单细胞凝胶电泳——彗星实验方法的建立、改良与应用

彗星试验步骤1.5.4 彗星试验（单细胞凝胶电泳试验）：参照文献[i]，略加改动，进行碱性单细胞凝胶电泳，具体如下。

1.5.4.1 制片将0.6%的NMPA（用PBS配制）于微波炉中加热融化后，浸泡磨砂玻片，用吸水纸将玻片滑面及四周吸干，自然晾干备用。

1.5.4.2 铺胶取1.5.3中所备细胞悬液10μl，向其中加入70μl 37℃0.7%LMPA（用PBS配制），混匀后迅速滴于37℃预热的玻片上，立即盖上盖玻片，4℃固化10min。

1.5.4.3 裂解轻轻取下盖玻片，将玻片浸于新鲜配制并预冷的细胞裂解液中，4℃避光裂解1h。

1.5.4.4 解旋从裂解液中取出载玻片，用PBS浸泡玻片3×3min。

用纸巾吸去玻片上残留的液体，置于水平电泳槽中，加新鲜配制的碱性电泳缓冲液至高于玻片表面3mm 以上，避光解旋30min。

1.5.4.5 电泳电压25V，调整液面高度使电流达到300mA，电泳25min。

1.5.4.6 漂洗及染色电泳完毕，取出玻片，用PBS浸泡2×15min，以中和强碱。

用纸巾吸去玻片上残留的液体，然后滴加20μg/ml的EB20μl，盖上盖玻片，立即置荧光显微镜下观察。

以上步骤尽量在黄光下或暗处进行，避免其他原因所致的DNA损伤。

每一剂量水平制片2张。

1.5.4.7 结果观察荧光显微镜下200倍观察，激发波长515~560nm，发射波长590nm。

每一剂量水平随机观察100个细胞，记录拖尾细胞数。

计算拖尾细胞率（以下简称拖尾率），拖尾率＝(拖尾细胞数/100)×100%。

每一剂量水平用目镜测微尺测量30个拖尾细胞的全长和头长，拖尾细胞尾长（以下简称尾长，tail length，TL）＝全长－头长，计算各剂量组的平均尾长。

表1.1 MMS、MMC和NaN3的WTK1细胞彗星试验结果Table 1.1 Comet assay of MMS, MMC and NaN3 with WTK1 cell lineChemicalConc.(μg/ml)0h 20hRG a (%)Cometcell (%)TL(x±s, μm)RG a(%)Cometcell (%)TL(x±s, μm)MMS 0 100.0 6.0 3.50±1.69 100.0 3.0 3.67±3.130.625 97.2 10.0 10.38±2.92** 98.8 8.0 6.50±3.05**1.25 100.4 18.0* 24.25±4.88** 97.7 11.0 8.90±3.52**2.5 96.4 33.0** 32.08±7.40** 88.3 15.0** 18.62±4.04**5 94.8 60.0** 52.33±5.68** 86.8 44.0** 46.00±5.36** K2Cr2O7147 92.4 100.0** 78.70±4.39** －－－MMC 0 100.0 6.0 2.57±1.76 100.0 5.0 1.75±1.760.0625 100.4 6.0 3.70±1.86 96.2 9.0 3.62±1.920.125 108.1 10.0 4.04±1.52 54.6 19.0** 5.50±1.81**0.25 104.5 11.0 3.92±1.42 52.7 50.0** 22.87±3.95**0.5 87.8 17.0* 4.93±3.63 48.8 64.0** 50.17±5.80** K2Cr2O7147 105.4 100.0** 68.19±5.15** －－－NaN30 100.0 8.0 3.12±1.69 100.0 9.0 2.15±1.67 250 90.0 7.0 3.03±1.48 99.0 6.0 2.85±1.58500 102.5 8.0 3.35±1.16 97.7 9.0 3.10±1.831000 89.4 14.0 4.09±1.57 88.3 11.0 3.16±1.292000 92.2 56.0** 14.93±4.54** 86.8 52.0** 11.25±1.38** K2Cr2O7147 92.5 100.0** 72.33±6.12** －－－a Relative growth compared with corresponding solvent control*P<0.05 **P<0.01, compared with corresponding solvent control。

单细胞凝胶电泳(SCGE)检测锰损伤神经元DNA1陆彩玲，郭松超，鲁力，陈维平，邝晓聪广西医科大学公共卫生学院，广西南宁（530021）E-mail：lcling78@摘要：目的建立体外染锰细胞模型，探讨锰神经毒性的作用机制。

方法：以原代培养的成熟皮层神经元为靶，据本室前期试验结果确定低中高不同浓度的锰液（分别为0.2mmol/L,0.6mmol/L,1.0mmol/L），与神经细胞共孵育。

显微镜观察各组神经细胞形态学的变化，用单细胞凝胶电泳试验（SCGE）检测神经细胞的DNA损伤，以彗星细胞尾长及彗星样细胞百分率为评价损伤的指标。

结果：光镜下可见不同浓度锰孵育后神经细胞形态学发生改变，单细胞凝胶电泳试验显示神经细胞DNA出现不同程度的损伤，彗星尾长及彗星样细胞百分率较对照组明显增加（P＜0.01）。

尤以高浓度锰组损伤组严重，显著高于中低浓度组（P＜0.01）。

结论：锰不但能引起体外培养的神经细胞外在的形态学损伤，还可导致神经细胞DNA的损伤。

关键词：锰，单细胞凝胶电泳 (SCGE)，DNA损伤目前，随着生产工艺的改进和预防措施的加强，严重的职业性锰中毒已很少发生，但长期低剂量的锰暴露依然存在，并对接触者的潜在影响仍不可低估。

慢性锰中毒是进行性的、不可逆的病变，并且锰对接触者的危害正由临床型向亚临床型转变，因而更为敏感、特异的效应指标，以早期筛检出亚临床中毒者及高危人群，是今后锰神经毒性研究中重点解决的问题。

DNA损伤是遗传毒理学的一个重要研究领域，长期不可逆转的DNA损伤累积可诱导细胞突变、畸变。

单细胞凝胶电泳(Singl cells gel eletrophoresis,SCGE)又称彗星试验（comet assay），由Ostling等（1984）首创，后经Singh等（1988）进一步完善并逐渐发展起来的一种快速检测单细胞 DNA损伤的实验方法，适用于多种细胞，广泛应用于检测诱变剂、射线等对DNA的损伤、监测环境污染物对机体的遗传损害、研究毒物致癌机制等方面，具有经济、简捷、灵敏等优点，日益广泛地应用在各种诱变剂的遗传毒性检测上。

又被称为“ 彗星电泳” ］ 细胞的生物膜在细胞裂解液的作用下被破坏， ［． ７ 使细胞内的 Ｄ Ａ 蛋白质及其 Ｎ 、 他成分进入凝胶， 继而扩散到裂解液中， 惟有核 Ｄ Ａ仍 附着在剩余的核骨架上而 留在原位 ． Ｎ 如果细胞 未受损伤， 电泳中核 Ｄ Ａ停留在核基质中， Ｎ 经荧光染色后呈现 圆形 的荧光团， 无拖尾现象 ． 若细胞受
到损伤， 在碱性电泳液（Ｈ＞１） Ｄ Ａ双链解螺旋且碱变性为单链， ｐ ３ 中， Ｎ 单链断裂的碎片离开核 Ｄ Ａ向 Ｎ 阳极迁移， 形成拖尾 ． 细胞核 Ｄ Ａ受损伤越严重， Ｎ 产生的断链或碱变性碎片就越多， 片断也越小， 电泳 表现为彗星尾越长和彗尾越亮［ ． ８ 通过荧光显微镜观察有无彗星及彗尾的长度、 】 亮度、 出尾率等， 判断
以研究活细胞 Ｄ Ａ的损伤， Ｎ 还可以研究死细胞的 Ｄ Ａ损伤， Ｎ 从而避免了只能用活细胞 （ 如染色体畸 变、 微核、 姐妹染色单体互换等） 的限制， 因而其对于建立动物模型深入探讨运动性氧应激与 Ｄ Ａ损伤 Ｎ 的分子生物学机制仍不失为一种优越的研究方法 ． 同时，Ｃ Ｅ技术也将为运动性疾病和运动性疲劳的早期诊断提供更有效 的实验方法和手段 ． ＳＧ 在 使用单细胞凝胶电泳技术在运动医学中的应用得 出结论 ：Ｃ Ｅ技术 由于需样品量少， Ｄ Ａ损伤检 ＳＧ 对 Ｎ 出的灵敏性高， 无需同位素标记， 技术简单、 费用低， 能够快速、 准确检测有害物质存在场所中各类人群 的 Ｄ Ａ损伤及筛检对 Ｄ Ａ损伤因素敏感的高危人群 ． Ｎ Ｎ
速、 低耗 等优 点 ， 因此被 广泛应 用在 Ｄ ＮＡ的损 伤与 修复 、 传 毒理 、 境监 测 以及氧 化 应 激和 细胞 凋亡 遗 环
等研 究中［１ ６．
１ 单细胞凝胶电泳技术原理

【Ｋｅｙｗｏｒｄｓ】 Ｓｉｎｇｌｅｃｅｌｌｇｅｌｅｌｅｃｔｒｏｐｈｏｒｅｓｉｓ；Ｃｌａｓｓｉｃａｌｃｏｍｅｔａｓｓａｙ；ＤＮＡｄａｍａｇｅ；Ａａｌｋａｌｉｎｅｅｌｅｃｔｒｏｐｈｏｒｅｓｉｓ
彗星实验如 Ｏｓｔｌｉｎｇ和 Ｊｏｈａｎｓｏｎ（１９８４）所描述的， 并且代表性地应用于双链 ＤＮＡ断裂的检测［２，３］；而碱性
【Ａｂｓｔｒａｃｔ】 Ｏｂｊｅｃｔｉｖｅ Ｔｏｉｍｐｒｏｖｅｔｈｅｃｌａｓｓｉｃａｌａｎｄｗｉｄｅｌｙ－ｒｅｃｏｇｎｉｚｅｄｃｏｍｅｔａｓｓａｙ（ＴｈｅＳｉｎｇｌｅｃｅｌｌｇｅｌｅｌｅｃｔｒｏｐｈｏｒｅｓｉｓａｓｓａｙ）ａｎｄｍａｋｅ ｉｔｍｏｒｅｓｕｉｔａｂｌｅｆｏｒｃｌｉｎｉｃａｌａｎｄｒｅｓｅａｒｃｈｐｕｒｐｏｓｅｓ．Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｂｌｏｏｄｓａｍｐｌｅｓｆｒｏｍ ｆｉｖｅＦａｎｃｏｎｉａｎｅｍｉａｐａｔｉｅｎｔｓｗｅｒｅｓｅｌｅｃｔｅｄａｓｐｏｓｉｔｉｖｅｃｏｎｔｒｏｌｓ ａｎｄｃｏｒｄｂｌｏｏｄｓａｍｐｌｅｓｆｒｏｍ３０ｎｅｗｂｏｒｎｂａｂｉｅｓａｓｎｅｇａｔｉｖｅｃｏｎｔｒｏｌｓｔｏｃｏｎｄｕｃｔｃｏｍｅｔａｓｓａｙｓｉｎｏｒｄｅｒｔｏｃｏｍｐａｒｅｔｈｅａｃｃｕｒａｃｙａｎｄｃｏｎｃｏｒｄａｎｃｅｂｅ ｔｗｅｅｎｔｈｅｃｌａｓｓｉｃａｌａｎｄｉｍｐｒｏｖｅｄｃｏｍｅｔａｓｓａｙｓ．Ｉｎａｄｄｉｔｉｏｎ，１５ｃｌｉｎｉｃａｌｓａｍｐｌｅｓｗｅｒｅｃｏｌｌｅｃｔｅｄｔｏｃｏｍｐａｒｅｔｈｅａｃｃｕｒａｃｙａｎｄｅｆｆｅｃｔｉｖｅｎｅｓｓｏｆｔｈｅ ｃｏｍｅｔｔｅｓｔｉｎｇｒｅｓｕｌｔｓｐｅｒｆｏｒｍｅｄｂｙｉｍｐｒｏｖｅｄａｓｓａｙｗｉｔｈｔｈａｔｃｏｎｄｕｃｔｅｄａｔｔｈｅＩｎｓｔｉｔｕｔｅｏｆＲａｄｉａｔｉｏｎＭｅｄｉｃｉｎｅｉｎｔｈｅＣｈｉｎｅｓｅＡｃａｄｅｍｙｏｆＭｅｄｉｃａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ．Ｒｅｓｕｌｔｓ Ｉｍｐｒｏｖｅｄａｓｓａｙｓｈｏｗｅｄｔｈｅｒｅｓｕｌｔｓｏｆ１００％ ｏｆａｃｃｕｒａｃｙａｎｄｃｏｎｃｏｒｄａｎｃｅｗｉｔｈｔｈａｔｏｂｔａｉｎｅｄｗｉｔｈｔｈｅｃｌａｓｓｉｃｃｏｍｅｔａｓｓａｙ．Ｃｏｎ ｃｌｕｓｉｏｎ Ｉｎｃｏｍｐａｒｉｓｏｎｗｉｔｈｔｈｅｃｌａｓｓｉｃａｌｃｏｍｅｔａｓｓａｙ，ｉｍｐｒｏｖｅｄｃｏｍｅｔａｓｓａｙｉｓｅａｓｉｅｒｔｏｐｅｒｆｏｒｍ ｗｉｔｈｓｈｏｒｔｅｒｐｒｏｃｅｓｓｉｎｇｔｉｍｅ，ａｎｄｃａｎｇｅｎｅｒａｔｅ ｏｂｊｅｃｔｉｖｅ，ｒｅｐｒｏｄｕｃｉｂｌｅ，ａｎｄｒｅｌｉａｂｌｅｔｅｓｔｉｎｇｒｅｓｕｌｔｓｗｉｔｈｃｌｅａｒｅｒａｎｄｍｏｒｅｉｎｆｏｒｍａｔｉｖｅｉｍａｇｅｓ；ｉｎａｄｄｉｔｉｏｎ，ｉｍｐｒｏｖｅｄａｓｓａｙｉｓｌｏｗｅｒｃｏｓｔ，ｓａｆｅｒｔｏ ｐｅｒｆｏｒｍ，ａｎｄｍｏｒｅｅｎｖｉｒｏｎｍｅｎｔａｌｌｙｐｒｏｔｅｃｔｉｖｅ．ＩｍｐｒｏｖｅｄｃｏｍｅｔａｓｓａｙｃａｎｂｅｒｅｃｏｍｍｅｎｄｅｄａｓａｃｏｎｖｅｎｔｉｏｎａｌｍｅｔｈｏｄｔｏｄｅｔｅｃｔＤＮＡ ｄａｍａｇｅｆｏｒ ｃｌｉｎｉｃａｌａｎｄｒｅｓｅａｒｃｈｐｕｒｐｏｓｅｓ．

彗星实验(Comet assay),又称单细胞凝胶电泳(Single cell gel electrophoresis，SCGE),各种理化因子作用细胞后引起的DNA链的断裂可用该方法检测[1～3]，并在统计学基础上对损伤程度做出评估[4]。

本实验对Singh 等[5]建立的碱性彗星实验的一些步骤作了改良。

用超净工作台上的紫外消毒灯[可发射波长为254 nm的紫外线(Ultraviolet，UV)，属于UVC波段范围]作为DNA损伤的诱导因子[7～9]，诱导K562细胞DNA损伤，用改良彗星实验检测损伤程度，验证改良的实验系统是否可靠，同时筛选并评价DNA损伤的分析指标。

1 材料与方法1.1 细胞K562细胞，来源于第四军医大学免疫学教研室，37 ℃、5％ CO2培养箱中培养，取对数期细胞进行实验。

1.2 紫外线照射装置紫外消毒灯(ZSZ-20型，20 W，天津市紫晶特种光源有限公司)。

1.3 主要试剂和仪器培养基：10％新生牛血清(杭州四季青公司)，90％RPMI-1640培养液(Hyclone公司)；双抗(青、链霉素，100 UI/ml)；TritonX-100(Genview分装)；二甲基亚砜、肌苷酸钠(Sigma分装)；低熔点琼脂糖(FMC 分装)；常熔点琼脂糖(Spanish分装)。

其余生化试剂均为分析纯。

电泳仪：由西北大学物理系提供；电泳槽：DYC33A型(北京市六一仪器厂)；显微镜：Leica DM LB 2 (Leica 公司)；彗星图象分析软件：CASP软件(casp-1.2.21.4 实验分组及UV处理收集对数生长的K562细胞，台盼蓝染色计数，细胞活力大于95％，用Hank's(pH7.4)调整细胞密度至1×105/ml，接种于塑料培养皿中(ф=35 mm，2 ml/plate)，然后进行紫外线照射(0.3 mW/cm2)。

实验分为对照组和8个照射组，各照射组分别照射3、5、10、40，60、120、180、240 s，对照组不进行紫外线照射，之后进行彗星实验。

单细胞凝胶电泳技术的试验步骤试剂及材料：1）0.01M PBS pH7.3：8g NaCl、0.2g KCl、1.44g Na2HPO4和0.24g KH2PO4,溶于800ml蒸馏水中，用HCl调节溶液的pH值至7.3，最后加蒸馏水定容至1L即可。

保存存于室温或4℃冰箱中。

2）0.8%正常熔点凝胶（PBS配制）3）0.6％低熔点凝胶（PBS配制）4）毛玻璃片5）盖玻片6）碱性裂解液（2.5mol/L NaCl;100mmol/L Na2EDTA;10mmol/L Tris;1%肌氨酸钠），临用前加10％DNMSO，1％Triton X-1007）电泳缓冲液（1mmol/L Na2EDTA;300mmol/L NaOH；Tris.Cl，pH7.5）8）EB（2ug/ml）步骤：1.制备第一层胶：100ml 0.8％正常熔点胶，加盖盖玻片，4℃固化10min；2.制备第二层胶：轻轻地去除盖玻片，在第一层胶上滴加75ul含1×10000个细胞的0.6％低熔点胶（cell 与凝胶比例为1：5），加盖盖玻片，4℃固化10min；3.裂解：去掉盖玻片，将凝胶浸入冰冷的碱性裂解液内（临用前加10％DMAO，1％Triton X-100），4℃裂解1h；4.取出玻片，用PBS缓冲液漂洗3次后置于水平电泳槽内，加入pH13的电泳缓冲液（没过玻片2-3min），放置20min（黑闭）。

5.电泳：电压20V，300mA，30min6.取出玻片，用PBS或Tris.Cl，pH7.5漂洗3次，每次3min；或双蒸水漂洗2次，每次5～15min，7.染色：胶上滴加3ulEB，加盖盖玻片，24h检测。

或者4℃，潮湿，闭光的条件下保有胶片，观察时再染色，镜检。

1.2.5 改良彗星试验操作步骤为节省实验时间，本研究将铺三层胶法改为铺一层胶法，同时在中和及染色等步骤进行了改良，具体操作如下:将已染毒的淋巴细胞悬液与40℃的1%低溶点琼脂糖等浓度混匀后，取70μl混合液直接滴加在磨毛玻片上，加盖玻片，4℃冷凝，20min后揭盖片;4℃于碱性裂解液中裂解1h;解旋20min;4℃电泳（25V，300mA）30min;中和5min;加碘化丙啶，暗处染色10min，加盖片;于莹光显微镜下镜检，照像。

单细胞凝胶电泳分析法单细胞凝胶电泳分析法(彗星分析法)治愈癌症是一个难题,长期以来科学家们一直在苦苦探索.我们目前知道,致癌的过程与许多因素有关，但如果我们能阻止其中的任何一个步骤，癌细胞便无法形成。

因此,探测致癌物质的技术与癌细胞的及时发现就显得尤其重要！然而截至目前为止，科学家们仍无法研究出一种简易基因测试法或综合的方法来检测出可能的致癌物。

因此，致癌物对ＤＮＡ的作用仍是癌症研究的一个重要课题。

遗传毒物学为一专门研究化学及各类物质对人体遗传基因影响的科学。

人体每天暴露在大量的化学物质当中，为了诊测这些物质对人体ＤＮＡ的影响，科学家们发明了多种测定方法，然而，多年来人们所使用的这些测试方法却不能准确与快速的辨识出会使人体致癌的物质。

为了解决这些问题，单细胞凝胶电泳法（Single Cell Gel Assay）应运而生，通常亦称之彗星分析法（Comet Assay）。

它之所以称为彗星分析法是因为被破坏的DNA形似彗星，此方法已被证实是最具敏感性又最具快速性的方法。

研究人员使用这种方法可在２４小时内获得初步结果，在十天之内能得到结论性的证据。

此种测定方法速度远快于其它方法，不仅可以测出某种物质是否是致癌物，而且还可测出被破坏细胞的损害程度。

彗星分析法是用来判别某种物质是否是致癌物，并衡量其对人体ＤＮＡ修补的影响程度，这一分析过程是将健康的人体白血球接触于被测试的物质后，然后再用彗星分析法来进行测试，如果被测试的物质是致癌物质，那么ＤＮＡ将被破坏，而被损坏的ＤＮＡ将开始游离细胞核，形成彗星形状。

ＤＮＡ受到致癌物质的损坏愈大，ＤＮＡ碎段就愈多，愈小的ＤＮＡ碎段游离的速度就愈快，也游离愈远，因而形成了彗星的尾部，而较大的一些碎段位置则靠近细胞核，因而形成彗星的头部。

ＤＮＡ碎段的游动的程度不同 使它呈现出彗星状，使研究人员能很容易看清细胞的损害程，彗星的长度与ＤＮＡ的损害程度有关，此长度是指从细胞核到彗星尾端的距离，也就是说，彗星尾端愈长，细胞的损害程度愈大。

彗星实验(Comet assay),又称单细胞凝胶电泳(Single cell gel electrophoresis，SCGE),各种理化因子作用细胞后引起的DNA链的断裂可用该方法检测[1～3]，并在统计学基础上对损伤程度做出评估[4]。

本实验对Singh 等[5]建立的碱性彗星实验的一些步骤作了改良。

用超净工作台上的紫外消毒灯[可发射波长为254 nm的紫外线(Ultraviolet，UV)，属于UVC波段范围]作为DNA损伤的诱导因子[7～9]，诱导K562细胞DNA损伤，用改良彗星实验检测损伤程度，验证改良的实验系统是否可靠，同时筛选并评价DNA损伤的分析指标。

1 材料与方法1.1 细胞K562细胞，来源于第四军医大学免疫学教研室，37 ℃、5％ CO2培养箱中培养，取对数期细胞进行实验。

1.2 紫外线照射装置紫外消毒灯(ZSZ-20型，20 W，天津市紫晶特种光源有限公司)。

1.3 主要试剂和仪器培养基：10％新生牛血清(杭州四季青公司)，90％RPMI-1640培养液(Hyclone公司)；双抗(青、链霉素，100 UI/ml)；TritonX-100(Genview分装)；二甲基亚砜、肌苷酸钠(Sigma分装)；低熔点琼脂糖(FMC 分装)；常熔点琼脂糖(Spanish分装)。

其余生化试剂均为分析纯。

电泳仪：由西北大学物理系提供；电泳槽：DYC33A型(北京市六一仪器厂)；显微镜：Leica DM LB 2 (Leica 公司)；彗星图象分析软件：CASP软件(casp-1.2.2，/index.php下载)；CO2培养箱：BB16HF型(上海力申科学仪器有限公司)；环地牌紫外辐照计(北京师范大学光电仪器厂)。

1.4 实验分组及UV处理收集对数生长的K562细胞，台盼蓝染色计数，细胞活力大于95％，用Hank's(pH7.4)调整细胞密度至1×105/ml，接种于塑料培养皿中(ф=35 mm，2 ml/plate)，然后进行紫外线照射(0.3 mW/cm2)。

悬 液 ，按 照 己 建 立 的 实 验 方 法 检 测 甲 磺 酸 乙 酯 的 遗 传 毒 性 。结 果 第 1层 使 用 0.75%的 琼 脂 糖 溶 液 铺 片 合 适 ，使 用 终 浓 度 为
0.68%的 低 熔 点 琼 脂 糖 和 单 细 胞 混 悬 液 铺 第 2 层 琼 脂 糖 凝 胶 时 ，铺 片 合 适 ， 分 别 选 择 解 旋 20 min和 电 泳 20 min作 为 解 旋 时
层 琼 脂 糖 凝 胶 提 前 1天 铺 ，选 用 3 种 不 同 浓 度 （1.00%、0.75%、0 .5 0 % )的 正 常 熔 点 琼 脂 糖 ，选 用 3 种 不 同 终 浓 度 （0.91% 、
0.68%、0 .4 5 % )的 低 熔 点 琼 脂 糖 和 单 细 胞 混 悬 液 铺 第 2 层 ，第 3 层 低 熔 点 琼 脂 糖 浓 度 与 第 2 层 相 同 。玻 片 裂 解 过 夜 后 ， 4 °C
下 分 别 避 光 解 旋 4 种 不 同 时 间 （20、30、40、 60 m i n ) , 在 2〜 10 °C新 鲜 电 泳 液 （p H > 1 3 ) 中 以 有 效 电 压 0.7 V/cm分别电 泳
3 种 不 同 时 间 （20、30、 40 m i n ) , 中 和 并 用 无 水 乙 醇 脱 水 后 干 燥 保 存 。 染 色 后 在 荧 光 显 微 镜 下 拍 照 并 保 存 ，用 CASP软件
Abstract: Objective The agarose concentration, unwinding time and electrophoresis time of the main influencing factors of the alkaline comet assay in vivo were discussed, and the alkaline comet assay method in rats was established, and the common positive control ethyl methanesulfonate (EMS) was used for verification experiment. M e t h o d s Hepatocytes were derived from healthy male SD rats, and three-layer single-cell gel slides were prepared. First layer of agarose gel was laid one day in advance, and three different concentrations of nomal melting point agarose (1.00%, 0.75%, and 0.5%) were used. Three different final concentrations of low melting point agarose and single cell suspension (0.91%, 0.68%, and 0.45%) were used as the second layer,and the third layer of low melting point agarose has the same concentration as the second layer. After the slides were lysed overnight,they were incubated in alkaline (pH > 13) electrophoresis buffer at 4 °C for four different time (20, 30, 40, 60 min), and then electrophoresed at an effective voltage of 0.7 V/cm for three different time (20, 30, and 40 min) at 2 〜 10 0C. After the electrophoresis was completed,the slides were dehydrated with abslute ethanol and then dried and stored. After staining with fluorescent dyes,taked pictures and saved them under a fluorescence microscope,analyzed with CASP, and measured the degree of DNA damage of the cells by the percentage of DNA in the cell tail. Ten healthy male SD rats were randomly divided into vehicle control group and positive control group. They were given physiological saline and EMS (200 mg/kg) respectively, and were administered by gavage twice at an interval of 21 hours. The liver tissues were collected three hours after the last administration and prepare a single cell suspension to detect the*

彗星电泳法检测细胞凋亡原理细胞凋亡是细胞生命周期中的一种自然过程，也是一种重要的细胞死亡方式。

在细胞凋亡过程中，细胞内会发生一系列的形态和生化变化，如细胞核染色质凝聚、细胞核碎裂、胞质内溶酶体释放等，这些变化是细胞凋亡的特征。

彗星电泳法（Comet Assay）是一种常用的细胞凋亡检测方法，它可以通过检测DNA断裂来判断细胞是否发生凋亡。

这种方法以细胞的DNA为基础，通过电泳的方式使DNA在凝胶上产生“彗星尾巴”状的形态，从而判断细胞凋亡的发生程度。

彗星电泳法的原理是利用DNA在电场作用下的迁移能力差异来检测细胞凋亡。

首先，将待检测的细胞经过相应处理，如破碎细胞膜、去除核膜等，使细胞内的DNA暴露在外。

然后，将处理后的细胞混合在低熔点琼脂糖中，制备成凝胶。

接下来，将凝胶浸泡在含有碱性溶液的电泳缓冲液中，形成电泳系统。

在电场的作用下，DNA 会向阳极移动，形成“彗星尾巴”状。

最后，通过染色和显微镜观察，可以看到DNA的形态变化，进而判断细胞凋亡的程度。

彗星电泳法的检测结果可以通过计算尾长、尾百分比、尾状因子等参数来评估细胞凋亡的程度。

尾长是指从头部到尾部的距离，尾百分比是指尾部长度占总长度的百分比，尾状因子是尾长与头部直径的比值。

通过对这些参数的测量和分析，可以得出细胞凋亡的程度和类型。

彗星电泳法具有灵敏性高、操作简便、结果直观等优点，因此被广泛应用于细胞凋亡的研究和药物筛选等领域。

它可以帮助科研人员更好地理解细胞凋亡的机制，以及评估药物对细胞凋亡的影响。

此外，彗星电泳法还可以用于毒理学研究、环境污染监测等方面。

彗星电泳法作为一种常用的细胞凋亡检测方法，通过检测DNA断裂来判断细胞凋亡的发生程度。

它具有操作简便、结果直观等优点，并被广泛应用于细胞凋亡研究和药物筛选等领域。

通过彗星电泳法的应用，科研人员可以更好地理解细胞凋亡的机制，为相关疾病的治疗提供新的思路和方法。

Comet Assay 彗星分析系统软件功能:彗星试验-单细胞凝胶电泳Single cell gel electrophoresis是一种快捷、高灵敏度的检测DNA受损的方法.Comet Assay 专业彗星试验图像分析软件,提供专业快速的测量方法。

测量指标包括头半径，尾长度，积分光密度，头/尾DNA含量比例，尾矩，Olive 矩等多种参数。

具有自动或手动调节分割彗星头部和尾部功能同时提供对双染色系统的分析系统可广泛用于环境毒理学中对DNA具有损伤作用的分析：如紫外光、电离辐射、氧自由基等因素造成的DNA损伤。

以及细胞凋亡，抗癌药物的药物毒理学研究，遗传毒理研究和肿瘤治疗的跟踪监测等单细胞凝胶电泳(彗星试验):原理、应用和局限性彗星试验：原理、应用和局限性1. 前言过去十年中，彗星试验或单细胞凝胶电泳（SCGE）已成为一个评定DNA损伤的标准方法，广泛应用于遗传毒性试验、人类生物监测和分子流行病学、生态毒理学以及DNA损伤修复的基础研究，且因其简单、灵敏、多功能、快速、经济实用而赢得了广大科研工作者的青睐，和其有关的文献数目逐年上升。

在应用彗星试验时不会过多去考虑它如何运作和它提供何种信息，因为它在论证DNA损伤中的成功已足以证明它的价值。

这一点实在太可惜，因为它不仅能告诉我们细胞内存在的损伤的类型，而且能告诉我们损伤的程度。

尽管彗星试验是检测DN A断裂的基本方法，但由于对特异性核酸内切酶损伤的引入使其可以检测紫外线诱导的嘧啶二聚体，氧化碱基和烷基化损伤。

2.检测原理和检测指标2.1 背景二十世纪七十年代，Peter Cook和其同事们制定了一种用非离子去污剂使细胞溶解来研究核结构的方法。

这种处理除去胞膜、胞质和核质，并使核小体破裂（几乎所有的组蛋白均被浓盐提取），剩下的就是由核基质或RNA、蛋白质组成的支架以及DNA所构成的类核，其DNA的双螺旋以核小体的组蛋白为核心形成负超螺旋结构。

超螺旋的存在使DNA不能自由旋转，Cook 等提出一个模型，DNA间断的附加于基质，有效的形成一系列环状、而不是线性分子。

单细胞凝胶电泳（Single Cell Gel Electrophoresis，SCGE）技术单细胞凝胶电泳（SCGE），因其细胞电泳形状颇似彗星，又称彗星试验（Comet Assay）。

它用于检测单个哺乳动物细胞DNA的损伤，与传统方法相比，因其快捷，灵敏，样品消耗少，费用较低，时至今日已广泛应用于各种有核细胞经受试因子作用后诱导出现的DNA损伤和修复的实验，成为遗传毒理学、氧化损伤、DNA交联损伤、放射生物学等领域中一项重要的研究工具。

【1，2】近年来，国内关于这一方法的应用的报道日益增多【3～5】，可以预见，SCGE技术随着其方法的逐渐标准化，定将在今后得到更加广泛的应用。

因此，本文拟就有关SCGE方法的产生、操作程序、影响因素等作一综述。

1.SCGE的诞生（DNA损伤检测方法的研究）DNA损伤与修复是遗传毒理学及分子流行病学研究的一个重要目标，很久以前人们就在寻求一种合适的检测这一效应的方法。

从使用DNA材料上分可将各种方法归为两类：（1）以裸DNA为材料检测，即通过去污剂、蛋白水解等方法去除附着于DNA上的其他细胞组分，分离出DNA；（2）以拟核为材料，即DNA构型（环区）保留于核骨架上，超螺旋结构不变。

SCGE技术属于第二种方法，显然，拟核成分的检测较裸DNA要方便得多【6】。

在此基础之上，早期的同位素示踪法因需提供同位素标记的样品，并预先确定合适的标记部位。

为解决此不便，目前多采用直接检出DNA损伤后直接生成的单链断裂【7】。

最初，Lett等应用碱性蔗糖梯度离心法测定DNA单链分子量，用于研究哺乳动物细胞的DNA损伤【8】。

不久Kohn等又将其改进为更为灵敏的碱性洗脱法，成为一种较稳定的检测方法【9】。

但是这些技术的灵敏度仍不能满足现在研究的要求，干扰因素多，同时要有放射性同位素示踪。

1984年由Ostling和Johanson首先介绍的SCGE技术在这些方面得到了显著改善，特别在1988年经Singh等完善的单细胞碱性微板电泳技术后，本方法已成为检测单个细胞DNA单链断裂的首选方法【2】。

二、实验流程
采用碱性SCGE，其基本操作过程包括：
1.细胞制取
• 取处于对数生长期的Hela细胞，吹 打为单细胞悬液，用PBS调节细胞密 度为105-106 个/ml。
2.细胞染毒
• 染毒组：取1ml细胞悬液加入10-3 M H2O2 溶液50μl ，混匀，37℃ 水浴30min； • 阴性对照组：取1ml细胞悬液加入50μl PBS缓冲液，同等条件下水浴30min。
• 经碱处理和在碱性电解质的作用后，DNA 解旋，损伤的DNA断链及其片段会被释放 出来，而在电泳条件下， DNA片段可进入 凝胶孔隙发生迁移。由于这些DNA分子量 很小，所以在电泳过程中会离开核DNA向 正极移动，形成彗星状的图像。 • 在一定条件下，DNA迁移距离和DNA含量分 布与DNA损伤程度呈线性相关。随着DNA损 伤程度加剧，断片数目增加，表现为尾部 DNA含量增加，彗尾延长，荧光强度加强。
3.制片
• 第一层胶：在完全磨毛的载玻片上 铺180μL质量分数为 1%的正常熔点 琼脂糖(NMA)，室温固化10min； • 可将玻片用吹风机稍微加热，以延 缓琼脂糖凝固。
• 第二层胶：取50μL 质量分数为0.8%的 低熔点琼脂糖（LMA）和30μL的细胞悬 液，混匀后滴加于第一层胶上，加该盖 片使其均匀铺开，4℃凝固10min；
8. 染色观察 • 用20μg/L的吖啶橙染色3－5min， 用双蒸水洗掉表面的染料，24小 时内在荧光显微镜下观察。
三 结果观察
50
45
40
Tail DNA%18
100 150
Tail moment
16 ¶ H2O2Ũ È 14 12 10 8 6 4 0 50 100 150
实验十七单细胞凝胶电泳技术丁书茂实验十七单细胞凝胶电泳技术丁书茂?单细胞凝胶电泳技术singlecellgelelectrophoresisscge也称彗星试验cometassay是ostlingo和johansonkj首次提出后经singh等进一步完善的一种在单个细胞水平上检测dna损伤交联和修复的方法

(8) PI染色
用浓度为2μg/ml的PI染色液4℃染色5min。染色结束，用 预冷的PBS漂洗2min，弃PBS，50%甘油保湿。3h内阅完 玻片。
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操作步骤
(10)镜检
使用荧光正置显微镜观察玻片，仪器参数设置为490nm激 发光(蓝绿色，看见红色荧光)、200倍观察、TIFF格式保存 文件。阅片时要保持玻片湿润，先低倍大体观察，再选择 有代表性区域阅片。
应用：是检测DNA微损伤的新方法， 在国际遗传毒性检测程序工作会议上已得到认可。 检测诱变剂、射线等对DNA的损伤、 监测环境污染物对机体的遗传损害、 研究毒物致癌机制，等
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单细胞凝胶电泳(single cell gel electrophoresis, SCGE)
特点： ①实验流程短(一天可完成实验); 图像获取和数据分析可隔日 完成； ②在单细胞水平上对DNA损伤进行可视性检测； ③准确性好、灵敏度高。
铺好的玻片完全浸入临用配制的预冷细胞裂解液中，4℃ 水 平放置，裂解2 h。
(5) 解链
将载玻片小心浸入预冷的解链电泳液中，4℃水平放置， 解 链0.5h。
(6) 电泳
接通电源，在300mA和25V条件下电泳20min。(调节液面)
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操作步骤
(7) 中和
电泳结束，将载玻片小心转移到托盘，浸入中和液中和 20min。中和后用冰水洗2次，2min/次。
(11)单细胞凝胶电泳结果分析
每片随机观察100个细胞，计数彗星细胞百分率，用目镜 测 微尺测量彗星细胞尾矩，进行统计学分析。 统计学分析：采用SPSS软件进行单因素方差分析，各组 间 两两比较采用q检验。
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实验记录
表1 不同剂量镉处理LO2细胞中彗星细胞百分率和尾长比较

由于 Ｓ Ｇ Ｃ Ｅ具有 敏感 、 简便 、 速 、 耗等 优 点 ， 快 低 因
的臭氧 与碳 氢化合 物超标 ， 通过 观察泪 管上皮细胞 Ｄ Ａ受到损伤的程度 ， Ｎ 确定北部空气中的臭氧浓度偏
高于南部 地 区 。
细胞 凋亡 是细 胞增 殖 、 分化 和死 亡过 程 的重 要 调
此被广泛应用在 Ｄ Ａ的损伤与修复、 Ｎ 遗传毒理 、 环境
在 一定条件 下 ， Ｎ 的 迁 移距 离 （ 星 尾 长 ） Ｄ Ａ ＤＡ 彗 和 Ｎ
的含 量 （ 光 强 度 ） Ｄ Ａ 损 伤 呈 线性 相关 ， 过 测 荧 与 Ｎ 通 定 Ｄ Ａ迁 移 部 分 的 光 密 度 或 迁 移 距 离 可 以推 测 出 Ｎ Ｄ Ａ的损 伤程 度 … 。 Ｎ
１ 单细胞 凝胶 电泳
效应也是遗传毒理学研究的重要内容。建立快速灵敏 的 Ｄ Ａ 损 伤 检 测 方 法 ， 于 毒 性 因 素 的 检 测 、 胞 Ｎ 对 细 Ｄ Ａ的 保 护 都 是 非 常 有 益 的 。Ｓ Ｇ 不 仅 能 提 供 Ｎ ＣＥ
单 细 胞 凝 胶 电 泳 （ ｉｇｅＣ ｌＧ ｌＥｅｔ ｐｏｅｉ Ｓｎｌ ｅ ｅ ｌｃｏｈｒｓ ｌ ｒ ｓ Ａ ｓｙＳ Ｇ ） ｓａ，Ｃ Ｅ 又称 彗 星试 验 （ ｏ ｔ ｓ ｙ 。它 的分离 Ｃｍｅ Ａｓ ） ａ 原理 是根据 当各种 内源 性 或外 源 性 Ｄ Ａ损 伤 因子 诱 Ｎ 发 Ｄ Ａ链 断裂 时 ， Ｎ Ｎ Ｄ Ａ的超 螺旋 结 构被 破 坏 ， 在细 菌 裂解液作 用 下 ， 细胞 内的蛋 白 质 、 Ｎ Ｒ Ａ等 扩 散 到细 胞 裂解 液 中 ， 核 Ｄ Ａ 由于分子量 过大停 留在 原位 。在 而 Ｎ 中性 条件 时 ， 留 的 Ｄ Ａ 片段 可进 入 凝胶 发 生 迁移 ， 残 Ｎ 这时 用碱处理 或在 碱性 电解质 条 件下 ， Ｎ Ｄ Ａ会 发 生解

彗星实验(Comet assay),又称单细胞凝胶电泳(Single cell gel electrophoresis，SCGE),各种理化因子作用细胞后引起的DNA链的断裂可用该方法检测[1～3]，并在统计学基础上对损伤程度做出评估[4]。

本实验对Singh等[5]建立的碱性彗星实验的一些步骤作了改良。

用超净工作台上的紫外消毒灯[可发射波长为254 nm的紫外线(Ultraviolet，UV)，属于UVC 波段范围]作为DNA损伤的诱导因子[7～9]，诱导K562细胞DNA损伤，用改良彗星实验检测损伤程度，验证改良的实验系统是否可靠，同时筛选并评价D N A损伤的分析指标。

1 材料与方法1.1 细胞K562细胞，来源于第四军医大学免疫学教研室，37 ℃、5％CO2培养箱中培养，取对数期细胞进行实验。

1.2 紫外线照射装置紫外消毒灯(ZSZ-20型，20 W，天津市紫晶特种光源有限公司)。

1.3 主要试剂和仪器培养基：10％新生牛血清(杭州四季青公司)，90％ RPMI-1640培养液(Hyclone公司)；双抗(青、链霉素，100 UI/ml)；Triton X-100(Genview分装)；二甲基亚砜、肌苷酸钠(Sigma分装)；低熔点琼脂糖(FMC分装)；常熔点琼脂糖(Spanish分装)。

其余生化试剂均为分析纯。

电泳仪：由西北大学物理系提供；电泳槽：DYC33A型(北京市六一仪器厂)；显微镜：Leica DM LB 2 (Leica 公司)；彗星图象分析软件：CASP 软件(casp-1.2.21.4 实验分组及UV处理收集对数生长的K562细胞，台盼蓝染色计数，细胞活力大于95％，用Hank's(pH7.4)调整细胞密度至1×105/ml，接种于塑料培养皿中(ф=35 mm，2 ml/plate)，然后进行紫外线照射(0.3 mW/cm2)。

实验分为对照组和8个照射组，各照射组分别照射3、5、10、40，60、120、180、240 s，对照组不进行紫外线照射，之后进行彗星实验。

彗星电泳法引言彗星电泳法（Comet assay），又称为碱性单细胞凝胶电泳（alkaline single-cell gel electrophoresis），是一种常用于评估DNA单链断裂程度及修复能力的实验技术。

该方法采用凝胶电泳原理，可以通过观察DNA在电泳中的迁移情况，定量分析DNA的双链断裂、单链断裂及碱解位点等信息，从而评估DNA的损伤程度。

彗星电泳法的原理彗星电泳法的原理是基于以下核心步骤：首先，细胞样品被混悬于低熔点琼脂糖凝胶中，并在裂解液中经过裂解，使DNA在凝胶中解旋并生成碱性单链凝胶。

然后，电泳运行期间，电场引起DNA向阳极移动，而碱解位点产生的碱性断裂会导致DNA 片段扩散，形成类似彗星尾巴的凝胶结构。

最后，经过染色和显微镜观察，可以评估DNA的尾巴长度和形态，进而对DNA的损伤程度进行定量分析。

彗星电泳法的步骤1.细胞样品准备：从感兴趣的组织或细胞中获取细胞样品，确保准备成单细胞悬液。

2.碱性裂解：将细胞样品与裂解液混合，并孵育一段时间，使DNA完全解旋并生成碱性单链凝胶。

3.电泳运行：将样品嵌入琼脂糖凝胶中的水平电泳槽中，通过施加电压使DNA向阳极运动，进行电泳分离。

4.染色和显微镜观察：完成电泳后，对凝胶进行染色处理，然后在显微镜下观察和拍照记录。

5.图像分析和结果计算：通过图像处理软件对拍摄的彗星图像进行分析，计算出DNA尾巴长度、形态等参数，从而评估DNA的损伤程度。

彗星电泳法的应用彗星电泳法在生物医学研究领域具有广泛的应用，主要用于以下几个方面：1. 检测环境致突变物质彗星电泳法可以用于评估环境中存在的致突变物质对细胞DNA的损伤程度，如化学物质、辐射等。

通过比较不同处理组织样品的彗星图像特征，可以评估不同处理条件下DNA的损伤程度，进而评估致突变物质的毒性和致突变性。

2. 评估细胞DNA修复能力彗星电泳法可以用于评估细胞对DNA损伤的修复能力。

研究人员可以在不同时间点收集细胞样品，然后通过彗星电泳法评估不同时间点DNA损伤的程度，从而了解细胞DNA修复过程中的动态变化。