其活性,再将单链抗体基因克隆入真核表达载体pEF/myc/ER和pEF/myc/CYTO,转染Vero E6,使单链抗体在内质网和细胞质内得到表达;通过G418和有限稀释法筛选阳性克隆,建立稳定表达抗汉坦病毒糖蛋白细胞内抗体的细胞系.结果 Western-blot检测证实原核表达单链抗体,ELISA,IFA检测其具有抗原结合活性,真核表达显示内质网和细胞质内特异性荧光,筛选细胞系阳性率>95%.结论成功建立稳定表达抗汉坦病毒糖蛋白细胞内抗体的细胞系,为利用汉坦病毒细胞内抗体研究抗病毒作用和病毒的包装复制及病毒感染机制奠定良好基础.【总页数】5页(P116-120)【作者】王涛;李建东;李川;梁米芳;李德新【作者单位】100052,北京,中国疾病预防控制中心病毒病预防控制所出血热虫媒病毒室;100052,北京,中国疾病预防控制中心病毒病预防控制所出血热虫媒病毒室;100052,北京,中国疾病预防控制中心病毒病预防控制所出血热虫媒病毒室;100052,北京,中国疾病预防控制中心病毒病预防控制所出血热虫媒病毒室;100052,北京,中国疾病预防控制中心病毒病预防控制所出血热虫媒病毒室【正文语种】中文【中图分类】R37【相关文献】1.人源性抗HBc单链抗体真核表达载体的构建及其细胞内表达2.汉坦病毒G1和G2糖蛋白的基因克隆及糖蛋白杆状病毒表达载体的构建3.人源抗狂犬病毒糖蛋白稳定型抗体精氨酸密码子突变株的构建及其在巴斯德毕赤酵母中的分泌表达4.抗汉坦病毒核蛋白细胞内抗体抗病毒作用的研究5.汉坦病毒GM04-38株包膜糖蛋白基因表达载体的构建及表达因版权原因，仅展示原文概要，查看原文内容请购买。

HBeAg真核表达载体的构建及其在中国仓鼠卵巢细胞中的表达

HBeAg真核表达载体的构建及其在中国仓鼠卵巢细胞中的表达杨军;刘妮;卫阳;靳耀锋;王军宁;康安静;苏宝山;李宗芳【期刊名称】《临床肝胆病杂志》【年(卷),期】2012(028)011【摘要】目的克隆HBeAg基因,构建重组HBeAg真核表达载体,并在中国仓鼠卵巢细胞(CHO细胞)中进行表达.方法采用PCR法从HBeAg阳性乙型肝炎患者血清HBV DNA中扩增HBeAg基因,克隆入pcDNA3.1(+)真核表达载体中,构建重组pcDNA-HBeAg真核表达载体,经PCR、双酶切、测序鉴定后,将其转染入CHO细胞,G418筛选,用PCR、免疫斑点、Western Blot、免疫细胞化学方法检测HBeAg在CHO细胞中的表达.结果成功克隆到HBeAg基因,并构建了重组pcDNA-HBeAg真核表达载体；基因测序证实克隆的HBeAg基因中共有12个位点发生单碱基置换突变(C1819G,A2007T,C2046T,C2061G,G2106A,C2109A,C2146T,T2172C,C2203T, A2235G,G2253A,C2298T),1个位点发生缺失突变(2346 del T)；成熟HBeAg蛋白中149位缬氨酸(valine,V)突变为苯丙氨酸(phenylalanine,F)(V149F),在HBeAg蛋白羧基端融合有一段长11个氨基酸的多肽(RLESRGPVZTR).PCR、免疫斑点、Western Blot和免疫细胞化学方法证实重组pcDNA-HBeAg真核表达载体可在CHO细胞中表达分泌型HBeAg蛋白.结论重组HBeAg真核表达载体的构建和表达为HBeAg的临床诊断和深入研究提供了条件.【总页数】4页(P845-848)【作者】杨军;刘妮;卫阳;靳耀锋;王军宁;康安静;苏宝山;李宗芳【作者单位】西安交通大学医学院第二附属医院病理科,西安710004;西安交通大学医学院第二附属医院病理科,西安710004;西安交通大学医学院第二附属医院科研实验中心,西安710004;西安交通大学医学院第二附属医院病理科,西安710004;西安交通大学医学院第二附属医院病理科,西安710004;西安交通大学医学院第二附属医院病理科,西安710004;西安交通大学医学院第二附属医院病理科,西安710004;西安交通大学医学院第二附属医院外科,西安710004【正文语种】中文【中图分类】R512.62【相关文献】1.重组融合蛋白Tumstatin-TNF-α分泌型真核表达载体的构建及其在中国仓鼠卵巢细胞中的表达 [J], 赵亮;姚丽娟;孔建新;濮跃晨;孙安源;罗以勤;张林杰2.骨形态发生蛋白基因真核表达质粒的构建及其在中国仓鼠卵巢细胞中的表达 [J], 王海彬;刘少军;樊粤光;何伟;刘武;徐传毅;姜自伟;曾意荣3.丙型肝炎病毒核心区截短型基因真核表达载体的构建及其在中国仓鼠卵巢细胞中的表达 [J], 韦三华;尹文;雷迎风;胡兴斌;吕欣;杨敬;孙梦宁;徐志凯4.HBeAg真核表达载体的构建及其在Bewo细胞中的表达 [J], 资捷;王前;郑磊;熊石龙;蔡贞5.中华鼢鼠卵透明带3基因(mZP3)真核表达载体的构建及其在中国仓鼠卵巢(CHO)细胞中的表达 [J], 张冬辉;郑雪莉;李昊;周智敏;吴景龙;隋丹丹;韩崇选因版权原因，仅展示原文概要，查看原文内容请购买。

小鼠p300-HAT真核表达质粒的构建

小鼠p300-HAT真核表达质粒的构建鲍斌;林燕;薛薏【期刊名称】《安徽农业科学》【年(卷),期】2013(000)027【摘要】[目的]构建小鼠p300-HAT的真核表达质粒.[方法]利用PCR技术扩增p300的HAT域,然后构建p300的HAT域的真核表达质粒(p300-HAT-EGFP),并通过PCR验证和酶切验证重组质粒的正确性;提取不含内毒素的质粒,转染HepG2细胞,通过观测绿色荧光检测转染效率.[结果]PCR产物的电泳结果显示,成功扩增了小鼠p300基因HAT结构域,构建了小鼠p300基因HAT结构域的真核表达质粒,将其命名为m-p300-HAT-pEGFP-C1.重组质粒可以成功表达融合绿色荧光蛋白目的基因蛋白.[结论]p300-HAT-EGFP重组质粒的成功构建为后续开展巨噬细胞NF-kB信号通路的研究奠定了基础.【总页数】4页(P10914-10916,10962)【作者】鲍斌;林燕;薛薏【作者单位】合肥工业大学生物与食品工程学院,安徽合肥230009;合肥工业大学生物与食品工程学院,安徽合肥230009;合肥工业大学生物与食品工程学院,安徽合肥230009【正文语种】中文【中图分类】S188;Q786【相关文献】1.小鼠NF-κB p65亚基真核表达质粒的构建 [J], 杨雪梅;吴靖萱;屈玮2.Smad真核表达质粒构建及其在小鼠T淋巴瘤细胞中的表达 [J], 王婧帆;季然;李鑫宇;陈金铃3.小鼠GP73蛋白真核表达质粒的构建及其对mTOR转录水平的影响 [J], 周鹏宇;朱永杰;曹叶;陈健康;魏从文;何湘;钟辉;吴飞翔4.小鼠白细胞介素33真核表达质粒的构建及表达 [J], 朱俊丰;桑力轩;杨芳丽;李岩;翟景波;高植鹏;邓芳博;孙逊;王大南5.小鼠转录因子STAT1真核表达质粒的构建及生物学功能分析 [J], 韩凯凯;赵冬敏;毕可然;章丽娇;刘青涛;刘宇卓;黄欣梅;杨婧;李银因版权原因，仅展示原文概要，查看原文内容请购买。

小鼠GITR真核表达载体的构建及表达

小鼠GITR真核表达载体的构建及表达沈培;马斌;许化溪;王胜军;郑东;刘艳;田洁;赵银霞;刘青玲;朱晨露;马洁;苏兆亮【期刊名称】《江苏大学学报（医学版）》【年(卷),期】2011(021)004【摘要】Objective: To construct eukaryotic expression vecter of mouseGITR gene fragment. The eukaryotic recombinant vectors then were transfected into COS-7 cells to express mG ITR protein. Methods:The DNA fragment encoding mouse GITR was amplified by RT-PCR from the totalRNA which was extracted by TRIzol agent from mouse spleen cells. We constructed the eukaryotic recombinant vectors of mGITR ,which were pIRES2-EGFP-mGITR. Being correctly identified, the vectors were transfected into COS-7 cells by the lipofectin reagent. Results: We successfully extracted the total RNA containing mCITR gene from mouse spleen cells and amplified the mGITR gene fragment by RT-PCR. After the recombinant vectors pIRES2-EGFP-mGITR were transfected hto COS-7 cells, the green fluorescent light was seen and the protein extracted that was identified as the targetproteinmGITR by Westem-blot. Conclusion : The eukaryotic expression vectors pIRES2-EGFP-mGITR was successfully constructed. mGITR protein was expressed after the expression vectors pIRES2-EGFP-mGITR were transfected into COS-7 cells.%目的:构建小鼠GITR(mGITR)的真核表达载体,转染COS-7 细胞表达小鼠GITR 蛋白.方法:用TRIzol 试剂抽提小鼠脾细胞总RNA,经RT-PCR 扩增出GITR 全长基因,构建真核重组载体pIRES2-EGFP-mGITR,经鉴定后采用脂质体介导DNA 法转染COS-7 细胞.结果:从小鼠脾细胞中成功扩增得到GITR 全长基因.重组载体pIRES2-EGFP-mGITR 转染COS-7 细胞后,经荧光显微镜观察可见绿色荧光,提取蛋白后经蛋白质印迹鉴定有目的蛋白mGITR.结论:成功构建了小鼠GITR 基因的真核表达载体pIRES2-EGFP-mGITR,转染COS-7细胞后mGITR蛋白获得成功表达.【总页数】4页(P329-332)【作者】沈培;马斌;许化溪;王胜军;郑东;刘艳;田洁;赵银霞;刘青玲;朱晨露;马洁;苏兆亮【作者单位】江苏大学基础医学与医学技术学院免疫学研究室,江苏,镇江,212013;江苏大学基础医学与医学技术学院免疫学研究室,江苏,镇江,212013;江苏大学基础医学与医学技术学院免疫学研究室,江苏,镇江,212013;江苏大学基础医学与医学技术学院免疫学研究室,江苏,镇江,212013;江苏大学基础医学与医学技术学院免疫学研究室,江苏,镇江,212013;江苏大学基础医学与医学技术学院免疫学研究室,江苏,镇江,212013;江苏大学基础医学与医学技术学院免疫学研究室,江苏,镇江,212013;江苏大学基础医学与医学技术学院免疫学研究室,江苏,镇江,212013;江苏大学基础医学与医学技术学院免疫学研究室,江苏,镇江,212013;江苏大学基础医学与医学技术学院免疫学研究室,江苏,镇江,212013;江苏大学基础医学与医学技术学院免疫学研究室,江苏,镇江,212013;江苏大学基础医学与医学技术学院免疫学研究室,江苏,镇江,212013【正文语种】中文【中图分类】R393【相关文献】1.小鼠p27kip1真核表达载体的构建及其对单个核细胞周期的影响 [J], 祝巍;陈萍;赵海涛;孙丽2.粉尘螨变应原第2组分真核表达载体的构建及其在小鼠骨髓间充质干细胞中的表达 [J], 卞勇华;俞黎黎;黄思怡;史卫红;崔玉宝3.大鼠NeuroD2基因的克隆、真核表达载体的构建及其在小鼠MSCs细胞中的表达 [J], 姬菩忠;赵兴绪;秦文;宋学文;张勇;赵红斌4.小鼠PD-L1真核表达载体构建及其在树突状细胞中的表达 [J], 谭善峰;何相飞;王健明;王凯;宋斌;韦自卫;陶昱成;李文智5.小鼠arhgap39基因真核过表达载体的构建及其蛋白表达的初步研究 [J], 黄朝帅;冯东福因版权原因，仅展示原文概要，查看原文内容请购买。

汉坦病毒G1S0.7嵌合基因真核载体的构建及表达

汉坦病毒G1S0.7嵌合基因真核载体的构建及表达楚琰;徐志凯;李璞媛;李凯;胡刚;吴兴安;张芳琳;白文涛;张亮;王海涛【期刊名称】《科学技术与工程》【年(卷),期】2010(010)017【摘要】构建含汉坦病毒嵌合基因G1S0.7的真核重组质粒,并在真核细胞中有效表达.从本室前期构建并经测序的重组质粒pShuttle-G1S0.7上双酶切回收得到片段G1S0.7后,克隆入真核表达载体pVAX,并将其通过脂质体介导转染HEK293细胞,表达产物用ELISA和Western-blot进行鉴定.酶切鉴定结果表明,成功构建了含汉坦病毒嵌合基因G1S0.7的重组质粒pVAX-G1S0.7; ELISA检测结果和Western-blot结果显示,汉坦病毒G1S0.7嵌合基因在HEK293细胞中得到了表达,所表达的融合蛋白分子量约90kD,与预期大小一致,并且表达产物可与抗汉坦病毒NP mAb特异性结合.说明所构建的表达载体可在真核细胞中表达出与汉坦病毒抗体有特异性结合活性的融合蛋白,为下一步基因免疫及进一步筛选HFRS基因疫苗候选组分提供实验依据.【总页数】4页(P4121-4124)【作者】楚琰;徐志凯;李璞媛;李凯;胡刚;吴兴安;张芳琳;白文涛;张亮;王海涛【作者单位】第四军医大学微生物学与病原生物学教研室,西安,710032;第四军医大学微生物学与病原生物学教研室,西安,710032;第四军医大学微生物学与病原生物学教研室,西安,710032;第四军医大学微生物学与病原生物学教研室,西安,710032;第四军医大学微生物学与病原生物学教研室,西安,710032;第四军医大学微生物学与病原生物学教研室,西安,710032;第四军医大学微生物学与病原生物学教研室,西安,710032;第四军医大学微生物学与病原生物学教研室,西安,710032;第四军医大学微生物学与病原生物学教研室,西安,710032;第四军医大学微生物学与病原生物学教研室,西安,710032【正文语种】中文【中图分类】O782【相关文献】1.插入CpG序列的汉坦病毒S基因真核表达载体的构建及表达 [J], 郑兰艳;罗恩杰;李新鸣;牟玲;张小棠;鲁润铭2.结核分枝杆菌热休克蛋白65与汉坦病毒G2糖蛋白融合基因真核表达载体的构建与表达 [J], 黄浩;黄汉菊3.猪圆环病毒2型ORF2/猪白介素2(POIL-2)嵌合基因真核表达载体的构建、表达及在小鼠体内的免疫效果 [J], 贾松涛;闫若潜;崔保安;吴志明;张志凌;张健;赵雪丽4.汉坦病毒S基因真核表达载体的构建及表达 [J], 郑兰艳;史俊岩;吴云萍;毛艳斌;于笑难;牟玲;鲁润铭;罗恩杰5.汉坦病毒S基因真核表达载体的构建及在COS-7细胞中的瞬时表达 [J], 薛小平;徐志凯;马文煜;闫岩;张芳琳;尹文;吴兴安;白文涛因版权原因，仅展示原文概要，查看原文内容请购买。

重组人sCR1真核表达载体的构建表达及其生物学活性

重组人sCR1真核表达载体的构建、表达及其生物学活性【摘要】目的: 采纳酵母细胞分泌型载体pPIC9k表达人可溶性补体受体（sCR1）, 研究重组人sCR1融合蛋白的体外生物学活性。

方式: 从人外周血中提取总RNA, 应用RT PCR取得人sCR1全长cDNA, 然后将其克隆入毕赤酵母细胞分泌型表达载体pPIC9k中, 构建含人sCR1的重组质粒（pPIC9k sCR1）, 经测序鉴定正确, 电转化入毕赤酵母细胞SMD1168中, 将经G418抗性挑选出的重组sCR1酵母细胞株进行PCR鉴定, 经甲醇诱导, 表达产物经SDS PAGE分析和Western blot鉴定, 通过Ni2+NTA agarose亲和层析纯化后进行生物学活性鉴定。

结果: 取得毕赤酵母细胞分泌型表达载体pPIC9k sCR1, 经G418挑选及PCR鉴定取得高拷贝整合的重组酵母细胞株, 经甲醇诱导含pPIC9k sCR1的酵母SMD1168细胞表达出重组sCR1融合蛋白。

此蛋白在SDS PAGE上表现为Mr约31000的蛋白区带, 在Western blot分析中可被sCR1的CD35单克隆抗体（mAb）识别。

经Ni2+NTA agarose亲和层析纯化后取得较纯的sCR1融合蛋白及较高的生物学活性。

结论: 人sCR1融合蛋白在酵母细胞表达系统中的高水平表达, 而且有与人体天然蛋白相同的抗原性及其生物学活性。

【关键词】可溶性补体受体1 毕赤酵母细胞生物学活性真核表达载体补体受体1（complement receptor type l, CR1）又称C3b/C4b 受体, 在人白细胞表面被命名为CD35分子, 是最先定型的补体受体, 也是目前所知最重要的一种补体受体。

Weisman等[1]于1990年第一次研制出缺乏跨膜区和胞内区的可溶性补体受体1（soluble complement receptor type l, sCR1）是CR1细胞外片段。

Cpn0308真核表达载体的构建及对小鼠免疫功能的影响

化，以期为进一步研究Ｃｎ３８免疫保护性奠定基础。方法：ｐ００构建ｐＤＡ．／ｉＡＣｎ３８并用菌落ＰＲ、ｃＮ３１Ｈｓ —ｐ００，Ｃ双酶切、序列测定等多种技术确定其正确性；将重组质粒转染ＨＬｅａ细胞，间接免疫荧光法检测细胞内蛋白表达情况；重组质粒免疫ＢＬ／ＡＢｃ小鼠，一定时间后Ｗｅｔｒｂｔｓｎｌ检测血清Ｃｎ３８体特异性，ｅｏｐ００抗间接ＥＩＡ法检测小鼠血清中Ｃｎ３８ＩＧ抗体水平、ＬＳＬＳｐ００ｇＥＩＡ试剂盒检测ｍ清中细胞因子。结果：ｃＮ３１ＨｉＡ—ｐ００ｐＤＡ．／ｓＣｎ３８重组质粒构建成功且序列正确；重组质粒转染的ＨＬｅａ细胞胞浆观察到黄绿色荧光，对照组无荧光；组质粒组血清抗体Ａｘ± 重为０３３±００４ｐＤＡ．／ｉＡ质粒组为０１４± ．４．２，ｃＮ３１Ｈｓ．７００８ＰＳ为０１６± ．２，．１，Ｂ组．５００３ＷＢ结果显示重组质粒组小鼠血清稀释８０后仍有特异性目的条带出现，０倍对照组不出现；重组质粒组小鼠ＩＮ浓度均值为２４ｎ／，－Ｆ一６ｇＬ１４浓度均值为２ｇＬｐＤＡ．／ｉＡ质粒组为：Ｎ１０ｎ／，－１ｇＬ，Ｌ２ｎ／，ｅＮ３１ＨｓＩ一２ｇＬＩ４０ｎ／ＦＬ
ｎｅｔｄｂｙｕｉｇｍｏｅｕａｌｎｎｅｈｏｏｙ，ｔｅｒｎｓｅｔｄｉｔＬａｃｌｓＴｈｘｅｓｄｐｏｅｎｗａｄｎｉｅｙｉｉｅｔｉｃｅｓｎｌｃｌｒｃｏｉｇｔｃｎｌｇｈｎｔａｆｅｅｎｏＨｅｅｌ．ｅｅｐｒｓｅｒｔｉｓｉｅｔｆｄｂｎｄｒｃｍｍｕ・ｉ

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［2 ］
TV H 和 PMD18T双酶切含有轻重链嵌合基因的载体 PMD18V L 均为本室前期构建，用 DNA 电泳凝胶回收试剂盒回收目 neoM 和 pCIM 连接，的酶切产物后与经过同样酶切的 pCI14℃ 连接 16 h 后将连接产物进行转化。通过菌液 PCR 初步鉴定出阳性克隆后提取质粒，进一步通过双酶切验证阳性克 neoease2． 1cmv5vlIRESDHFRL22R 和 pCIease2． 1隆 pCIcmv5vhIRESDHFRL22R 送南京金斯瑞生物公司进行测序。 1． 2． 2 细胞培养和汉坦病毒 76 － 118 病毒株的扩增 CHOK1 细胞和 E6 细胞培养于 RPMI1640 培养基中( 含 100 mL / L 新生牛血清) ，每隔 2 d 换液。待细胞生长至培养瓶底 80% 汇合度时进行胰酶消化传代处理。汉坦病毒 76 － 118 病毒株的增殖采用乳鼠脑内扩增方法。取第 21 代感染乳鼠的脑组织，用含 20 mL / L 的新生牛血清的 RPMI1640 研磨成 100 g / L 的感染鼠脑悬液，反复冻融 3 次，于 4℃ 以 13 000 g / min 离心 30 min，取上清，过滤、分装，置－ 80℃ 冻存备用［4 － 5］。
［关键词］汉坦病毒; 人源化改造; 二氢叶酸还原酶; 真核表 K1 细胞达; CHO［中图分类号］ R392 ［文献标识码］ A
汉坦病毒( hantavirus，HV) 属于布尼亚病毒科汉坦病毒属，主要可引起肾综合征出血热 ( hemorrhagic fever with renal syndrome，HFRS ) 和汉坦病毒肺综合症( hantavirus pulmonary syndrome，HPS ) 等急性病毒性传染病，临床上 HFRS 以发热、出血和急性肾功能［1 ］损害为主要特征。中国是世界上 HFRS 疫情最严重的国家，主要表现在: 流行范围广、发病人数多、病死率高、传播途径多样等方面。临床上尚缺乏特异有效的治疗药物，因而更增加了 HFRS 防治任务的长期性和艰巨性。目前对 HFRS 的具体发病机制尚不清楚。据报道汉坦病毒主要在人血管内皮细胞和巨噬细胞内进行复制，具有中和活性的 mAb 可在体内外抑制或阻断病毒感染
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Nhe I 和 Mlu I 双酶切阳性克隆 pCIneoease2． 1cmv5vlIRESease2． 1cmv5vhIRESDHFRL22R 后 10 g / L DHFRL22R 和 pCI琼脂糖凝胶电泳分析 ( 图 1 ) : 嵌合抗体重链片段约1 400 bp，轻链片段约 700 bp 片段大小均与预期一致。测序结果显示嵌合抗体轻重链基因大培养后抽提质粒用紫外分 K1 细胞培养于 RPMI1640 培养基中，消光光度计定量。CHO化处理对数生长期的 CHO 细胞计数后铺 6 孔板，待细胞长满 90% 汇合度时加 1 mL 无抗生素和血清的培养基。每孔转染的细胞先加入 250 μL 无血清培养基然后再稀释表达载体各 10 μg 和 Lipofectamine TM 2000 4 μL，室温孵育 20 min，将 DNALipofectamine TM 2000 复合物直接加入各孔中，前后轻摇细胞 50 mL / L CO2 温箱培养 6 h 后除去复合物换板以混合。37℃ 、新鲜的含双抗和血清的 RPMI1640 培养基。 1． 2． 4 稳定高表达细胞株的筛选转染后 48 h 加入 600 μg / mL的 G418 ，待生长出细胞克隆并达到一定细胞数量后按每孔 1 000 个细胞接种 96 孔板，加入 300 mol / L 的 MTX，待细胞恢复生长后用夹心 ELISA 法检测抗体表达量，初步筛选出表达较高的细胞克隆。根据抗体表达量、细胞数以及细胞生长状态选取可继续进行第 2 次筛选的克隆，将细胞按每孔 1 个接种于 96 孔板中，形成细胞克隆后挑选单克隆或克隆数较少的孔进行检测，挑选出表达较高的孔继续按同样方法进行第 3 次克隆化培养，通过 ELISA 检测抗体表达量是否提高。 1． 2． 5 表达抗体的初步纯化将筛选出的高表达细胞株进行悬浮培养，收集无血清培养上清。把收集到的 200 mL 细胞上清，每 40 mL 上清使用 1 只 30 K 超滤管浓缩到 0． 2 mL 后 10 脱盐柱处理后使用共得到约 1 mL 的超滤产物。将其用 PD亲和色谱层析技术利用 Protein A HP Spin Trap 进行抗体纯化。 1． 2． 6 嵌合抗体的分子量分析采用还原和非还原 SDSPAGE 和还原和非还原 Western blot 鉴定初步纯化的表达抗体的大小。收集的纯化后的抗体用 100 g / L 的分离胶做 SDSPAGE，每孔上样量为 15 μL，然后转移至 NC 膜。用 50 g / L 的脱脂牛奶室温封闭 1 h，TBST 漂洗膜 3 次，每次 10 min，加入 1∶200 稀释的山羊抗人 IgG，4℃ 过夜，TBST 漂洗膜 3 次，每次 10 min，然后加入 1∶10 000 稀释的 IRDye 标记小鼠抗山羊红外二抗，室温避光作用 1 h，TBS 漂洗膜 5 次，每次 5 min，用 Odyssey 红外荧光扫描成像系统扫描分析。 1． 2． 7 嵌合抗体的中和活性检测以汉坦病毒 76 － 118 株 E6 细胞种入 96 孔板，培养 1 d 至作为攻击病毒，将 Vero90% 汇合度。用含 100 mL / L 新生牛血清的 RPMI1640 稀释病毒后，将之分别与我室前期制备的抗汉坦病毒鼠源性 mAb 3G1 ( 阳性对照 ) 、抗汉坦病毒鼠源性 mAb 1A8 ( 无关对照 ) 、超滤后的培养液( 阴性对照) 、超滤后的培养上清( 待检样品 ) 等体积混合后 37℃ 孵育 1 h。将孵育后的混合液分别接种到 37℃ 孵育 1 h。同时设置正常细胞作培养好的 E6 细胞单层，为未感染组对照。用微量移液器将每孔的混合液吸弃，加入 200 μL 温育好的 RPMI1640 培养液继续培养，每隔 3 d 换液 1 次。在第 10 天将 96 孔板在－ 80℃ 和 37℃ 交替冻融 3 次取裂解上清用前 1 d 已包被 1A8 抗体的酶标板进行 ELISA 检测。
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ISSN1007 － 8738 细胞与分子免疫学杂志( Chin J Cell Mol Immunol) 2012 ， 28 ( 5 )
文章编号: 1007 － 8738 ( 2012 ) 05 － 0506 － 04
抗汉坦病毒鼠 / 人嵌合抗体真核表达载体的构建及表达
本研究拟在此基础上，应用基因重组技术，构建表达抗汉坦病毒鼠 / 人嵌合抗体，旨在降低鼠源单抗的免疫原性、延长抗体在体内的半衰期，为更安全有效的治疗 HFRS 奠定基础。 1
1． 1
材料和方法
材料 T4 DNA 连接酶、限制性内切酶、DNA 电泳凝胶
回收试剂盒、小量质粒提取试剂盒均购于大连 TaKaRa 公司; MTX 和生化试剂均为国产分析纯试剂购于西安晨诺公司; 无血清培养基购于北京清大天一公司; RPMI1640 培养基购自 Gibco 公司; 新生牛血清购于杭州四季青公司; G418 购于 Calbiochem 公司; Lipofectamine TM 2000 试剂购于 Invitrogen 公 15 司; 脱脂奶粉购于博士德公司; 30 K 超滤管 ( Amicon UltraCentrifugal Filter ) 、NC 膜购于 Millipore 公司; Protein A HP Spin Trap 纯化试剂购于 GE 公司。抗汉坦病毒小鼠源性 mAb 3G1 、 1A8 为本实验室前期制备; 山羊抗人 IgG mAb、HRP 标记的山羊抗人 IgG 购于北京鼎国公司; IRDye 标记的小鼠抗 COR 公司。菌种和质粒: 真核表达载山羊红外二抗购自 LIneoM 和 pCIM 质粒为本室改构的高效表达载体。体为 pCIT 载体为本室前期构含有 3G1鼠 / 人嵌合抗体基因的 PMD18建。中国仓鼠二氢叶酸还原酶( DHFR) 基因为本室前期保存。 K1 细胞、E6 细胞为本实验室保存，汉细胞和病毒株: CHO坦病毒 76 － 118 株为本实验室保存。 1． 2 1． 2． 1 方法鼠 / 人嵌合抗体基因的构建首先利用 Nhe I 和 Mlu I
K1 ) 中获得稳定、高效表达，体，在中国仓鼠卵巢细胞( CHO并对其生物学活性进行初步鉴定。方法: 利用基因重组技术 T将本室前期构建的含有轻、重链嵌合基因的载体 PMD18TVL 双酶切获得重链、轻链基因后，克隆到前 VH 和 PMD18neoM 中，用脂质体法转染期改构的高效真核表达载体 pCIK1 细胞，在 G418 和氨甲喋呤 ( MTX ) 双筛选压野生型 CHO力下筛选稳定高效表达细胞株，ELISA 方法检测重组蛋白的表达，用 Protein A HP Spin Trap 纯化目的蛋白后进行 SDSPAGE 和 Western blot 法检测，并通过体外中和实验检测其中和活性。结果: 成功构建了抗汉坦病毒鼠 / 人嵌合抗体真核表 K1 细胞后经过 3 轮亚克隆筛选获得稳定达载体，转染 CHO表达抗汉坦病毒鼠 / 人嵌合抗体的细胞系，表达量约为 1 mg / L， SDSPAGE 和 Western blot 法检测到目的蛋白的表达，微量细胞中和实验检测其中和活性，与亲本单克隆抗体( mAb ) 的中 K1 细和活性相近。结论: 抗汉坦病毒鼠 / 人嵌合抗体在 CHO胞中成功表达，并具有良好的中和活性，为该抗体进一步的实验研究和临床应用奠定了基础。