彗星实验步骤Comet assay

彗星试验步骤范文彗星试验是一种用于检测和评估新药物或化合物的毒性和安全性的实验方法。

下面是彗星试验的步骤：1.实验前准备：-准备细胞培养物：选择一种常用的哺乳动物细胞系，如人肺细胞株。

培养细胞，并确保细胞处于稳定的生长状态。

-准备测试物溶液：将待测试的化合物溶解在适当的溶剂中，以得到所需的浓度。

根据先前的研究或文献，确定起始浓度和待测物的浓度范围。

2.计算细胞培养物数量：根据实验设计和所需的浓度范围，计算出需要的细胞数量。

3.处理细胞：将细胞分为多个处理组和对照组。

每个处理组使用不同浓度的待测物处理细胞，对照组仅使用培养基或溶剂作为对照。

4.孵育细胞：将处理后的细胞培养物放入恒温培养箱中孵育。

按照特定的条件（温度、湿度、CO2浓度等）进行培养。

5.细胞收集：在设定的时间点，收集细胞并通过离心将细胞沉淀下来。

清除培养基及其他杂质。

6.细胞裂解：使用一种适当的裂解液（如悬浮剂），将细胞裂解并释放核酸。

7.准备凝胶：准备琼脂糖凝胶，通常是用琼脂糖粉末和缓冲液混合制备。

8.凝胶电泳：将裂解液样品和标准DNA样品分别加载到琼脂糖凝胶孔中。

使用电场使DNA片段从样品中迁移出来。

9.DNA染色：使用DNA染料（如Ethidium bromide）染色凝胶，以可视化DNA片段。

10.凝胶成像和分析：使用紫外线照明或分子影像系统观察凝胶上DNA片段的大小和形状。

使用适当的软件测量和分析DNA损伤程度。

11.数据分析：将实验结果转化为数值形式，使用统计学方法进行数据分析，如计算DNA损伤指数或计算细胞生存率。

比较不同浓度的样品与对照组的差异。

12.结果解读：根据实验结果，评估待测物的毒性和安全性。

根据不同浓度的处理组的DNA损伤程度，确定药物是否具有潜在的毒性。

13.结论和报告：对实验结果进行解读，并得出结论。

根据实验结果撰写报告，包括实验设计、方法、结果和结论。

需要注意的是，彗星试验作为一种初步的毒性评估方法，通常需要与其他细胞毒性测试方法结合使用，以全面评估待测物的安全性。

彗星实验步骤范文彗星是一种天体现象，指的是在太阳系内绕太阳运行的一类小天体。

彗星的核心主要由冰和岩石组成，当与太阳接近时，晶体冰会热化并以气体形态释放出来，形成彗尾。

彗星实验可以帮助我们更好地理解彗星的形成和性质。

以下是彗星实验的步骤：材料：-一块冰块-一盆水-一小束干冰-一台射灯或强力手电筒-一个黑暗的室内或夜晚的户外空间步骤1：准备冰块和水在一盆水中放入一块冰块，确保冰块完全浸泡在水中。

这样可以模拟太阳系中的彗核。

步骤2：制作彗尾将一小束干冰放在碗中或任何合适的容器中。

干冰是固态二氧化碳，具有非常低的温度，当它接触到周围的空气时，会迅速蒸发并形成气体。

这模拟了彗星接近太阳时晶体冰的热化过程。

确保干冰不会直接接触到水。

步骤3：创建黑暗环境将彗星模型置于黑暗的室内或夜晚的户外空间中。

这样可以让彗尾更加清晰可见。

步骤4：使用射灯或手电筒将射灯或强力手电筒对准盆中的冰块，并打开它。

这样可以模拟太阳的辐射对彗核的加热作用。

步骤5：观察彗尾的形成当射灯或手电筒照射到冰块上时，干冰会迅速蒸发，并产生一道透明或白色的气体云。

这个气体云模拟了彗尾的形成，它会围绕彗核散开。

步骤6：测量和记录使用测量工具可以测量彗核的直径，以及彗尾的长度和宽度。

同时，记录彗尾的颜色和形态。

步骤7：改变实验条件尝试改变冰块的形状、大小和温度等条件，观察和记录彗尾的变化。

这有助于了解不同条件对彗尾的影响。

步骤8：分析和总结根据观察和记录的数据，分析彗尾的形成和特征。

比较不同实验条件下彗尾的差异，并总结出彗尾的性质和形成机制。

总结：通过这个实验，我们可以更好地理解彗星的形成和性质。

彗尾的形成是由彗核受到太阳辐射的加热而导致晶体冰热化释放出来的气体所形成的。

实验中可以通过改变不同的条件，观察和比较彗尾的差异，更深入地了解彗尾的形成机制。

此外，实验还可以帮助我们理解彗星的形态特征，如彗核的大小、彗尾的长度和宽度等。

在实验的基础上，我们可以进行更深入的研究，以便更好地了解和探索太阳系中的彗星现象。

单细胞凝胶电泳试剂盒（彗星实验）使用说明书一 单细胞凝胶电泳实验介绍单细胞凝胶电泳( Single Cell Gel Electrophoresis, SCGE) 又名彗星试验(comet assay)， 1984 年起用于检测的真核细胞的DNA 断裂和修复，具有方法灵敏、快速优点，同时既可以定性又可以定量，目前DNA 损伤检测的其他方法（Giemsa 染色法,TUNUL 法、DNA 电泳梯度法、流式细胞检测法）是无法比拟的。

彗星实验是检测DNA 微损伤和修复的新方法，得到国际遗传毒性检测程序工作会议认可。

彗星实验是简单、快捷检测DNA 微损伤的方法，被广泛应用于遗传毒理、放射生物学、生物监测、癌症化疗和细胞凋亡、衰老等领域。

是一个十分成熟的技术，逐渐成为快速检测DNA损伤的一种方法，尤其应用于新药开发、保健品开发、化妆品开发、环境监测和毒理学研究等领域。

彗星实验具有以下优点：1 适用范围广，不仅适用于静止状态的细胞，且对T 和B 淋巴细胞敏感；2 所需实验器材较少，一台荧光显微镜和一套电泳装置即可完成彗星实验；3 实验流程短，一天可完成一个实验流程，且图像获取和数据分析可隔日完成；4 安全性好，避免了同位素的使用；5 在单细胞水平上对DNA 损伤进行可视性检测；6 准确性好、灵敏度高；7 属于新技术，客观实际，国际遗传毒性学术委员会认可。

二、试剂盒组成（见试剂盒内）三、试剂使用说明（见试剂盒内）四、操作步骤1.各种细胞用冰冷的PBS 洗一次，离心收集，用PBS 重悬，密度为1×104-5个/ml。

2.铺胶：下述各浓度琼脂糖凝胶均用PBS 配制。

3.第1 层凝胶的制备：将加热熔解的正常熔点琼脂糖(NMA)，冷至45-60℃，取适量铺于载玻片CometSlide上，再置4℃下10min 使NMA 凝固。

也可以先铺胶，晾干后无尘存放，1周内使用（据经验，此法较优）。

4.第2 层凝胶的制备：低熔点琼脂糖LMA在60-70℃水浴加热至少20min 使之完全溶化，冷至37℃（可以放置于细胞培养箱中或水浴箱冷却至37℃，低熔点琼脂糖LMA在37℃可维持3小时）。

附件15体内彗星试验In Vivo Mammalian Alkaline Comet Assay1 范围本规范确定了体内彗星试验的基本原则、要求和方法。

本规范适用于化妆品原料的遗传毒性检测。

2 试验目的评价化妆品用原料的遗传毒性。

3 定义3.1 碱性单细胞凝胶电泳：在单个细胞或细胞核水平检测DNA损伤的一种敏感技术。

3.2 彗星：经过电泳后细胞核的形状，形似彗星。

细胞核部分形成彗星头部，在电场力的作用下脱离细胞核的DNA片断形成彗尾。

3.3 “刺猬状”细胞：显微图像下由小或模糊不清的头以及大的弥漫性尾组成的细胞。

3.4 尾部DNA含量：反应总强度（彗头与彗尾之和）中彗星的强度。

可反应DNA片断的数量，用百分比表示。

3.5 最大耐受剂量：试验期内引起动物产生轻微毒性效应的最高剂量，在这个剂量下，动物产生明显的临床体征，如异常行为或反应，轻微的体重下降或靶组织细胞毒性，但是并不会引起死亡或痛苦。

4 试验原理DNA双螺旋结构在强碱性溶液中（pH>13）会松弛，在电场力的作用下，正常的DNA 保留在原位不动，而单链或双链DNA断裂所形成的DNA片断在会向阳极移动，形成彗星状。

DNA片断所形成的彗星状拖尾的长度及强度可以反应DNA片断的大小和数量。

通过检测尾部DNA含量（%）等终点指标可以评价DNA损伤程度。

5 试验基本原则动物染毒一定时间后处死并解剖动物，获取靶器官，制备单细胞悬液。

单细胞悬液与琼脂糖混合后经过裂解过程去除细胞膜，并暴露于强碱性溶液（pH>13）中进行DNA解旋，经过电泳、固定、染色，在荧光显微镜下观察，通过分析软件对彗星状细胞进行分析，判定DNA损伤程度。

每个样品需分析足够数量的细胞进行最终结果评价。

6 溶液的配制（所有溶液均现用现配）6.1 0.5%(w/v) 低熔点凝胶低熔点胶以0.5%(w/v)的浓度溶于D-PBS（无Ca2+、Mg2+和酚红）溶液中，并利用微波炉加热。

单细胞凝胶电泳分析法单细胞凝胶电泳分析法(彗星分析法)治愈癌症是一个难题,长期以来科学家们一直在苦苦探索.我们目前知道,致癌的过程与许多因素有关，但如果我们能阻止其中的任何一个步骤，癌细胞便无法形成。

因此,探测致癌物质的技术与癌细胞的及时发现就显得尤其重要！然而截至目前为止，科学家们仍无法研究出一种简易基因测试法或综合的方法来检测出可能的致癌物。

因此，致癌物对ＤＮＡ的作用仍是癌症研究的一个重要课题。

遗传毒物学为一专门研究化学及各类物质对人体遗传基因影响的科学。

人体每天暴露在大量的化学物质当中，为了诊测这些物质对人体ＤＮＡ的影响，科学家们发明了多种测定方法，然而，多年来人们所使用的这些测试方法却不能准确与快速的辨识出会使人体致癌的物质。

为了解决这些问题，单细胞凝胶电泳法（Single Cell Gel Assay）应运而生，通常亦称之彗星分析法（Comet Assay）。

它之所以称为彗星分析法是因为被破坏的DNA形似彗星，此方法已被证实是最具敏感性又最具快速性的方法。

研究人员使用这种方法可在２４小时内获得初步结果，在十天之内能得到结论性的证据。

此种测定方法速度远快于其它方法，不仅可以测出某种物质是否是致癌物，而且还可测出被破坏细胞的损害程度。

彗星分析法是用来判别某种物质是否是致癌物，并衡量其对人体ＤＮＡ修补的影响程度，这一分析过程是将健康的人体白血球接触于被测试的物质后，然后再用彗星分析法来进行测试，如果被测试的物质是致癌物质，那么ＤＮＡ将被破坏，而被损坏的ＤＮＡ将开始游离细胞核，形成彗星形状。

ＤＮＡ受到致癌物质的损坏愈大，ＤＮＡ碎段就愈多，愈小的ＤＮＡ碎段游离的速度就愈快，也游离愈远，因而形成了彗星的尾部，而较大的一些碎段位置则靠近细胞核，因而形成彗星的头部。

ＤＮＡ碎段的游动的程度不同 使它呈现出彗星状，使研究人员能很容易看清细胞的损害程，彗星的长度与ＤＮＡ的损害程度有关，此长度是指从细胞核到彗星尾端的距离，也就是说，彗星尾端愈长，细胞的损害程度愈大。

陕西师范大学硕士学位论文单细胞凝胶电泳——彗星实验方法的建立、改良与应用姓名：罗明志申请学位级别：硕士专业：动物学指导教师：齐浩20050501单细胞凝胶电泳——彗星实验方法的建立、改良与应用罗明志摘要单细胞凝胶电泳（ｓｉｎｇｌｅｃｅｌｌｇｅｌｅｌｅｃｔｒｏｓｉｓ，ＳＣＧＥ），又称彗星实验（ｃｏｍｅｔａｓｓａｙ），是一种在单细胞水平进行ＤＮＡ损伤的检测方法，具有简便、灵敏、快捷、样品用量小等优点，广泛用于遗传毒性检测、环境毒性检测、分子流行病学和ＤＮＡ损伤与修复等研究领域。

我们在本实验室建立了单细胞凝胶电泳技术，并对部分操作流程进行了改良，包括（１）制胶方法改良；（２）增加水洗；（３）进行梯度酒精脱水。

在上述改良过程中，我们用“灌胶”法在载玻片上制胶，替代了传统的使用磨砂载玻片上“三明治”制胶，解决了彗星实验中常见的脱胶现象，脱水后有利于获得平整胶面：在裂解后增加了水洗步骤，以消除裂解液中的高盐和去垢剂对后续实验操作的影响；采用直流稳压电源进行单细胞电泳，保证了实验结果的可重复性；对染色的条件进行了筛选，确定了使用ＥＢ作为细胞ＤＮＡ的荧光染料；以ＣＡＳＰ（免费）作为彗星图像的分析软件，建立了图像分析的方法。

这些实验步骤的改良以及实验流程的优化或标准化．简化了操作程序，节省了时间，并使结果分析更加简便。

为了验证上述改良后的实验系统是否可靠，我们用紫外线作为损伤因子处理细胞，诱导细胞ＤＮＡ损伤，然后用彗星实验检测这一损伤。

从这～阳性模型的结果分析来看，发现细胞损伤呈现出很好的时间依赖性，表明该实验系统的可靠性。

我们同时筛选并评价了彗星实验中有关的ＤＮＡ损伤分析指标，发现ＴａｉｌＬｅｎｇｔｈ，ＣｏｍｅｔＬｅｎｇｔｈ，ＴａｉｌＭｏｍｅｎｔ和ＯｌｉｖｅＴａｉｌＭｏｍｅｎｔ作为ＤＮＡ损伤的评价指标比较可靠。

我们建立了肝细胞的组织块原代培养系统。

在建立肝细胞组织块原代培养实验流程中，我们对实验的各个步骤，例如组织块贴壁需要的时间、细胞生长所需的培养基种类、培养基添加剂以及动物组织供体年龄等进行了筛选，建立了小鼠肝细胞组织块的原代培养系统。

彗星实验(Comet assay),又称单细胞凝胶电泳(Single cell gel electrophoresis，SCGE),各种理化因子作用细胞后引起的DNA链的断裂可用该方法检测[1～3]，并在统计学基础上对损伤程度做出评估[4]。

本实验对Singh 等[5]建立的碱性彗星实验的一些步骤作了改良。

用超净工作台上的紫外消毒灯[可发射波长为254 nm的紫外线(Ultraviolet，UV)，属于UVC波段范围]作为DNA损伤的诱导因子[7～9]，诱导K562细胞DNA损伤，用改良彗星实验检测损伤程度，验证改良的实验系统是否可靠，同时筛选并评价DNA损伤的分析指标。

1 材料与方法细胞K562细胞，来源于第四军医大学免疫学教研室，37 ℃、5％ CO2培养箱中培养，取对数期细胞进行实验。

紫外线照射装置紫外消毒灯(ZSZ-20型，20 W，天津市紫晶特种光源有限公司)。

主要试剂和仪器培养基：10％新生牛血清(杭州四季青公司)，90％RPMI-1640培养液(Hyclone公司)；双抗(青、链霉素，100 UI/ml)；TritonX-100(Genview分装)；二甲基亚砜、肌苷酸钠(Sigma分装)；低熔点琼脂糖(FMC 分装)；常熔点琼脂糖(Spanish分装)。

其余生化试剂均为分析纯。

电泳仪：由西北大学物理系提供；电泳槽：DYC33A型(北京市六一仪器厂)；显微镜：Leica DM LB 2 (Leica 公司)；彗星图象分析软件：CASP软件(casp-1.2.2，下载)；CO2培养箱：BB16HF型(上海力申科学仪器有限公司)；环地牌紫外辐照计(北京师范大学光电仪器厂)。

实验分组及UV处理收集对数生长的K562细胞，台盼蓝染色计数，细胞活力大于95％，用Hank's 调整细胞密度至1×105/ml，接种于塑料培养皿中(ф=35 mm，2 ml/plate)，然后进行紫外线照射 mW/cm2)。

彗星实验(Comet assay),又称单细胞凝胶电泳(Single cell gel electrophoresis，SCGE),各种理化因子作用细胞后引起的DNA链的断裂可用该方法检测[1～3]，并在统计学基础上对损伤程度做出评估[4]。

本实验对Singh 等[5]建立的碱性彗星实验的一些步骤作了改良。

用超净工作台上的紫外消毒灯[可发射波长为254 nm的紫外线(Ultraviolet，UV)，属于UVC波段范围]作为DNA损伤的诱导因子[7～9]，诱导K562细胞DNA损伤，用改良彗星实验检测损伤程度，验证改良的实验系统是否可靠，同时筛选并评价DNA损伤的分析指标。

1 材料与方法1.1 细胞K562细胞，来源于第四军医大学免疫学教研室，37 ℃、5％ CO2培养箱中培养，取对数期细胞进行实验。

1.2 紫外线照射装置紫外消毒灯(ZSZ-20型，20 W，天津市紫晶特种光源有限公司)。

1.3 主要试剂和仪器培养基：10％新生牛血清(杭州四季青公司)，90％RPMI-1640培养液(Hyclone公司)；双抗(青、链霉素，100 UI/ml)；TritonX-100(Genview分装)；二甲基亚砜、肌苷酸钠(Sigma分装)；低熔点琼脂糖(FMC 分装)；常熔点琼脂糖(Spanish分装)。

其余生化试剂均为分析纯。

电泳仪：由西北大学物理系提供；电泳槽：DYC33A型(北京市六一仪器厂)；显微镜：Leica DM LB 2 (Leica 公司)；彗星图象分析软件：CASP软件(casp-1.2.2，/index.php下载)；CO2培养箱：BB16HF型(上海力申科学仪器有限公司)；环地牌紫外辐照计(北京师范大学光电仪器厂)。

1.4 实验分组及UV处理收集对数生长的K562细胞，台盼蓝染色计数，细胞活力大于95％，用Hank's(pH7.4)调整细胞密度至1×105/ml，接种于塑料培养皿中(ф=35 mm，2 ml/plate)，然后进行紫外线照射(0.3 mW/cm2)。

彗星实验(英语版)彗星”分析法在放射生物学中的应用来源：广东医学杂志点击数：196 更新时间：2007-4-25 文章录入：Admin“彗星”分析法在放射生物学中的应用贺玉香综述夏云飞审校中山大学肿瘤防治中心放疗科(广州510060)“彗星”分析法（comet assay）又叫单细胞凝胶电泳（single cell gel eletrophoresis, SCGE）或微凝胶电泳，是一种比较理想的单细胞水平检测哺乳类有核细胞DNA损伤的新技术。

由Ostling等［1］1984年首次提出，后经Singh等［2］逐渐改进。

现主要分为中性SCGE和碱性SCGE。

其原理如下：去污剂或高盐裂解溶液破坏细胞膜，使得95%以上的蛋白质及细胞内其他成分渗出膜进入溶解液，DNA由于相对分子质量大而留在原位。

电泳时小的DNA断片在电场作用下移出细胞核。

经溴乙啶染色后在紫外线(uv)照射下发出荧光，每个受损的细胞均呈现“彗星”外观，明亮的头部为细胞核，一系列的DNA断片组成“彗尾”。

未受损的细胞只有“彗核”而无“彗尾”。

DNA断片迁移的距离与DNA断片分子质量和电荷数相关，DNA断片越多、越小，“彗尾”越长，又因荧光染料与DNA的结合是特异性的，因此，通过测定“彗星”尾部长度和荧光强度可推测DNA链断裂情况。

如为中性裂解液加上50 ℃的处理只能破坏DNA超螺旋结构，而DNA双螺旋结构保存完好，只有小的双链片段在电场作用下移出细胞核，形成“彗星”尾部，故主要用于DNA双链断裂的检测。

而碱性SCGE中用碱性裂解液（pH>123）处理细胞，不但使细胞内蛋白成分更彻底地分离，也有利于DNA双螺旋破坏和单链片段移行，故用于检测DNA单链断裂。

此法的突出优点是灵敏度高。

它可以测出每1657×10－17 kg中01个DNA的断裂，甚至检出自然光照体外淋巴细胞1 h 引起的DNA损伤［3］。

故可研究低剂量下的生物效应。

单细胞凝胶电泳技术，又称彗星试验（comet assay)是19世纪60年代在核沉淀和光环测试等检测技术基础上演化而来的一种检测真核细胞DNA损伤与修复的方法1988年Singh首次提出碱性电泳技术，用来检测单链DNA断片在1995年单细胞凝胶电泳技术我国逐渐开展SCGE的原理•细胞核中的DNA为超螺旋结构并且致密，在强碱的条件下，DNA双股结构打开，单链上的断片可以释放出来•包埋在凝胶中的细胞形成一个小室，细胞膜破裂后细胞的其他成分可以扩散到裂解液中，而DNA只能留于小室内•在电场力的作用下带负电荷的影像•DNA向阳极泳动，荧光染色后可观察到彗星样SCGE的操作流程实验设计、染毒→制备细胞悬液→制片→铺胶→裂解→解螺旋→电泳→中和、染色→观察结果和记录SCGE的实验方法与技术 溶液的配置碱性裂解液：2.5M NaCl、100mMEDTA-Na2、100mMTris、1%Triton X-100、10%DMSO(后两者临用前加）碱性电泳液：300mM NaOH,1mMEDTA-Na2中和液：0.4M Tris-HCL溴乙锭应用液：20ưg/ml实验步骤 染毒、试验分组及对照▪体外试验：受试物+细胞（培养基或琼脂糖细胞悬液）染毒时间H2O215分钟，其他一般1小时▪体内试验：受试物+动物（适当途径）染毒时间1-72小时 染毒、试验分组及对照▪体外试验：受试物+细胞（培养基或琼脂糖细胞悬液）染毒时间H2O215分钟，其他一般1小时▪体内试验：受试物+动物（适当途径）染毒时间1-72小时体外试验：受试物+细胞（培养基或琼脂糖细胞悬液）染毒时间H2O215分钟，其他一般1小时体内试验：受试物+动物（适当途径）染毒时间1-72小时至少设3个剂量，外加1个阳性对照、1个阴性对照，每组至少3-5只动物，每个样品设2个平行样对照阴性对照：不加任何处理的细胞悬液，或受试物所用溶剂处理的细胞悬液。

体外试验用溶剂做对照阳性对照：体外用双氧水、体内常用环磷酰胺样品的制备淋巴细胞：用淋巴细胞分离液全血细胞：20μl全血＋0.4-1ml HBSS混匀，1500rpm离心后，留沉淀，加100μl LMA 骨髓细胞：1ml HBSS冲洗骨髓腔，1500rpm离心，留沉淀，加100 μl LMA※固体组织：将所取组织块放在5ml HBSS的平民中剪碎，取20 μl 与LMA混合培养细胞：取20 μl 悬液与LMA混合备用制片载玻片及盖玻片的处理新玻片：1%稀盐酸和酒精中浸泡，过双蒸水旧玻片：洗净后过双蒸水，无水酒精玻片清洗不彻底，容易导致脱胶在荧光显微镜下挑选无自发荧光背景暗的玻片减少干扰预制载玻片配置0.6%NMA，注意保温，将载玻片垂直浸入2s后取出，擦去多余的琼脂糖，水平放置使凝固，可放在80°C孵育至干燥，保存铺胶70-100 μl 0.6%-1.5%NMA↓加盖玻片，4 °C，5-10min，去盖玻片↓含有10-20 μl 细胞悬液的50-100 μl 0.5%-1%LMA↓加盖玻片，4 °C，5-10min，去盖玻片↓60-80 μl 0.5%LMA↓加盖玻片，4 °C，5-10min，去盖玻片 裂解去盖玻片，将载玻片放入新配置的4 °C预冷30-60min的裂解液中，4 °C避光裂解1小时以上解螺旋将裂解后的玻片取出，用PBS冲洗，吸干液体后将玻片并列置于电泳槽阳极附近，玻片间不留空隙，加电泳液液面高出玻片0.2cm，电泳槽放置于冰水浴中20min电泳电压25v，电流300mA，4 °C电泳20min中和与染色将玻片取出倒入中和液，中和两次，每次10min，用EB在暗处染色15min,然后可漂洗10min，然后可观察。