彗星实验

水稻植株彗星实验步骤
通过将Singh和Gichner等人建立的碱性彗星实验方案应用于水稻（Oryza sativa L.）来确定原发性DNA损伤。

所有的实验步骤都是在冰床上避光进行的。

1、对于每一盆水稻，取鲜叶0.1 g，用刀片切碎，加入2个100 μL装有三羟甲基氨基甲烷盐酸提取缓冲液（Tris-HCl提取液，0.1 M，pH=7.5，4℃保存）的离心管中；
2、每个离心管中取75 μL含细胞核样本添加到150 μL低熔点琼脂糖凝胶（LMPA，1%）中，混合；
3、取75 μL上述混合物，沉积在用正常熔点琼脂糖凝胶（NMPA，1%）制备的载玻片上，然后盖上盖玻片；
4、重复步骤3，每个样品制备3张载玻片，4℃保存15min；
5、在载玻片上添加一层LMPA以保护含有核的凝胶层；
6、将载玻片置于含有强碱性缓冲液（0.3 M NAOH和1 M EDTA，pH＞13）的电泳槽中浸泡15 min，诱导DNA的展开和变性；
7、电泳，电压为25 V，电流为30 mA，持续5 min，将DNA片段从未受损的DNA链中分离出来，温度4℃，避光；
8、观察载玻片，每张载玻片分析30个核，利用连接到图像分析系统的摄像机对彗星进行了检测，并利用图像软件分析；
9、彗星尾部端点强度（TI）与DNA损伤水平呈线性关系。

彗星实验步骤范文彗星是一种天体现象，指的是在太阳系内绕太阳运行的一类小天体。

彗星的核心主要由冰和岩石组成，当与太阳接近时，晶体冰会热化并以气体形态释放出来，形成彗尾。

彗星实验可以帮助我们更好地理解彗星的形成和性质。

以下是彗星实验的步骤：材料：-一块冰块-一盆水-一小束干冰-一台射灯或强力手电筒-一个黑暗的室内或夜晚的户外空间步骤1：准备冰块和水在一盆水中放入一块冰块，确保冰块完全浸泡在水中。

这样可以模拟太阳系中的彗核。

步骤2：制作彗尾将一小束干冰放在碗中或任何合适的容器中。

干冰是固态二氧化碳，具有非常低的温度，当它接触到周围的空气时，会迅速蒸发并形成气体。

这模拟了彗星接近太阳时晶体冰的热化过程。

确保干冰不会直接接触到水。

步骤3：创建黑暗环境将彗星模型置于黑暗的室内或夜晚的户外空间中。

这样可以让彗尾更加清晰可见。

步骤4：使用射灯或手电筒将射灯或强力手电筒对准盆中的冰块，并打开它。

这样可以模拟太阳的辐射对彗核的加热作用。

步骤5：观察彗尾的形成当射灯或手电筒照射到冰块上时，干冰会迅速蒸发，并产生一道透明或白色的气体云。

这个气体云模拟了彗尾的形成，它会围绕彗核散开。

步骤6：测量和记录使用测量工具可以测量彗核的直径，以及彗尾的长度和宽度。

同时，记录彗尾的颜色和形态。

步骤7：改变实验条件尝试改变冰块的形状、大小和温度等条件，观察和记录彗尾的变化。

这有助于了解不同条件对彗尾的影响。

步骤8：分析和总结根据观察和记录的数据，分析彗尾的形成和特征。

比较不同实验条件下彗尾的差异，并总结出彗尾的性质和形成机制。

总结：通过这个实验，我们可以更好地理解彗星的形成和性质。

彗尾的形成是由彗核受到太阳辐射的加热而导致晶体冰热化释放出来的气体所形成的。

实验中可以通过改变不同的条件，观察和比较彗尾的差异，更深入地了解彗尾的形成机制。

此外，实验还可以帮助我们理解彗星的形态特征，如彗核的大小、彗尾的长度和宽度等。

在实验的基础上，我们可以进行更深入的研究，以便更好地了解和探索太阳系中的彗星现象。

1、凋亡细胞的观察：看过国外此法作出的凋亡细胞彗星图像，很漂亮，用CASP软件分析后，其曲线呈典型的双峰，而正常细胞为单峰。

我的一些教训：观察凋亡细胞最好把电压、电流、和电泳时间均调低，否则，凋亡细胞中的DNA片断跑的太块，荧光下根本看不到凋亡细胞的尾巴。

注：我用的是中性条件，20V，200mA,20min, 凋亡细胞观察宜选用10V,100mA,10min。

朋友们如果有异议，请不吝赐教，也对我有所帮助。

2、解旋20分钟应该没问题，但是我认为您的电泳时间过长，当然我不知道您的电泳条件（电压、电流、），我认为20分钟足够了，时间长了一是浪费时间，二是彗星图像不好，不利于分析。

您的裂解时间有点短了，文献报道，最好不要少于1.5小时3、一般100ul0.5％低熔点胶中含400个细胞就足够了4、本版【图片仓库】子版有我做的彗星图像，感兴趣可以看看/bbs/post/view?bid=66&id=2729243&sty=1&tpg=1&ag e=05、注意，CASP只读.tif扩展名的图像，如果你的相机拍摄的图像可以有.tif 格式，就更好了，如果是.jpg格式，那还要在计算机中转换一下，不过很简单6、首先，荧光染色的东西最好马上看，否则影响结果。

其次，您的染色液量我觉得多了点，我用2ug/ml，1ml注射器1滴就可以。

第三，要忠于实验结果，图象内容不能更改，可以用ACDSEE或PHOTOSHOP 转换图象格式或大小，所以，作出来的实验图象质量要好7、。

背景的选择问题，如果图片质量好的话，背景大小不同，对结果影响不是很大，如果图片背景乱七八糟，那背景框的选择肯定对结果产生很大影响。

我的建议：背景框不要太大，参考我贴的那个图。

注意，背景框可以在细胞的上面或下面，如果背景框在上面时，分析后的图像（分析后出现一个头、尾分明的图像，是基本重合在细胞上的）质量很差，很不规则，那再把背景框调到下面试试，如果还是不好，那只能说你的结果质量不好了。

彗星实验(Comet assay),又称单细胞凝胶电泳(Single cell gel electrophoresis，SCGE),各种理化因子作用细胞后引起的DNA链的断裂可用该方法检测[1～3]，并在统计学基础上对损伤程度做出评估[4]。

本实验对Singh 等[5]建立的碱性彗星实验的一些步骤作了改良。

用超净工作台上的紫外消毒灯[可发射波长为254 nm的紫外线(Ultraviolet，UV)，属于UVC波段范围]作为DNA损伤的诱导因子[7～9]，诱导K562细胞DNA损伤，用改良彗星实验检测损伤程度，验证改良的实验系统是否可靠，同时筛选并评价DNA损伤的分析指标。

1 材料与方法1.1 细胞K562细胞，来源于第四军医大学免疫学教研室，37 ℃、5％ CO2培养箱中培养，取对数期细胞进行实验。

1.2 紫外线照射装置紫外消毒灯(ZSZ-20型，20 W，天津市紫晶特种光源有限公司)。

1.3 主要试剂和仪器培养基：10％新生牛血清(杭州四季青公司)，90％RPMI-1640培养液(Hyclone公司)；双抗(青、链霉素，100 UI/ml)；TritonX-100(Genview分装)；二甲基亚砜、肌苷酸钠(Sigma分装)；低熔点琼脂糖(FMC 分装)；常熔点琼脂糖(Spanish分装)。

其余生化试剂均为分析纯。

电泳仪：由西北大学物理系提供；电泳槽：DYC33A型(北京市六一仪器厂)；显微镜：Leica DM LB 2 (Leica 公司)；彗星图象分析软件：CASP软件(casp-1.2.21.4 实验分组及UV处理收集对数生长的K562细胞，台盼蓝染色计数，细胞活力大于95％，用Hank's(pH7.4)调整细胞密度至1×105/ml，接种于塑料培养皿中(ф=35 mm，2 ml/plate)，然后进行紫外线照射(0.3 mW/cm2)。

实验分为对照组和8个照射组，各照射组分别照射3、5、10、40，60、120、180、240 s，对照组不进行紫外线照射，之后进行彗星实验。

附件15体内彗星试验In Vivo Mammalian Alkaline Comet Assay1 范围本规范确定了体内彗星试验的基本原则、要求和方法。

本规范适用于化妆品原料的遗传毒性检测。

2 试验目的评价化妆品用原料的遗传毒性。

3 定义3.1 碱性单细胞凝胶电泳：在单个细胞或细胞核水平检测DNA损伤的一种敏感技术。

3.2 彗星：经过电泳后细胞核的形状，形似彗星。

细胞核部分形成彗星头部，在电场力的作用下脱离细胞核的DNA片断形成彗尾。

3.3 “刺猬状”细胞：显微图像下由小或模糊不清的头以及大的弥漫性尾组成的细胞。

3.4 尾部DNA含量：反应总强度（彗头与彗尾之和）中彗星的强度。

可反应DNA片断的数量，用百分比表示。

3.5 最大耐受剂量：试验期内引起动物产生轻微毒性效应的最高剂量，在这个剂量下，动物产生明显的临床体征，如异常行为或反应，轻微的体重下降或靶组织细胞毒性，但是并不会引起死亡或痛苦。

4 试验原理DNA双螺旋结构在强碱性溶液中（pH>13）会松弛，在电场力的作用下，正常的DNA 保留在原位不动，而单链或双链DNA断裂所形成的DNA片断在会向阳极移动，形成彗星状。

DNA片断所形成的彗星状拖尾的长度及强度可以反应DNA片断的大小和数量。

通过检测尾部DNA含量（%）等终点指标可以评价DNA损伤程度。

5 试验基本原则动物染毒一定时间后处死并解剖动物，获取靶器官，制备单细胞悬液。

单细胞悬液与琼脂糖混合后经过裂解过程去除细胞膜，并暴露于强碱性溶液（pH>13）中进行DNA解旋，经过电泳、固定、染色，在荧光显微镜下观察，通过分析软件对彗星状细胞进行分析，判定DNA损伤程度。

每个样品需分析足够数量的细胞进行最终结果评价。

6 溶液的配制（所有溶液均现用现配）6.1 0.5%(w/v) 低熔点凝胶低熔点胶以0.5%(w/v)的浓度溶于D-PBS（无Ca2+、Mg2+和酚红）溶液中，并利用微波炉加热。

单细胞凝胶电泳分析法单细胞凝胶电泳分析法(彗星分析法)治愈癌症是一个难题,长期以来科学家们一直在苦苦探索.我们目前知道,致癌的过程与许多因素有关，但如果我们能阻止其中的任何一个步骤，癌细胞便无法形成。

因此,探测致癌物质的技术与癌细胞的及时发现就显得尤其重要！然而截至目前为止，科学家们仍无法研究出一种简易基因测试法或综合的方法来检测出可能的致癌物。

因此，致癌物对ＤＮＡ的作用仍是癌症研究的一个重要课题。

遗传毒物学为一专门研究化学及各类物质对人体遗传基因影响的科学。

人体每天暴露在大量的化学物质当中，为了诊测这些物质对人体ＤＮＡ的影响，科学家们发明了多种测定方法，然而，多年来人们所使用的这些测试方法却不能准确与快速的辨识出会使人体致癌的物质。

为了解决这些问题，单细胞凝胶电泳法（Single Cell Gel Assay）应运而生，通常亦称之彗星分析法（Comet Assay）。

它之所以称为彗星分析法是因为被破坏的DNA形似彗星，此方法已被证实是最具敏感性又最具快速性的方法。

研究人员使用这种方法可在２４小时内获得初步结果，在十天之内能得到结论性的证据。

此种测定方法速度远快于其它方法，不仅可以测出某种物质是否是致癌物，而且还可测出被破坏细胞的损害程度。

彗星分析法是用来判别某种物质是否是致癌物，并衡量其对人体ＤＮＡ修补的影响程度，这一分析过程是将健康的人体白血球接触于被测试的物质后，然后再用彗星分析法来进行测试，如果被测试的物质是致癌物质，那么ＤＮＡ将被破坏，而被损坏的ＤＮＡ将开始游离细胞核，形成彗星形状。

ＤＮＡ受到致癌物质的损坏愈大，ＤＮＡ碎段就愈多，愈小的ＤＮＡ碎段游离的速度就愈快，也游离愈远，因而形成了彗星的尾部，而较大的一些碎段位置则靠近细胞核，因而形成彗星的头部。

ＤＮＡ碎段的游动的程度不同 使它呈现出彗星状，使研究人员能很容易看清细胞的损害程，彗星的长度与ＤＮＡ的损害程度有关，此长度是指从细胞核到彗星尾端的距离，也就是说，彗星尾端愈长，细胞的损害程度愈大。

彗星实验收集目标细胞：处死小鼠后，迅速分离肝脏，选取最左叶肝脏，在4℃放置2h的PBS溶液中多次清洗，直至看不到血液。

将肝组织至于含有2 mL4℃PBS 溶液的小烧杯中，用小剪刀剪碎（2-3 mm）。

台盼蓝排斥法检测细胞活力，细胞存活率大于95%方可用于实验，调整细胞密度为5×105-106个/ml。

此步在暗室中进行。

制片：取100 μL置于45℃预热的0.75% NMA滴加于载玻片一侧，迅速盖上盖玻片（24 mm×50 mm），注意不要产生气泡，至4 ℃凝固约20分钟后轻轻移去盖玻片。

吸取10 μL待检测的细胞悬液与100 μL 37℃预热的0.75% LMA混匀，迅速将细胞混悬液滴加到第一层凝固的NMA上，再迅速盖上盖玻片使其均匀铺开，同样需避免起泡。

将玻片至4℃凝固约30 min，操作注意避光，每只动物制作三张平行片。

裂解：轻轻移去盖玻片，将载玻片水平轻缓浸入4℃预冷的裂解液（pH= 10），于4℃避光放置1 h。

解旋：轻轻拿出载玻片，浸入PBS缓冲液5 min，用滤纸吸去多余水分后放入电泳槽。

玻片并列放置，不留空隙。

将新鲜配置的冰冷电泳缓冲应用液轻轻倒入电泳槽，使液面完全覆盖载玻片，放置20 min解旋。

避光进行。

电泳：根据预实验，设置电泳仪25V、300 mA电泳20 min。

避光进行。

中和：切断电源，小心取出玻片，置染缸，中和缓冲液浸洗，3次×5 min/次。

脱水保存：从电泳仪中轻轻取出载玻片，浸入PBS缓冲液2次×5 min/次。

吸干周围水分后放入乙醇脱水，约1 h后取出自然晾干保存。

染色：在玻片上滴加EB染色液50 μL（5 μg/mL）染色，盖上新盖玻片。

用滤纸吸去多余染料，于2 h内使用荧光显微镜镜检。

镜检：EB染色后，未受损细胞在镜下表现为为圆形荧光核心，只有彗星头部，没有明显的尾。

受损细胞则有彗星尾伸向正极，形成一个亮的头部和尾部，形似彗星。

彗星实验(Comet assay),又称单细胞凝胶电泳(Single cell gel electrophoresis，SCGE),各种理化因子作用细胞后引起的DNA链的断裂可用该方法检测[1～3]，并在统计学基础上对损伤程度做出评估[4]。

本实验对Singh 等[5]建立的碱性彗星实验的一些步骤作了改良。

用超净工作台上的紫外消毒灯[可发射波长为254 nm的紫外线(Ultraviolet，UV)，属于UVC波段范围]作为DNA损伤的诱导因子[7～9]，诱导K562细胞DNA损伤，用改良彗星实验检测损伤程度，验证改良的实验系统是否可靠，同时筛选并评价DNA损伤的分析指标。

1 材料与方法1.1 细胞K562细胞，来源于第四军医大学免疫学教研室，37 ℃、5％ CO2培养箱中培养，取对数期细胞进行实验。

1.2 紫外线照射装置紫外消毒灯(ZSZ-20型，20 W，天津市紫晶特种光源有限公司)。

1.3 主要试剂和仪器培养基：10％新生牛血清(杭州四季青公司)，90％RPMI-1640培养液(Hyclone公司)；双抗(青、链霉素，100 UI/ml)；TritonX-100(Genview分装)；二甲基亚砜、肌苷酸钠(Sigma分装)；低熔点琼脂糖(FMC 分装)；常熔点琼脂糖(Spanish分装)。

其余生化试剂均为分析纯。

电泳仪：由西北大学物理系提供；电泳槽：DYC33A型(北京市六一仪器厂)；显微镜：Leica DM LB 2 (Leica 公司)；彗星图象分析软件：CASP软件(casp-1.2.2，/index.php下载)；CO2培养箱：BB16HF型(上海力申科学仪器有限公司)；环地牌紫外辐照计(北京师范大学光电仪器厂)。

1.4 实验分组及UV处理收集对数生长的K562细胞，台盼蓝染色计数，细胞活力大于95％，用Hank's(pH7.4)调整细胞密度至1×105/ml，接种于塑料培养皿中(ф=35 mm，2 ml/plate)，然后进行紫外线照射(0.3 mW/cm2)。

彗星实验所用试剂的配制2. pH=7.5, 0.4 M Tris ：配100 mL 需Tris 4.8456 g ，ddH 2O 80 mL，调节pH=7.5后定容至100 mL 。

5. 细胞裂解液（4℃保存）：2.5 M NaCl ；100 mM Na 2EDTA ；10 mM Tris ，调pH=10；1%肌氨酸钠；临用前加1%Triton 不好溶，需要少量缓慢溶解，临用时加Triton X-100 5 mL ；DMSO 50 mL6. 0.8%正常熔点琼脂糖：配50 mL ，需NMA 0.4 g ，用PBS 配制。

7.8. 配制EB 溶液称取95%EB0.0106 g ，于10 mL 容量瓶中定容，即配成1007 mg/L 母液，稀释10倍成100.7 mg/L 的EB 液。

吸取1.3 mL 的100.7 mg/L 的EB 液于10 mL 容量瓶定容，即配得13.09 mg/L 的EB 使用液。

9. 电泳缓冲液1 mM Na 2EDTA 和300 mM NaOH ，调pH>13，临用前将两种溶液等体积混合（预冷使用）。

1 mM Na 2EDTA ：称取0.0752 g Na 2EDTA 使用双蒸水溶解并定容至200 mL 。

（最好配500ml ）300 mM NaOH ：称取2.5 g NaOH ，用ddH 2O 溶解并定容至200 mL 。

（最好配500ml ）四、彗星实验步骤：7、在60℃下，铺上第一层0.8% NMA 150ul，迅速盖上盖玻片，置室温下20min，使琼脂固化。

8、轻轻移开第一层盖玻片，在37℃下，将约10，000-500，000个（30，000-200，000理想）的悬于10ul PBS中的受检细胞与100ul 1.0% LMA 充分吹打混匀，迅速将细胞悬液滴到第一层胶上，尽量铺薄。

盖上盖玻片让其均匀铺开，置4℃15min，使琼脂固化。

9、在37℃下，移开第二层盖玻片，将50ul 0.5% LMA作为第三层，滴加在第二层含有细胞的琼脂上。

Comet Assay 彗星分析系统软件功能:彗星试验-单细胞凝胶电泳Single cell gel electrophoresis是一种快捷、高灵敏度的检测DNA受损的方法.Comet Assay 专业彗星试验图像分析软件,提供专业快速的测量方法。

测量指标包括头半径，尾长度，积分光密度，头/尾DNA含量比例，尾矩，Olive 矩等多种参数。

具有自动或手动调节分割彗星头部和尾部功能同时提供对双染色系统的分析系统可广泛用于环境毒理学中对DNA具有损伤作用的分析：如紫外光、电离辐射、氧自由基等因素造成的DNA损伤。

以及细胞凋亡，抗癌药物的药物毒理学研究，遗传毒理研究和肿瘤治疗的跟踪监测等单细胞凝胶电泳(彗星试验):原理、应用和局限性彗星试验：原理、应用和局限性1. 前言过去十年中，彗星试验或单细胞凝胶电泳（SCGE）已成为一个评定DNA损伤的标准方法，广泛应用于遗传毒性试验、人类生物监测和分子流行病学、生态毒理学以及DNA损伤修复的基础研究，且因其简单、灵敏、多功能、快速、经济实用而赢得了广大科研工作者的青睐，和其有关的文献数目逐年上升。

在应用彗星试验时不会过多去考虑它如何运作和它提供何种信息，因为它在论证DNA损伤中的成功已足以证明它的价值。

这一点实在太可惜，因为它不仅能告诉我们细胞内存在的损伤的类型，而且能告诉我们损伤的程度。

尽管彗星试验是检测DN A断裂的基本方法，但由于对特异性核酸内切酶损伤的引入使其可以检测紫外线诱导的嘧啶二聚体，氧化碱基和烷基化损伤。

2.检测原理和检测指标2.1 背景二十世纪七十年代，Peter Cook和其同事们制定了一种用非离子去污剂使细胞溶解来研究核结构的方法。

这种处理除去胞膜、胞质和核质，并使核小体破裂（几乎所有的组蛋白均被浓盐提取），剩下的就是由核基质或RNA、蛋白质组成的支架以及DNA所构成的类核，其DNA的双螺旋以核小体的组蛋白为核心形成负超螺旋结构。

超螺旋的存在使DNA不能自由旋转，Cook 等提出一个模型，DNA间断的附加于基质，有效的形成一系列环状、而不是线性分子。