彗星实验原理和方法

小学科学教科版六年级下册高效课堂资料《太阳系》资料彗星彗星(Comet)，是进入太阳系内亮度和形状会随日距变化而变化的绕日运动的天体，彗星物质蒸发，在冰核周围形成朦胧的彗发和一条稀薄物质流构成的彗尾。

由于太阳风的压力，彗尾总是指向背离太阳的方向。

2014年2月21日，日本京都产业大学的研究小组发现彗星上有氨的存在。

根据最新报道称:科学家们近日在追踪"67P/楚留莫夫-格拉希门克"彗星的罗塞塔号飞行器上发现了属于该彗星的一些化学残留物。

科学家使用探测器对这些化学物质进行分析后，发现其主要成份为氨、甲烷、硫化氢、氰化氢和甲醛。

由此，科学家得出结论称，彗星的气味闻起来像是臭鸡蛋、马尿、酒精和苦杏仁的气味综合。

彗星是星际间物质，英文是Comet，是由希腊文演变而来的，意思是“尾巴”或“毛发”，也有‘长发星’的含义。

而中文的“彗”字，则是“扫帚”的意思。

在《天文略论》这本书中写道：彗星为怪异之星，有首有尾。

人们往把战争、瘟疫等灾难归罪于彗星的出现，但这是毫无科学根据的。

《春秋》记载，公元前613年，“有星孛入于北斗”，这是世界上公认的首次关于哈雷彗星的确切记录，比欧洲早630多年。

虽然彗星威力巨大，但撞击地球的可能性是微乎其微的。

[1] 彗星的轨道周期范围很大，可以从几年到几十万年。

短周期彗星来自超越至海王星轨道之外的柯伊伯带，或是与离散盘有所关联。

长周期彗星被认为起源于太阳系外缘，迄今仍是虚拟的球壳状的奥尔特云。

长周期彗星可能是受到太阳系外侧的大质量行星（木星、土星、天王星、和海王星），或是恒星经过时的引力摄动，而朝向太阳前进。

罕见的以双曲线轨迹进入内太阳系的彗星，是之前被抛入星际空间的，则只会穿越太阳系一次。

来自太阳系外，在银河系内可能是常见的系外彗星也曾经被检测到。

彗星和小行星的区别只是有无彗发或彗尾的存在。

然而，熄火彗星已经经过太阳许多次，几乎失去了它们所有的可挥发的冰和尘埃，因而可能就变得和小的小行星一样。

应用慧星试验研究细胞D NA损伤的原理与方法山西大学生命科学系环境生物毒理学研究室(太原030006)　孟紫强中国辐射防护研究院二所　张连珍 提　要　对应用慧星试验(即单细胞微凝胶电泳(SCGE技术)研究细胞DNA损伤的操作过程、技术原理以及实验操作过程中应注意的事项,进行了详细介绍和讨论。

关键词　慧星试验　单细胞微凝脉电泳　DNA损伤　哺乳类细胞　淋巴细胞 诱变剂往往是通过引起DNA损伤而诱发细胞突变和癌变。

近年来由Singh等改进和建立的慧星试验(Com et assay)即单细胞微凝胶电泳(SCGE)技术,是一项测定和研究细胞DNA损伤的新技术,该技术在国外有关研究领域内已得到广泛的应用〔1,2〕。

但在我国有关研究报道甚少。

为此,本文对我们研究室建立和改进的SCGE技术作了详细报道,以期与国内同行交流和进一步改进。

1　SCGE测定原理哺乳类细胞和人血淋巴细胞,其DNA的分子量很高且具有严密的超螺旋结构。

在理想的实验条件下,对淋巴细胞的分离、处埋、裂解、碱处理等过程均保持在避光条件下小心谨慎地操作,使细胞DNA不受损伤,其DNA结构仍象在活细胞中那样完整,外加电泳电场就不会使DNA在凝胶中泳动。

因此,在理想条件下,正常对照组细胞DNA在电泳之后仍应保持在原来位置。

在SCGE实验中,细胞DNA之所以从原位向电泳电场的阳极迁移,形成慧星状图象,其原因是:当细胞DNA受损伤产生链断裂时,DNA的超螺旋结构受到破坏;在细胞裂解液作用下,细胞膜、核膜及其它膜结构受到破坏,细胞内的蛋白质、RNA及其它成分均可进入凝胶而扩散到裂解液中,而核DNA分子量很高不能进入凝胶,只能留在原位。

在碱处理和碱性电泳液的作用下DNA解螺旋,使DNA的断链和碱易变性DNA片断从严密的超螺旋结构中释放出来;由于这些DNA断链分子量较小且碱变性为单链,所以在电泳电场中就可以离开核DNA在凝胶分子筛中向阳极移动,形成慧星状图象。

彗星实验(Comet assay),又称单细胞凝胶电泳(Single cell gel electrophoresis，SCGE),各种理化因子作用细胞后引起的DNA链的断裂可用该方法检测[1～3]，并在统计学基础上对损伤程度做出评估[4]。

本实验对Singh 等[5]建立的碱性彗星实验的一些步骤作了改良。

用超净工作台上的紫外消毒灯[可发射波长为254 nm的紫外线(Ultraviolet，UV)，属于UVC波段范围]作为DNA损伤的诱导因子[7～9]，诱导K562细胞DNA损伤，用改良彗星实验检测损伤程度，验证改良的实验系统是否可靠，同时筛选并评价DNA损伤的分析指标。

1 材料与方法1.1 细胞K562细胞，来源于第四军医大学免疫学教研室，37 ℃、5％ CO2培养箱中培养，取对数期细胞进行实验。

1.2 紫外线照射装置紫外消毒灯(ZSZ-20型，20 W，天津市紫晶特种光源有限公司)。

1.3 主要试剂和仪器培养基：10％新生牛血清(杭州四季青公司)，90％RPMI-1640培养液(Hyclone公司)；双抗(青、链霉素，100 UI/ml)；TritonX-100(Genview分装)；二甲基亚砜、肌苷酸钠(Sigma分装)；低熔点琼脂糖(FMC 分装)；常熔点琼脂糖(Spanish分装)。

其余生化试剂均为分析纯。

电泳仪：由西北大学物理系提供；电泳槽：DYC33A型(北京市六一仪器厂)；显微镜：Leica DM LB 2 (Leica 公司)；彗星图象分析软件：CASP软件(casp-1.2.21.4 实验分组及UV处理收集对数生长的K562细胞，台盼蓝染色计数，细胞活力大于95％，用Hank's(pH7.4)调整细胞密度至1×105/ml，接种于塑料培养皿中(ф=35 mm，2 ml/plate)，然后进行紫外线照射(0.3 mW/cm2)。

实验分为对照组和8个照射组，各照射组分别照射3、5、10、40，60、120、180、240 s，对照组不进行紫外线照射，之后进行彗星实验。

彗星实验技术在不同细胞DNA损伤检测中的应用作者：陈果李晔来源：《中国高新技术企业》2016年第06期摘要：文章对彗星实验在不同真核生物细胞DNA损伤中的应用进行了总结，并介绍了基于彗星实验对植物、动物、人体细胞损伤的研究成果，同时也对彗星实验的应用范围、发展趋势和前景做出了展望。

关键词：彗星实验技术；DNA损伤；真核细胞；损伤检测；遗传毒理问题文献标识码：A中图分类号：Q523 文章编号：1009-2374（2016）06-0055-03 DOI：10.13535/ki.11-4406/n.2016.06.028随着经济的快速发展、城市化进程加快，环境问题成为人们日益关注的热点问题。

工业三废、电离辐射、化学农药等有毒有害物质对生物界造成了极大的危害，它们不但影响生物的生命活动，而且会影响下一代的遗传性状。

因此，研究DNA损伤等遗传毒理问题对于环境安全评价具有重要的意义。

目前，DNA损伤的检测方法可以分为间接检测DNA损伤和直接检测DNA损伤。

彗星实验是直接检测DNA损伤的一种方法，也称单细胞凝胶电泳，1984年由Ostling建立，经Singh 等改进。

该检测方法具有灵敏度高、所需样品量少、应用范围广、材料消耗少、技术简单、时间短、可进行单细胞水平的原位检测等特点，被广泛地应用于真核细胞的DNA损伤与修复、遗传毒理、环境监测以及氧化应激和细胞凋亡等相关研究中。

目前关于彗星实验技术的应用进展大多从其应用领域、范围着手，一定意义上限制了彗星实验在细胞层面上的科学意义以及更宽泛的应用前景。

文章从细胞角度切入，归纳总结近些年真核细胞作为彗星实验在应用发展过程中所存在的问题，并就其发展提出发展畅想。

1 彗星实验彗星实验原理是细胞经过实验中裂解、DNA解链等过程后，电泳时损伤的DNA从核中溢出，朝阳极方向泳动，产生一个尾状带，未损伤的DNA部分保持球形，二者共同形成“彗星”。

在一定范围内，“彗星”的长度（代表DNA迁移距离）和经荧光染色后“彗星”荧光强度与DNA损伤程度相关，这样就可以定量检测单个细胞中的DNA损伤。

彗星实验(英语版)彗星”分析法在放射生物学中的应用来源：广东医学杂志点击数：196 更新时间：2007-4-25 文章录入：Admin“彗星”分析法在放射生物学中的应用贺玉香综述夏云飞审校中山大学肿瘤防治中心放疗科(广州510060)“彗星”分析法（comet assay）又叫单细胞凝胶电泳（single cell gel eletrophoresis, SCGE）或微凝胶电泳，是一种比较理想的单细胞水平检测哺乳类有核细胞DNA损伤的新技术。

由Ostling等［1］1984年首次提出，后经Singh等［2］逐渐改进。

现主要分为中性SCGE和碱性SCGE。

其原理如下：去污剂或高盐裂解溶液破坏细胞膜，使得95%以上的蛋白质及细胞内其他成分渗出膜进入溶解液，DNA由于相对分子质量大而留在原位。

电泳时小的DNA断片在电场作用下移出细胞核。

经溴乙啶染色后在紫外线(uv)照射下发出荧光，每个受损的细胞均呈现“彗星”外观，明亮的头部为细胞核，一系列的DNA断片组成“彗尾”。

未受损的细胞只有“彗核”而无“彗尾”。

DNA断片迁移的距离与DNA断片分子质量和电荷数相关，DNA断片越多、越小，“彗尾”越长，又因荧光染料与DNA的结合是特异性的，因此，通过测定“彗星”尾部长度和荧光强度可推测DNA链断裂情况。

如为中性裂解液加上50 ℃的处理只能破坏DNA超螺旋结构，而DNA双螺旋结构保存完好，只有小的双链片段在电场作用下移出细胞核，形成“彗星”尾部，故主要用于DNA双链断裂的检测。

而碱性SCGE中用碱性裂解液（pH>123）处理细胞，不但使细胞内蛋白成分更彻底地分离，也有利于DNA双螺旋破坏和单链片段移行，故用于检测DNA单链断裂。

此法的突出优点是灵敏度高。

它可以测出每1657×10－17 kg中01个DNA的断裂，甚至检出自然光照体外淋巴细胞1 h 引起的DNA损伤［3］。

故可研究低剂量下的生物效应。

1、凋亡细胞的观察:看过国外此法作出的凋亡细胞彗星图像，很漂亮，用CASP软件分析后,其曲线呈典型的双峰，而正常细胞为单峰。

我的一些教训:观察凋亡细胞最好把电压、电流、和电泳时间均调低,否则，凋亡细胞中的DNA片断跑的太块，荧光下根本看不到凋亡细胞的尾巴。

注:我用的是中性条件,20V，200mA，20min, 凋亡细胞观察宜选用10V，100mA，10min.朋友们如果有异议,请不吝赐教，也对我有所帮助.2、解旋20分钟应该没问题，但是我认为您的电泳时间过长，当然我不知道您的电泳条件（电压、电流、），我认为20分钟足够了，时间长了一是浪费时间，二是彗星图像不好，不利于分析。

您的裂解时间有点短了,文献报道,最好不要少于1.5小时3、一般100ul0。

5％低熔点胶中含400个细胞就足够了4、本版【图片仓库】子版有我做的彗星图像,感兴趣可以看看http://www.dxy。

cn/bbs/post/view?bid=66＆id=2729243&sty=1＆tpg=1&age=05、注意，CASP只读.tif扩展名的图像，如果你的相机拍摄的图像可以有。

tif格式,就更好了，如果是.jpg格式，那还要在计算机中转换一下，不过很简单6、首先，荧光染色的东西最好马上看，否则影响结果。

其次,您的染色液量我觉得多了点,我用2ug/ml，1ml注射器1滴就可以.第三，要忠于实验结果，图象内容不能更改,可以用ACDSEE或PHOTOSHOP 转换图象格式或大小，所以,作出来的实验图象质量要好7、。

背景的选择问题，如果图片质量好的话，背景大小不同，对结果影响不是很大,如果图片背景乱七八糟，那背景框的选择肯定对结果产生很大影响。

我的建议:背景框不要太大,参考我贴的那个图.注意,背景框可以在细胞的上面或下面,如果背景框在上面时，分析后的图像(分析后出现一个头、尾分明的图像,是基本重合在细胞上的）质量很差，很不规则，那再把背景框调到下面试试，如果还是不好，那只能说你的结果质量不好了。

彗星实验(Comet assay),又称单细胞凝胶电泳(Single cell gel electrophoresis，SCGE),各种理化因子作用细胞后引起的DNA链的断裂可用该方法检测[1～3]，并在统计学基础上对损伤程度做出评估[4]。

本实验对Singh 等[5]建立的碱性彗星实验的一些步骤作了改良。

用超净工作台上的紫外消毒灯[可发射波长为254 nm的紫外线(Ultraviolet，UV)，属于UVC波段范围]作为DNA损伤的诱导因子[7～9]，诱导K562细胞DNA损伤，用改良彗星实验检测损伤程度，验证改良的实验系统是否可靠，同时筛选并评价DNA损伤的分析指标。

1 材料与方法1.1 细胞K562细胞，来源于第四军医大学免疫学教研室，37 ℃、5％ CO2培养箱中培养，取对数期细胞进行实验。

1.2 紫外线照射装置紫外消毒灯(ZSZ-20型，20 W，天津市紫晶特种光源有限公司)。

1.3 主要试剂和仪器培养基：10％新生牛血清(杭州四季青公司)，90％RPMI-1640培养液(Hyclone公司)；双抗(青、链霉素，100 UI/ml)；TritonX-100(Genview分装)；二甲基亚砜、肌苷酸钠(Sigma分装)；低熔点琼脂糖(FMC 分装)；常熔点琼脂糖(Spanish分装)。

其余生化试剂均为分析纯。

电泳仪：由西北大学物理系提供；电泳槽：DYC33A型(北京市六一仪器厂)；显微镜：Leica DM LB 2 (Leica 公司)；彗星图象分析软件：CASP软件(casp-1.2.2，/index.php下载)；CO2培养箱：BB16HF型(上海力申科学仪器有限公司)；环地牌紫外辐照计(北京师范大学光电仪器厂)。

1.4 实验分组及UV处理收集对数生长的K562细胞，台盼蓝染色计数，细胞活力大于95％，用Hank's(pH7.4)调整细胞密度至1×105/ml，接种于塑料培养皿中(ф=35 mm，2 ml/plate)，然后进行紫外线照射(0.3 mW/cm2)。

彗星试验一、实验原理正常细胞核是由DNA和蛋白质构成，DNA的双螺旋以核小体的组蛋白为核心形成超螺旋结构，再进一步形成高级结构，形成染色质，染色质的缠绕形成细胞核。

彗星实验又称单细胞凝胶电泳实验，它能有效地检测并定量分析细胞中DNA单，双链缺口损伤的程度。

当各种内源性和外源性DNA损伤因子诱发细胞DNA链断裂时，其超螺旋结构受到破坏，在细胞裂解液作用下，细胞膜、核膜等膜结构受到破坏，细胞内的蛋白质、RNA 以及其他成分均扩散到细胞裂解液中，而核DNA由于分子量太大只能留在原位。

在中性条件下，DNA片段可进入凝胶发生迁移，而在碱性电解质的作用下，DNA发生解螺旋，损伤的DNA断链及片段被释放出来。

由于这些DNA的分子量小且碱变性为单链，所以在电泳过程中带负电荷的DNA会离开核DNA 向正极迁移形成“彗星”状图像，而未受损伤的DNA部分保持球形。

DNA受损越严重，产生的断链和断片越多，长度也越小，在相同的电泳条件下迁移的DNA量就愈多，迁移的距离就愈长。

通过测定DNA迁移部分的光密度或迁移长度就可以测定单个细胞DNA损伤程度，从而确定受试物的作用剂量与DNA损伤效应的关系。

毒鼠强的中毒机制尚不清楚，但有文献显示，毒鼠强的致惊厥作用可能是拮抗γ-氨基丁酸（γ-GABA）的作用，造成脑细胞凋亡。

因此，本实验通过检测不同剂量的毒鼠强对大鼠脑组织细胞DNA的损伤情况，探讨细胞DNA损伤与毒鼠强的毒作用间的关系。

二、试验目的：检测毒鼠强与细胞DNA损伤的关系。

三、试剂与器材（一）试验细胞来源：大鼠脑细胞（大鼠采用SD大鼠）（二）试剂1、毒鼠强纯品（98.5%，公安部物证鉴定中心提供）2、无钙、镁磷酸盐缓冲液（PBS缓冲液）将Nacl4.0g，KH2PO40.1g，KCL0.2g，Na2HPO40.58g,Na2HPO4·12H2O.45g，溶于500ml蒸馏水中。

3、琼脂糖用无钙、镁磷酸盐缓冲液配置4、细胞裂解液Nacl73.05g，Na2EDTA·2H2O18.6g，Tris（三羟甲基氨基甲烷）0.61g，肌氨酸钠5g，双蒸水400ml，先加入一些NaOH在磁力搅拌器上加热溶解。

Comet Assay 彗星分析系统软件功能:彗星试验-单细胞凝胶电泳Single cell gel electrophoresis是一种快捷、高灵敏度的检测DNA受损的方法.Comet Assay 专业彗星试验图像分析软件,提供专业快速的测量方法。

测量指标包括头半径，尾长度，积分光密度，头/尾DNA含量比例，尾矩，Olive 矩等多种参数。

具有自动或手动调节分割彗星头部和尾部功能同时提供对双染色系统的分析系统可广泛用于环境毒理学中对DNA具有损伤作用的分析：如紫外光、电离辐射、氧自由基等因素造成的DNA损伤。

以及细胞凋亡，抗癌药物的药物毒理学研究，遗传毒理研究和肿瘤治疗的跟踪监测等单细胞凝胶电泳(彗星试验):原理、应用和局限性彗星试验：原理、应用和局限性1. 前言过去十年中，彗星试验或单细胞凝胶电泳（SCGE）已成为一个评定DNA损伤的标准方法，广泛应用于遗传毒性试验、人类生物监测和分子流行病学、生态毒理学以及DNA损伤修复的基础研究，且因其简单、灵敏、多功能、快速、经济实用而赢得了广大科研工作者的青睐，和其有关的文献数目逐年上升。

在应用彗星试验时不会过多去考虑它如何运作和它提供何种信息，因为它在论证DNA损伤中的成功已足以证明它的价值。

这一点实在太可惜，因为它不仅能告诉我们细胞内存在的损伤的类型，而且能告诉我们损伤的程度。

尽管彗星试验是检测DN A断裂的基本方法，但由于对特异性核酸内切酶损伤的引入使其可以检测紫外线诱导的嘧啶二聚体，氧化碱基和烷基化损伤。

2.检测原理和检测指标2.1 背景二十世纪七十年代，Peter Cook和其同事们制定了一种用非离子去污剂使细胞溶解来研究核结构的方法。

这种处理除去胞膜、胞质和核质，并使核小体破裂（几乎所有的组蛋白均被浓盐提取），剩下的就是由核基质或RNA、蛋白质组成的支架以及DNA所构成的类核，其DNA的双螺旋以核小体的组蛋白为核心形成负超螺旋结构。

超螺旋的存在使DNA不能自由旋转，Cook 等提出一个模型，DNA间断的附加于基质，有效的形成一系列环状、而不是线性分子。

彗星实验技术及其应用李岗;吴声敢;蔡磊明【期刊名称】《生态毒理学报》【年(卷),期】2018(013)006【摘要】彗星实验是瑞典科学家Ostling和Johanson于1984年发明的检测毒物DNA损伤效应的方法.它经历了从最初的微电泳技术、中性彗星实验、碱性彗星实验、酶切彗星实验和双向垂直彗尾彗星实验等不断完善的发展过程.在毒理学、遗传学和环境生态科学等领域有着重要的应用,是经济合作与发展组织(OECD)和欧洲食品安全局等国际组织推荐的测定遗传毒性的方法之一.彗星实验的关键点包括单细胞悬液的制备、细胞裂解液的成分与比例,低熔点琼脂糖凝胶的浓度,电泳条件等.在典型应用领域,如蚯蚓、鱼、两栖动物、鼠和人的彗星实验很难找到标准实验方案.成功的彗星实验还需关注,实验设计时必须包括阳性对照,结果表述时必须有图为证,实验方案可能因物种或细胞而异.%In 1984, the Sweden scientists, O. Ostling and K.J. Johanson, devised the \"comet assay\"to identify substances that cause DNA damage. Since then, it has experienced refinements that include several improvements such as microelectrophoresis, the neutral comet assay, the alkaline comet assay,the enzyme-modified comet assay, and the two-dimensional perpendicular tail comet assay. This general method is applicable to wide fields of interests including toxicology, genetics, environmental sciences & ecology, and others. Organization for Economic Co-operation and Development (OECD) and the European Food Safety Authority recommend comet assayas an integral part of their genotoxicity testing strategy. The critical procedures in the comet assay involve the preparation of a singlecell suspension, modifications to the lysis buffer, the percentage of low melting point agarose, electrophoresis conditions, etc. It is difficult to standardize protocols for earthworm, piscine, amphibians, murine, and human subjects. Successful comet assay must also include key points such as inclusions of positive controls in experimental design, good comet image as supporting evidence, and the development of special protocols depending on species and cell types.【总页数】18页(P79-96)【作者】李岗;吴声敢;蔡磊明【作者单位】浙江省农业科学院农产品质量标准研究所, 杭州 310021;浙江省农业科学院农产品质量标准研究所, 杭州 310021;浙江省农业科学院农业部农药检测重点实验室, 杭州 310021;浙江省农业科学院浙江省农药残留检测与控制研究重点实验室, 杭州 310021;浙江省农业科学院浙江省植物有害生物防控省部共建国家重点实验室培育基地, 杭州 310021;浙江省农业科学院农产品质量标准研究所, 杭州310021;浙江省农业科学院农业部农药检测重点实验室, 杭州 310021;浙江省农业科学院浙江省农药残留检测与控制研究重点实验室, 杭州 310021;浙江省农业科学院浙江省植物有害生物防控省部共建国家重点实验室培育基地, 杭州 310021【正文语种】中文【中图分类】X171.5【相关文献】1.改良彗星实验和RAPD技术检测DNA损伤的实验研究 [J], 赖金龙;胡健慧;付倩;吴国;陶宗娅;张红;罗学刚2.彗星实验技术在不同细胞DNA损伤检测中的应用 [J], 陈果;李晔3.彗星实验在水污染遗传毒性监测中的应用 [J], 姜旭萌;赵咏梅;金荔红4.用彗星实验技术分析MTX对小鼠细胞DNA的损伤作用 [J], 杨建一;彭芸;李莉;杜圣家;单联喆;张新旺;王文娟5.用彗星实验技术检测环境遗传毒性物质 [J], 陈颖;王磊;王子健因版权原因，仅展示原文概要，查看原文内容请购买。