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彗星试验步骤1.5.4 彗星试验（单细胞凝胶电泳试验）：参照文献[i]，略加改动，进行碱性单细胞凝胶电泳，具体如下。
1.5.4.1 制片将0.6%的NMPA（用PBS配制）于微波炉中加热融化后，浸泡磨砂玻片，用吸水纸将玻片滑面及四周吸干，自然晾干备用。
1.5.4.2 铺胶取1.5.3中所备细胞悬液10μl，向其中加入70μl 37℃0.7%LMPA（用PBS配制），混匀后迅速滴于37℃预热的玻片上，立即盖上盖玻片，4℃固化10min。
1.5.4.3 裂解轻轻取下盖玻片，将玻片浸于新鲜配制并预冷的细胞裂解液中，4℃避光裂解1h。
1.5.4.4 解旋从裂解液中取出载玻片，用PBS浸泡玻片3×3min。
用纸巾吸去玻片上残留的液体，置于水平电泳槽中，加新鲜配制的碱性电泳缓冲液至高于玻片表面3mm 以上，避光解旋30min。
1.5.4.5 电泳电压25V，调整液面高度使电流达到300mA，电泳25min。
1.5.4.6 漂洗及染色电泳完毕，取出玻片，用PBS浸泡2×15min，以中和强碱。
用纸巾吸去玻片上残留的液体，然后滴加20μg/ml的EB20μl，盖上盖玻片，立即置荧光显微镜下观察。
以上步骤尽量在黄光下或暗处进行，避免其他原因所致的DNA损伤。
每一剂量水平制片2张。
1.5.4.7 结果观察荧光显微镜下200倍观察，激发波长515~560nm，发射波长590nm。
每一剂量水平随机观察100个细胞，记录拖尾细胞数。
计算拖尾细胞率（以下简称拖尾率），拖尾率＝(拖尾细胞数/100)×100%。
每一剂量水平用目镜测微尺测量30个拖尾细胞的全长和头长，拖尾细胞尾长（以下简称尾长，tail length，TL）＝全长－头长，计算各剂量组的平均尾长。
表1.1 MMS、MMC和NaN3的WTK1细胞彗星试验结果Table 1.1 Comet assay of MMS, MMC and NaN3 with WTK1 cell lineChemicalConc.(μg/ml)0h 20hRG a (%)Cometcell (%)TL(x±s, μm)RG a(%)Cometcell (%)TL(x±s, μm)MMS 0 100.0 6.0 3.50±1.69 100.0 3.0 3.67±3.130.625 97.2 10.0 10.38±2.92** 98.8 8.0 6.50±3.05**1.25 100.4 18.0* 24.25±4.88** 97.7 11.0 8.90±3.52**2.5 96.4 33.0** 32.08±7.40** 88.3 15.0** 18.62±4.04**5 94.8 60.0** 52.33±5.68** 86.8 44.0** 46.00±5.36** K2Cr2O7147 92.4 100.0** 78.70±4.39** －－－MMC 0 100.0 6.0 2.57±1.76 100.0 5.0 1.75±1.760.0625 100.4 6.0 3.70±1.86 96.2 9.0 3.62±1.920.125 108.1 10.0 4.04±1.52 54.6 19.0** 5.50±1.81**0.25 104.5 11.0 3.92±1.42 52.7 50.0** 22.87±3.95**0.5 87.8 17.0* 4.93±3.63 48.8 64.0** 50.17±5.80** K2Cr2O7147 105.4 100.0** 68.19±5.15** －－－NaN30 100.0 8.0 3.12±1.69 100.0 9.0 2.15±1.67 250 90.0 7.0 3.03±1.48 99.0 6.0 2.85±1.58500 102.5 8.0 3.35±1.16 97.7 9.0 3.10±1.831000 89.4 14.0 4.09±1.57 88.3 11.0 3.16±1.292000 92.2 56.0** 14.93±4.54** 86.8 52.0** 11.25±1.38** K2Cr2O7147 92.5 100.0** 72.33±6.12** －－－a Relative growth compared with corresponding solvent control*P<0.05 **P<0.01, compared with corresponding solvent control。
彗星试验步骤范文彗星试验是一种用于检测和评估新药物或化合物的毒性和安全性的实验方法。
下面是彗星试验的步骤：1.实验前准备：-准备细胞培养物：选择一种常用的哺乳动物细胞系，如人肺细胞株。
培养细胞，并确保细胞处于稳定的生长状态。
-准备测试物溶液：将待测试的化合物溶解在适当的溶剂中，以得到所需的浓度。
根据先前的研究或文献，确定起始浓度和待测物的浓度范围。
2.计算细胞培养物数量：根据实验设计和所需的浓度范围，计算出需要的细胞数量。
3.处理细胞：将细胞分为多个处理组和对照组。
每个处理组使用不同浓度的待测物处理细胞，对照组仅使用培养基或溶剂作为对照。
4.孵育细胞：将处理后的细胞培养物放入恒温培养箱中孵育。
按照特定的条件（温度、湿度、CO2浓度等）进行培养。
5.细胞收集：在设定的时间点，收集细胞并通过离心将细胞沉淀下来。
清除培养基及其他杂质。
6.细胞裂解：使用一种适当的裂解液（如悬浮剂），将细胞裂解并释放核酸。
7.准备凝胶：准备琼脂糖凝胶，通常是用琼脂糖粉末和缓冲液混合制备。
8.凝胶电泳：将裂解液样品和标准DNA样品分别加载到琼脂糖凝胶孔中。
使用电场使DNA片段从样品中迁移出来。
9.DNA染色：使用DNA染料（如Ethidium bromide）染色凝胶，以可视化DNA片段。
10.凝胶成像和分析：使用紫外线照明或分子影像系统观察凝胶上DNA片段的大小和形状。
使用适当的软件测量和分析DNA损伤程度。
11.数据分析：将实验结果转化为数值形式，使用统计学方法进行数据分析，如计算DNA损伤指数或计算细胞生存率。
比较不同浓度的样品与对照组的差异。
12.结果解读：根据实验结果，评估待测物的毒性和安全性。
根据不同浓度的处理组的DNA损伤程度，确定药物是否具有潜在的毒性。
13.结论和报告：对实验结果进行解读，并得出结论。
根据实验结果撰写报告，包括实验设计、方法、结果和结论。
需要注意的是，彗星试验作为一种初步的毒性评估方法，通常需要与其他细胞毒性测试方法结合使用，以全面评估待测物的安全性。
单细胞dna彗星实验步骤彗星实验(Comet assay),又称单细胞凝胶电泳(Single cell gel electrophoresis，SCGE),各种理化因子作用细胞后引起的DNA链的断裂可用该方法检测[1～3]，并在统计学基础上对损伤程度做出评估[4]。
本实验对Singh等[5]建立的碱性彗星实验的一些步骤作了改良。
用超净工作台上的紫外消毒灯[可发射波长为254 nm的紫外线(Ultraviolet，UV)，属于UVC波段范围]作为DNA损伤的诱导因子[7～9]，诱导K562细胞DNA损伤，用改良彗星实验检测损伤程度，验证改良的实验系统是否可靠，同时筛选并评价DNA损伤的分析指标。
1 材料与方法1.1 细胞K562细胞，来源于第四军医大学免疫学教研室，37 ℃、5％CO2培养箱中培养，取对数期细胞进行实验。
1.2 紫外线照射装置紫外消毒灯(ZSZ-20型，20 W，天津市紫晶特种光源有限公司)。
1.3 主要试剂和仪器培养基：10％新生牛血清(杭州四季青公司)，90％RPMI-1640培养液(Hyclone公司)；双抗(青、链霉素，100 UI/ml)；Triton X-100(Genview分装)；二甲基亚砜、肌苷酸钠(Sigma分装)；低熔点琼脂糖(FMC分装)；常熔点琼脂糖(Spanish 分装)。
其余生化试剂均为分析纯。
电泳仪：由西北大学物理系提供；电泳槽：DYC33A型(北京市六一仪器厂)；显微镜：Leica DM LB 2 (Leica 公司)；彗星图象分析软件：CASP软件(casp-1.2.21.4 实验分组及UV处理收集对数生长的K562细胞，台盼蓝染色计数，细胞活力大于95％，用Hank's(pH7.4)调整细胞密度至1×105/ml，接种于塑料培养皿中(ф=35 mm，2 ml/plate)，然后进行紫外线照射(0.3 mW/cm2)。
实验分为对照组和8个照射组，各照射组分别照射3、5、10、40，60、120、180、240 s，对照组不进行紫外线照射，之后进行彗星实验。
单细胞凝胶电泳试剂盒（彗星实验）使用说明书一 单细胞凝胶电泳实验介绍单细胞凝胶电泳( Single Cell Gel Electrophoresis, SCGE) 又名彗星试验(comet assay)， 1984 年起用于检测的真核细胞的DNA 断裂和修复，具有方法灵敏、快速优点，同时既可以定性又可以定量，目前DNA 损伤检测的其他方法（Giemsa 染色法,TUNUL 法、DNA 电泳梯度法、流式细胞检测法）是无法比拟的。
彗星实验是检测DNA 微损伤和修复的新方法，得到国际遗传毒性检测程序工作会议认可。
彗星实验是简单、快捷检测DNA 微损伤的方法，被广泛应用于遗传毒理、放射生物学、生物监测、癌症化疗和细胞凋亡、衰老等领域。
是一个十分成熟的技术，逐渐成为快速检测DNA损伤的一种方法，尤其应用于新药开发、保健品开发、化妆品开发、环境监测和毒理学研究等领域。
彗星实验具有以下优点：1 适用范围广，不仅适用于静止状态的细胞，且对T 和B 淋巴细胞敏感；2 所需实验器材较少，一台荧光显微镜和一套电泳装置即可完成彗星实验；3 实验流程短，一天可完成一个实验流程，且图像获取和数据分析可隔日完成；4 安全性好，避免了同位素的使用；5 在单细胞水平上对DNA 损伤进行可视性检测；6 准确性好、灵敏度高；7 属于新技术，客观实际，国际遗传毒性学术委员会认可。
二、试剂盒组成（见试剂盒内）三、试剂使用说明（见试剂盒内）四、操作步骤1.各种细胞用冰冷的PBS 洗一次，离心收集，用PBS 重悬，密度为1×104-5个/ml。
2.铺胶：下述各浓度琼脂糖凝胶均用PBS 配制。
3.第1 层凝胶的制备：将加热熔解的正常熔点琼脂糖(NMA)，冷至45-60℃，取适量铺于载玻片CometSlide上，再置4℃下10min 使NMA 凝固。
也可以先铺胶，晾干后无尘存放，1周内使用（据经验，此法较优）。
4.第2 层凝胶的制备：低熔点琼脂糖LMA在60-70℃水浴加热至少20min 使之完全溶化，冷至37℃（可以放置于细胞培养箱中或水浴箱冷却至37℃，低熔点琼脂糖LMA在37℃可维持3小时）。
陕西师范大学硕士学位论文单细胞凝胶电泳——彗星实验方法的建立、改良与应用姓名：罗明志申请学位级别：硕士专业：动物学指导教师：齐浩20050501单细胞凝胶电泳——彗星实验方法的建立、改良与应用罗明志摘要单细胞凝胶电泳（ｓｉｎｇｌｅｃｅｌｌｇｅｌｅｌｅｃｔｒｏｓｉｓ，ＳＣＧＥ），又称彗星实验（ｃｏｍｅｔａｓｓａｙ），是一种在单细胞水平进行ＤＮＡ损伤的检测方法，具有简便、灵敏、快捷、样品用量小等优点，广泛用于遗传毒性检测、环境毒性检测、分子流行病学和ＤＮＡ损伤与修复等研究领域。
我们在本实验室建立了单细胞凝胶电泳技术，并对部分操作流程进行了改良，包括（１）制胶方法改良；（２）增加水洗；（３）进行梯度酒精脱水。
在上述改良过程中，我们用“灌胶”法在载玻片上制胶，替代了传统的使用磨砂载玻片上“三明治”制胶，解决了彗星实验中常见的脱胶现象，脱水后有利于获得平整胶面：在裂解后增加了水洗步骤，以消除裂解液中的高盐和去垢剂对后续实验操作的影响；采用直流稳压电源进行单细胞电泳，保证了实验结果的可重复性；对染色的条件进行了筛选，确定了使用ＥＢ作为细胞ＤＮＡ的荧光染料；以ＣＡＳＰ（免费）作为彗星图像的分析软件，建立了图像分析的方法。
这些实验步骤的改良以及实验流程的优化或标准化．简化了操作程序，节省了时间，并使结果分析更加简便。
为了验证上述改良后的实验系统是否可靠，我们用紫外线作为损伤因子处理细胞，诱导细胞ＤＮＡ损伤，然后用彗星实验检测这一损伤。
从这～阳性模型的结果分析来看，发现细胞损伤呈现出很好的时间依赖性，表明该实验系统的可靠性。
我们同时筛选并评价了彗星实验中有关的ＤＮＡ损伤分析指标，发现ＴａｉｌＬｅｎｇｔｈ，ＣｏｍｅｔＬｅｎｇｔｈ，ＴａｉｌＭｏｍｅｎｔ和ＯｌｉｖｅＴａｉｌＭｏｍｅｎｔ作为ＤＮＡ损伤的评价指标比较可靠。
我们建立了肝细胞的组织块原代培养系统。
在建立肝细胞组织块原代培养实验流程中，我们对实验的各个步骤，例如组织块贴壁需要的时间、细胞生长所需的培养基种类、培养基添加剂以及动物组织供体年龄等进行了筛选，建立了小鼠肝细胞组织块的原代培养系统。
彗星实验(Comet assay),又称单细胞凝胶电泳(Single cell gel electrophoresis，SCGE),各种理化因子作用细胞后引起的DNA链的断裂可用该方法检测[1～3]，并在统计学基础上对损伤程度做出评估[4]。
本实验对Singh 等[5]建立的碱性彗星实验的一些步骤作了改良。
用超净工作台上的紫外消毒灯[可发射波长为254 nm的紫外线(Ultraviolet，UV)，属于UVC波段范围]作为DNA损伤的诱导因子[7～9]，诱导K562细胞DNA损伤，用改良彗星实验检测损伤程度，验证改良的实验系统是否可靠，同时筛选并评价DNA损伤的分析指标。
1 材料与方法1.1 细胞K562细胞，来源于第四军医大学免疫学教研室，37 ℃、5％ CO2培养箱中培养，取对数期细胞进行实验。
1.2 紫外线照射装置紫外消毒灯(ZSZ-20型，20 W，天津市紫晶特种光源有限公司)。
1.3 主要试剂和仪器培养基：10％新生牛血清(杭州四季青公司)，90％RPMI-1640培养液(Hyclone公司)；双抗(青、链霉素，100 UI/ml)；TritonX-100(Genview分装)；二甲基亚砜、肌苷酸钠(Sigma分装)；低熔点琼脂糖(FMC 分装)；常熔点琼脂糖(Spanish分装)。
其余生化试剂均为分析纯。
电泳仪：由西北大学物理系提供；电泳槽：DYC33A型(北京市六一仪器厂)；显微镜：Leica DM LB 2 (Leica 公司)；彗星图象分析软件：CASP软件(casp-1.2.2，/index.php下载)；CO2培养箱：BB16HF型(上海力申科学仪器有限公司)；环地牌紫外辐照计(北京师范大学光电仪器厂)。
1.4 实验分组及UV处理收集对数生长的K562细胞，台盼蓝染色计数，细胞活力大于95％，用Hank's(pH7.4)调整细胞密度至1×105/ml，接种于塑料培养皿中(ф=35 mm，2 ml/plate)，然后进行紫外线照射(0.3 mW/cm2)。
PH9143|DNA损伤试剂盒（彗星电泳法）DNA Damage Assay kitCatalog No：PH9143Size：☐20T Store at4℃简介DNA在自由基（如·OH）的攻击下容易发生损伤，即脱氧戊糖遭到破环，磷酸二脂键的断裂，碱基的破环或脱落，便可进一步产生单链断裂或双链断裂。
将细胞固定于低熔点琼脂糖中，取少量细胞涂在载玻片上，用碱高盐溶液破坏细胞膜，再用碱溶液使DNA分子解旋。
将载玻片置于电泳液中，在电场的作用下，DNA分子向阳极移动。
如果DNA损伤严重，碎片多，则电泳速度快。
未受损伤的DNA大分子则由于细胞膜的阻隔，滞留在原处。
用PI染色或银染，可观察到DNA受损的细胞形同彗星现象，作定性分析。
也可用相关的软件作定量分析。
组分Components20Assay StorageLysis Bufffer100mL4℃DMSO8mL4℃正常熔点琼脂糖NMA30mg4℃低熔点琼脂糖LMA30mg4℃Propidium Iodide（PL）400ul4℃避光自备试剂和仪器低速离心机、水平电泳仪、荧光显微镜、37℃和45℃恒温水浴箱、载玻片、盖玻片、平皿、微量移液器、1.5ml Microube、0.4mmol/LTris-HCl（pH7.5）缓冲液、PBS使用参考1、细胞用冰冷的PBS洗一次，离心收集，用PBS重悬使其密度为1x106个/mL；2、铺胶：下述各浓度琼脂糖凝胶均用PBS配制：第1层凝胶的制备：将载玻片的磨砂面向上，45℃预热，将预热45℃的100μL的0.5%正常熔点琼脂糖（NMA）铺于载玻片上，盖上干净的盖玻片，再置4℃下10min使NMA凝固。
第2层凝胶的制备：将10μL细胞（约104个）和75μL的0.7%低溶点琼脂糖LMA（在37℃下水浴加热至少20min使之完全溶化）混合均匀。
然后，轻轻揭去盖玻片，迅速将含细胞的LMA滴到第1层琼脂糖上，立即盖上另一干净盖玻片，置4℃10min使第2层LMA凝固。
彗星电泳法检测细胞凋亡原理细胞凋亡是细胞生命周期中的一种自然过程，也是一种重要的细胞死亡方式。
在细胞凋亡过程中，细胞内会发生一系列的形态和生化变化，如细胞核染色质凝聚、细胞核碎裂、胞质内溶酶体释放等，这些变化是细胞凋亡的特征。
彗星电泳法（Comet Assay）是一种常用的细胞凋亡检测方法，它可以通过检测DNA断裂来判断细胞是否发生凋亡。
这种方法以细胞的DNA为基础，通过电泳的方式使DNA在凝胶上产生“彗星尾巴”状的形态，从而判断细胞凋亡的发生程度。
彗星电泳法的原理是利用DNA在电场作用下的迁移能力差异来检测细胞凋亡。
首先，将待检测的细胞经过相应处理，如破碎细胞膜、去除核膜等，使细胞内的DNA暴露在外。
然后，将处理后的细胞混合在低熔点琼脂糖中，制备成凝胶。
接下来，将凝胶浸泡在含有碱性溶液的电泳缓冲液中，形成电泳系统。
在电场的作用下，DNA 会向阳极移动，形成“彗星尾巴”状。
最后，通过染色和显微镜观察，可以看到DNA的形态变化，进而判断细胞凋亡的程度。
彗星电泳法的检测结果可以通过计算尾长、尾百分比、尾状因子等参数来评估细胞凋亡的程度。
尾长是指从头部到尾部的距离，尾百分比是指尾部长度占总长度的百分比，尾状因子是尾长与头部直径的比值。
通过对这些参数的测量和分析，可以得出细胞凋亡的程度和类型。
彗星电泳法具有灵敏性高、操作简便、结果直观等优点，因此被广泛应用于细胞凋亡的研究和药物筛选等领域。
它可以帮助科研人员更好地理解细胞凋亡的机制，以及评估药物对细胞凋亡的影响。
此外，彗星电泳法还可以用于毒理学研究、环境污染监测等方面。
彗星电泳法作为一种常用的细胞凋亡检测方法，通过检测DNA断裂来判断细胞凋亡的发生程度。
它具有操作简便、结果直观等优点，并被广泛应用于细胞凋亡研究和药物筛选等领域。
通过彗星电泳法的应用，科研人员可以更好地理解细胞凋亡的机制，为相关疾病的治疗提供新的思路和方法。
Comet assay简介单细胞凝胶电泳技术（Single cell gel electrophoresis, SCGE），又称彗星试验（Comet assay），是在核酸沉淀法（Nucleoid sedimentation）和晕圈分析（Holo assay）等检测技术基础上逐步发展起来的一种在单细胞水平检测有核细胞DNA断裂的新技术。
它主要包括Olive等建立的测定DNA双链断裂的中性单细胞凝胶电泳技术和Singh等建立的测定DNA单链断裂的碱性单细胞凝胶电泳技术。
此技术已经被广泛应用于放射生物学、DNA断裂与修复、毒理学、肿瘤治疗评价、细胞凋亡等领域的研究。
是碱性单细胞凝胶电泳可以检测DNA链的断裂和碱不稳定点，请问碱不稳定点是不是DNA上的脱嘌呤/嘧啶位点呀？还有个问题就是彗星试验检测到的DNA断裂其实是DNA损伤与修复的共同作用的结果，而且DNA修复的一个重要方式就是核苷酸切除修复，因此DNA修复过程也会造成DNA链的断裂，所以彗星试验所反映的时间－效应关系，可能并非与真实的DNA损伤有偏差，因为它无法鉴别修复过程中的DNA断裂。
SCGE技术的原理：细胞核中的DNA为负超螺旋结构，而且很致密，通常DNA双链以组蛋白为核心，盘旋而形成核小体。
一般情况下，偶然的DNA单链断裂对核酸分子双股结构的连续性影响不大，而且不易释放出来，但是，如果用去污剂破坏细胞膜和核膜，用高浓度盐提取组蛋白，DNA 残留而形成类核。
如果类核中的DNA有断裂，断裂点将引起DNA致密的超螺旋结构松散，在类核外形成一个DNA晕圈。
将类核置于电场中电泳，DNA断片可从类核部位向阳极迁移，经荧光染色后，在阳极方向可见形似彗星的特征性图像，故称“彗星试验”。
彗星尾部即为迁移出类核的DNA片段。
此时彗星尾部有可能还与头部以单链或双链的形式相连。
DNA损伤越严重，导致DNA超螺旋结构越松散，产生的断裂点越多，DNA片段越小，从而在彗星尾部出现的DNA断片越多，则慧尾的长度、面积和荧光强度越大。
通过测量彗星尾部的长度、面积或荧光强度等指标，可以对DNA的损伤程度进行定量分析。
随着SCGE技术的发展，可测量的指标也越来越多，而且更准确。
目前，用于SCGE分析的指标主要分为四类，包括形状指标、距离指标、强度指标和矩类指标。
其中形状指标有彗星细胞率；距离指标包括彗星尾长、彗星全长、彗星头部半径、尾部半径；强度指标包括头部DNA百分含量、尾部DNA百分含量、头部面积、尾部面积等；矩类指标包括尾矩、Olive尾矩等。
依靠目镜测微尺人工测量彗星距离指标，主观性较强，人为误差较大，而且矩类指标更需要人工通过公式计算得出，使研究人员的工作量加大。
因此，研究人员渴望开发出一种专用的彗星图像分析软件。
近年来，各国研究机构纷纷推出各自的图像分析软件，这些分析软件可以快速提供一系列评价参数，如彗星总长、尾长、尾DNA含量、尾矩和Olive尾矩等，更好地客观定量DNA损伤。
目前，用于彗星分析的软件包括英国Kinetic Imaging公司的Komet5.5、Perceptive Instruments公司的Comet Assay Ⅲ、LAI公司的LACAAS、美国NIH 的ImagJ、TriTek公司的CometScoreTM、印度原子能研究所的SCGE-Pro、奥地利癌症研究所开发的自动分析软件等。
其中的部分软件可以到其相应网站下载，但最好与相应的彗星分析系统硬件设备配套使用，价格昂贵，提高了研究成本。
新近研发的彗星分析软件（Comet Assay Software Project, CASP）很好地解决了这一问题，该软件可以在普通微机上运行，界面友好，使用方便，分析速度快，可以一次同时给出最多达13个指标，分析结果避免了人为误差，更加客观和准确，结果可以以.txt文件直接输出，SPSS等统计软件可以直接读取其输出结果，便于统计学分析，节省大量人力物力。
中性电泳与碱性电泳在适合的实验条件范围内，没有损伤的细胞在中性或碱性条件都不可能做出尾巴。
中性检测DNA双链断裂，碱性检测DNA单链断裂。
根据实验设计的需要，可以选择不同的实验条件，也可以同时选择两种条件，结果进行对比。
拿电离辐射来说，中性和碱性检测的敏感范围不同，碱性SCGE的敏感范围值偏低，如可以小到0.05Gy，而中性SCGE的敏感范围值偏高，它可能检测不到0.05Gy的DNA 损伤，但可以检测大到100Gy的损伤，而相对中性SCGE来说，碱性SCGE在大剂量照射时的各项指标容易形成平台。
从修复方面来说，双链断裂的修复较单链断裂的修复慢，损伤重，后果更严重，双链断裂是后来形成染色体畸变和微核的主要物质基础。
从文献上来看，药物引起的DNA损伤多采用碱性SCGE 检测单链断裂，A：碱性电泳是在1988年建立的，而最开始彗星方法都是在中性条件下做的（1984），所以我认为，这是方法逐步改进的过程。
碱性条件下，DNA解旋，检测出来的应该是双链和单链断裂的综合损伤，这样可以提高试验的灵敏度，也就是您说的可以检测到0.05Gy,而中性电泳做不到这一点。
B：中性条件跑出来的是DNA的双链，单链断裂不会出来，而强碱性条件下，破坏了断裂部位连接碱基的氢键，这样，双链断裂也就成了单链形式，可以说碱性检测的是“双链和单链断裂的综合损伤”，两种电泳条件的最大区别是适用于不同的实验需求。
碱性条件的SCGE 的建立也是为了满足不同实验需要。
实践中要根据DNA致伤因素选择实验条件，如：电离辐射对DNA的损伤以双链断裂为主，应该选择中性SCGE，而且可以排除环境因素对DNA 损伤的影响（因为DNA很容易受到环境因素的影响而断裂－－单链为主），如果用碱性的话，就不能区分哪些是实验因素引起的断裂，哪些是其它影响因素引起的断裂。
如果实验致伤因素是以DNA单链为主，那就应该选择碱性SCGE了。
有一点需要说明一下，碱性SCGE确实增加了检测的敏感性（中性SCGE达不到），但牺牲了特异性，DNA很容易受许多因素的影响而产生断裂，如吸烟、饮酒等不良生活习惯、环境污染等因素。
所以碱性条件很难从实验结果中剔除哪些是非实验致伤因素造成的，对实验结果会或多或少有点影响。
所以说SCGE条件的选择主要还要根据实验的需要来定。
中/碱性单细胞凝胶电泳Unwinding of the DNA and electrophoresis at neutral pH (7-8) predominantly facilitates the detection of double strand breaks and cross links; unwinding and electrophoresis at pH 12.1-12.4 facilitates the detection of single and double strand breaks, incomplete excision repair sites and cross links; while unwinding and electrophoresis at a pH greater than 12.6 expresses alkali labile sites (ALS) in addition to all types of lesions listed above (Miyamae et al., 1997).Lysis and electrophoresis can be performed in alkaline (option A) or neutral (option B) e option A to detectthe combination of DNA single-strand breaks, double-strand breaks and alkali-labile sites in the DNA, and option B to detectonly DNA double-strand breaks.一．玻片处理1.将玻片放入肥皂或洗衣粉水中煮沸20 分钟。
2.用热水将肥皂等污物洗去，再用自来水反复冲洗，最后再用蒸馏水冲洗3 ～5 次。
必要时再置95 ％乙醇中浸泡1 小时，然后擦干或烘干备用。
新玻片常有游离碱质，因此应用清洁液或10 ％盐酸浸泡24 小时，然后分别用自来水及蒸馏水彻底洗涤。
3.用无水乙醇提前浸泡磨砂载玻片和盖玻片，至少过夜（用前最好预热下），再使用，可减少脱胶的问题。
bel slide on frosted end using a pencil, not a pen.二至四步均应在暗处进行，以避免额外的DNA损伤performed under dim yellow lights to prevent DNA damagethe premise is that usual lighting will cause DNA damage buthave no data to support this concern.先准备裂解液，加应用液组分溶解至清澈后放冰箱！二．胶的配制与铺设铺胶后都要加盖片（可不加），目的是使胶平整，凝胶固化后移去盖片，再铺另一层，普通波片表面比较光滑，容易脱胶，文献多用毛玻璃片，应该好一点，但也不能完全避免脱胶。
表1.Sample preparation buffer(for plant tissueslicedwith a fresh razor blade)pH7.4配胶用PBS（0.1MpH7.4）用PBS母液配制第一层：0.75％正常熔点胶，100µl，置于室温>5min使其固化在烧杯里配100ml左右的正常熔点琼脂糖，煮沸之后把玻片放进去，让胶液浸过1/3之后，捞出玻片，用布或者别的什么把一面擦干，然后把玻片水平放置，晾干。
*The slides may be air dried orwarmed for quicker drying. Store the slides at room temperature until needed; avoid high humidity（湿）conditions. Wegenerally prepare slides the day before use.*M. Klaude, S. Eriksson, J. Nygren, and G. Ahnstrom (1996) The cometassay: mechanisms and technical considerations. Mutation Res. 363: 89-96.第二层：0.75％低熔点胶，75µl +25µl样品悬液，置于4℃固化1min（也可以把第二层胶配成1％，然后把细胞和胶按照1：1的比例配，这样细胞多了，终浓度也是0.5%）附：三层胶法：Gently slide off coverslip and add a third agarose layer (75 μL LMPA) to the slide. Replace coverslip and return tothe slide tray until the agarose layer hardens (~3 to 5 minutes). Remove coverslip.凝胶不要提前配置，可以提前称量好，分装，用前加PBS至5ml，反复用，效果不好，不易铺平，铺胶前低熔点胶PBS溶解、煮沸，要温于37度水浴箱，再和细胞混合（低熔点琼脂糖在恒温放久了，铺胶染色后会容易造成背景很脏），不会破坏细胞。
