Survivin基因及CDK1基因联合靶向shRNA真核表达载体的构建

中国肿瘤２００７年第１６卷第２期Survivin 基因真核表达载体的构建及其在cos-7中的表达李红，李明红，杨桦，镡旭民（第三军医大学新桥医院，重庆４０００３７）摘要：［目的］克隆人ｓｕｒｖｉｖｉｎ基因并在真核细胞中表达。

［方法］以人喉癌组织中提取总ＲＮＡ为模版，采用反转录聚合酶链ＲＴ－ＰＣＲ法获得ｓｕｒｖｉｖｉｎｃＤＮＡ。

将该基因克隆到ｐｃＤＮＡ３．０载体中，构建真核细胞表达载体ｐｃＤＮＡ３．０／ｓｕｒｖｉｖｉｎ，将测序正确的ｓｕｒｖｉｖｉｎ基因通过脂质体介导下转染ｃｏｓ－７，Ｗｅｓｔｅｒｎｂｌｏｔ检测ｓｕｒｖｉｖｉｎ蛋白在ｃｏｓ－７中表达。

［结果］ＤＮＡ测序证明获得了ｓｕｒｖｉｖｉｎ基因，其序列与ＧｅｎｅＢａｎｋ中报道序列完全一致。

Ｗｅｓｔｅｒｎｂｌｏｔ检测ｓｕｒｖｉｖｉｎ蛋白获得高效表达，其相对分子质量为１６．５ｋＤ。

［结论］Ｓｕｒｖｉｖｉｎ基因的克隆和表达均获得了成功，为进一步探讨ｓｕｒｖｉｖｉｎ基因在喉癌诊治中应用奠定了基础。

关键词：ｓｕｒｖｉｖｉｎ基因；人喉癌组织；基因表达中图分类号：Ｒ７３－３文献标识码：Ａ文章编号：１００４－０２４２（２００７）０２－０１１４－０３ＣｏｎｓｔｒｕｃｔｉｏｎｏｆＳｕｒｖｉｖｉｎＥｕｋａｒｙｏｔｉｃＥｘｐｒｅｓｓｉｏｎＶｅｃｔｏｒａｎｄＩｔｓＥｘｐｒｅｓｓｉｏｎｉｎｃｏｓ－７ＬＩＨｏｎｇ，ＬＩＭｉｎｇ－ｈｏｎｇ，ＹＡＮＧＨｕａ，ｅｔａｌ．（ＴｈｅＴｈｉｒｄＭｉｌｉｔａｒｙＭｅｄｉｃａｌＵｎｉｖｅｒｓｉｔｙＡｆｆｌｉａｔｅｄＸｉｎｑｉａｏＨｏｓｐｉｔａｌ，Ｃｈｏｎｇｑｉｎｇ４０００５７，Ｃｈｉｎａ）Ｓｕｒｖｉｖｉｎ是近年来发现的凋亡抑制蛋白（ｉｎ－ｈｉｂｉｔｏｒｏｆａｐｏｐｔｏｓｉｓｐｒｏｔｅｉｎｓ，ＩＡＰ）家族的成员，其功能主要通过抑制Ｃａｓｐａｓｅ－３和Ｃａｓｐａｓｅ－７的活性而阻断细胞凋亡过程。

该蛋白选择性地表达于胚胎发育组织和人类大多数肿瘤组织，而正常成人终末组织中不表达，其独特的分布特点在肿瘤发生、发展过程中的重要作用已受到学者们的广泛关注。

survivin基因shRNA真核表达载体的构建及其对人胃癌细胞株中survivin表达的影响陈敏;刁振宇;张松;邹晓平;徐肇敏;李运红【期刊名称】《胃肠病学》【年(卷),期】2012(17)9【摘要】Gastric cancer is one of the most common malignant tumors in China. survivin is a new family member of inhibitors of apoptosis, and is highly expressed in gastric cancer. Aims: To construct an eukaryotic expression vector of small hairpin KNA (shRNA) targeting survivin gene and evaluate its effect on survivin expression in human gastric cancer cell lines BGC823, SGC7901. Methods; In accordance with the sequence of survivin gene in GenBank, double strand DNA that could transcribe shRNA was designed and synthesized, and was inserted into pRNAT-U6. 3 eukaryotic expression vector containing green fluorescent protein (GFP) gene and U6 promoter to construct the recombinant vector pRNA-shSUR. After identification, the recombinant vector was transfected into gastric cancer cell lines BGC823 and SGC7901; cells transfected with pRNA-shControl were served as negative controls. Fluorescence microscopy was used to assess transfection, the expression of survivin protein was detected by Western blotting and Annexin V-FITC/PI double staining was used to determine the apoptosis of gastric cancer cells. Results; Recombinant vector pRNA-shSUR shRNA were successfully constructed. Aftertransfection into gastric cancer BGC823 and SGC7901 cells for 48 hours, expression of GFP in pRNA-shSUR group was increased when compared with negative controls, expression of survivin was significantly suppressed (P < 0.05) , early apoptosis rates of BGC823 and SGC7901 cells were enhanced. Conclusions; shRNA eukaryotic expression vector targeting survivin gene is successfully constructed. Transfection with pRNA-shSUR can down-regulate the expression of survivin gene and enhance cell apoptosis in gastric cancer cells. Thus it provides the foundation for further study on the correlation of survivin gene with biological behavior of gastric cancer and drug resistance of chemotherapy.%背景:胃癌是我国最常见的恶性肿瘤之一,survivin是凋亡抑制蛋白家族的新成员,在胃癌组织中高表达.目的:构建survivin基因短发夹RNA(shRNA)真核表达载体并观察其对人胃癌细胞株BGC823和SGC7901中survivin 表达的影响.方法:根据GenBank中survivin基因序列设计并合成能转录shRNA的双链DNA序列,插入含有绿色荧光蛋白(GFP)基因和U6启动子的真核表达载体pRNAT-U6.3中,构建重组载体pRNA-shSUR.重组载体经鉴定后转染胃癌细胞株BGC823和SGC7901,以转染pRNA-shControl作为阴性对照.荧光显微镜下观察转染情况,蛋白质印迹法检测survivin 蛋白表达,Annexin V-FITC/PI双染法检测胃癌细胞凋亡情况.结果:成功构建了针对survivin基因的shRNA表达载体.转染胃癌BGC823和SGC7901细胞48 h后,与阴性对照组相比,pRNA-shSUR组GFP表达增强,survivin蛋白表达受到明显抑制(P＜0.05),胃癌细胞早期凋亡率明显增加.结论:成功构建靶向survivin基因的特异性shRNA真核表达载体,转染胃癌细胞后可抑制survivin蛋白表达并促进细胞凋亡,为进一步研究survivin基因与胃癌生物学行为以及化疗耐药等的相关性奠定了基础.【总页数】5页(P540-544)【作者】陈敏;刁振宇;张松;邹晓平;徐肇敏;李运红【作者单位】南京大学医学院附属鼓楼医院消化科,210008;南京大学医学院附属鼓楼医院消化科,210008;南京大学医学院附属鼓楼医院消化科,210008;南京大学医学院附属鼓楼医院消化科,210008;南京大学医学院附属鼓楼医院消化科,210008;南京大学医学院附属鼓楼医院消化科,210008【正文语种】中文【相关文献】1.survivin基因启动子调控的HSV-tk真核表达载体的构建及在人喉癌细胞中的特异性表达 [J], 卞卡;张惠中;高萍;王燕;成诗银2.Survivin基因及CDK1基因联合靶向shRNA真核表达载体的构建 [J], 陈淑萍;符生苗;周红桃;蔡俊宏;李成学;王福利;许茂轩3.人Survivin基因真核表达载体的构建及在肝癌细胞中的表达 [J], 易楠;李杏玉4.Survivin基因siRNA真核表达载体的构建及其对转染膀胱癌细胞Survivin表达的抑制作用 [J], 曹正国;诸禹平;亓林;朱明;吴奎;董晓程;舒启安;肖峻5.Survivin基因真核表达载体的构建及其在cos-7中的表达 [J], 李红;李明红;杨桦;镡旭民因版权原因，仅展示原文概要，查看原文内容请购买。

Survivin特异性shRNA表达载体的构建及评价【摘要】目的构建针对人结肠癌细胞系Lovo的高效率沉默Survivin 的shRNA表达载体。

方法合成特异性干扰Survivin的小发卡RNA （shRNA）片段，并与pGenesil2 载体连接，构建Survivin干扰载体（pGenesil2Survivin shRNA）。

利用脂质体将其转染Lovo细胞，分为正常细胞对照组和3个shRNA干扰组（pGenesil2Survivin1、2及3），应用荧光显微镜对转染效果进行评价，应用Western印迹和免疫细胞化学法分析转染后Lovo中Survivin的蛋白表达水平。

结果插入片段测序结果与合成shRNA结果一致；转染效率可达70%左右，转染pGenesil2Survivin shRNA后，3个干扰组的Lovo细胞中Survivin蛋白表达水平均较正常对照组显著降低（P＜0.01）。

结论成功构建了能高效沉默Survivin的RNAi表达载体；且pGenesil2 Survivin高效抑制结肠癌Lovo细胞中Survivin基因表达。

【关键词】 RNA干扰；生存素；结肠癌；shRNA研究显示，Survivin 在人结肠癌组织以及细胞系中存在高表达，并与人结肠癌的形成和演进存在密切关系，其作用机制可能涉及促进结肠癌恶性增殖及抗细胞凋亡等多个方面〔1，2〕。

因此，靶向Survivin 的研究对明确结肠癌的发病及转移机制以及提高结肠癌的疗效均有重要意义〔3～5〕。

故本研究利用pGenesil2真核表达载体构建了含高效的靶向Survivin基因的重组载体pGenesil2Survivin shRNA，并进一步应用其沉默人结肠癌系Lovo的Survivin 基因，为探讨Survivin 在结肠癌发生、发展中的作用及应用其进行结肠癌的基因治疗奠定实验室基础。

1 材料与方法1.1 材料感受态细胞DH5α为我室保存。

Survivin靶向siRNA重组表达载体的构建与鉴定摘要】目的构建Survivin靶向siRNA重组表达载体。

方法根据GeneBank数据库提供的Survivin基因所有变异体的共同核苷酸序列，选择设计一对带发夹结构的核苷酸序列，克隆到空载体pSIREN-DNR-DsRed-Express中，转化DH5а菌株，提取质粒进行酶切鉴定和测序分析以及菌落PCR。

结果经质粒PCR、菌落PC及测序证实Survivin靶向siRNA重组表达载体结果与设计完全一致。

结论 Survivin 靶向siRNA重组表达载体构建成功。

【关键词】RNA干扰 surviving 基因治疗Survivn是凋亡抑制蛋白家族（IAPs）的新成员，独立于B型淋巴瘤细胞因子2（Bcl-2）家族，是迄今为止发现的作用最强的凋亡抑制因子。

survivin蛋白调节所有细胞分裂和存活，并且广泛表达于人类大多数恶性肿瘤组织中[1],因此特异性针对survivin的基因治疗具有良好的靶向性、特异性和安全性。

本实验用基因克隆技术构建Survivin 靶向的小干扰RNA即siRNA重组表达载体，探讨用RNA干扰方法干扰肿瘤细胞中的Survivin基因的表达，从而为肿瘤的基因治疗提供理论依据。

1 材料与方法1.1大肠杆菌DH5а，质粒pSIREN-DNR-DsRed-Express购自大连宝生物公司，T4DNA连接酶，BamHⅠ限制酶EcoRⅠ限制酶，DNA Marker均购自大连宝生物公司。

1.2靶向Survivin基因siRNA的设计 Survivin基因序列来自GeneBank(编号NM001168)，利用GenechemTMsiRNA设计工具，参照siRNA设计原则，在Survivin的序列中选取理论上最佳的一段作为靶序列为：5，-GGACCACCGCATCTCTACA-3，（78-96），针对这段靶序列设计相应的DNA序列，经Blast分析证明与人类其他编码序列无同源性。

构建survivin shRNA重组载体及靶向下调PC3细胞survivin mRNA的表达徐建华;陈丹娜;何敏;黄宪章;庄俊华;黎美贤;金小宝;卢雪梅;朱家勇【期刊名称】《中国组织工程研究》【年(卷),期】2011(015)041【摘要】BACKGROUND: survivin mRNA is specifically expressed in tumor and embryonic tissue and is closely related to differentiation, proliferation, infiltration and metastasis of tumor cells as well as multidrug resistance. OBJECTIVE: To construct the expression vector of small hairpin RNA (shRNA) targeting human survivin gene and detect the effectiveness of gene silencing in PC3 cells (human prostate cancer cell line). METHODS: Two single-stranded DNA oligonucleotides for shRNA expression targeted survivin gene were chemically synthesized. The top and bottom strand oligos were annealed to generate a double-stranded oligonucleotide (ds oligo). The the oligo was cloned into pENTR/U6 expression vector (pENTR/U6-SUR), and then PCR and sequencing analyses were conducted to verify the constructs. After transfecting the verified plasmids into PC3 cells, RT-PCR was performed to determine the mRNA level of survivin gene. RESULTS AND CONCLUSION: PCR and sequencing analyses demonstrated that shRNA template targeting survivin gene had been inserted at the expected site and the insertion sequence was perfectly corrected. The RT-PCR results showed that survivin expression in PC3 was downregulated atmRNA level. The recombinant plasmid had a better affect at 24 hours than 48 hours. The shRNA expression vector targeting survivin gene has been constructed successfully, and it would be a useful method to develop specific survivin-silencing therapeutics in further gene therapy study.%背景:survivin 基因特异性表达于肿瘤和胚胎组织,与肿瘤细胞的分化增殖、浸润转移以及多药耐药密切相关.目的:构建靶向survivin 基因的shRNA 重组质粒表达载体,转染前列腺癌细胞PC3,验证该载体能否下调细胞survivin 基因mRNA 水平.方法:以survivin 基因为靶点设计具有短发夹结构的shRNA 序列,经退火成互补双链后克隆入pENTR/U6 建立重组表达载体pENTR/U6-SUR ;转化E.coli TOP10 菌株,挑取阳性菌落进行菌落PCR 和测序鉴定;将重组质粒转染前列腺癌细胞株PC3 细胞,RT-PCR 检测重组质粒对细胞survivin 基因mRNA 水平的抑制效果.结果与结论:将设计合成的shRNA 序列经退火后克隆至pENTR/U6 载体中,菌落PCR 可扩增出目的条带,测序结果证实插入片段为所需序列;pENTR/U6-SUR 重组质粒转染后PC3 细胞survivin 基因mRNA 表达水平显著下降,且24 h 比48 h 作用更明显.成功构建了靶向survivin 基因的shRNA 质粒表达载体,并证实该载体显著下调了PC3 细胞中survivin 基因mRNA 水平.【总页数】4页(P7738-7741)【作者】徐建华;陈丹娜;何敏;黄宪章;庄俊华;黎美贤;金小宝;卢雪梅;朱家勇【作者单位】广东省中医院检验医学部,广东省广州市,510120;广东省中医院检验医学部,广东省广州市,510120;广东省中医院检验医学部,广东省广州市,510120;广东省中医院检验医学部,广东省广州市,510120;广东省中医院检验医学部,广东省广州市,510120;广东省中医院检验医学部,广东省广州市,510120;广东药学院药用生物活性物质研究所,广东省生物活性药物研究重点实验室,广东省广州市,510006;广东药学院药用生物活性物质研究所,广东省生物活性药物研究重点实验室,广东省广州市,510006;广东药学院药用生物活性物质研究所,广东省生物活性药物研究重点实验室,广东省广州市,510006【正文语种】中文【中图分类】R318【相关文献】1.靶向survivin的shRNA对恶性黑色素瘤A375细胞survivin基因的表达 [J], 徐薇;杨超2.survivin基因shRNA真核表达载体的构建及其对人胃癌细胞株中survivin表达的影响 [J], 陈敏;刁振宇;张松;邹晓平;徐肇敏;李运红3.Egr1-survivin shRNA转染联合放疗下调survivin表达对食管鳞癌KYSE150细胞放疗敏感性的影响 [J], 陆艳荣;张鑫;吕茵;张瑾熔;王海峰4.靶向Survivin的shRNA表达载体的构建和对宫颈癌Caski细胞Survivin表达的影响 [J], 倪虹;丁显平;曾索5.Survivin shRNA表达质粒的构建及其抑制survivin表达的初步研究 [J], 沈汉斌;郑启昌;王国斌;陈道达;卢小明因版权原因，仅展示原文概要，查看原文内容请购买。

Survivin靶向的短发夹RNA表达载体的构建
目的:构建存活素(Survivin)基因短发夹RNA(shorthairpinRNA,shRNA)重组质粒并测序鉴定,为下一步探索乳腺癌基因治疗的RNA干扰途径建立基础.方法:设计并合成有小发夹结构的8条DNA片段,退火成互补双链后克隆至pSilenceradeno1.0-CMV载体中构建重组质粒,转化大肠杆菌DH5α菌株,提取质粒行酶切鉴定后测序分析.结果:酶切鉴定和测序结果*实构建成功.结论:survivinshRNA重组质粒的成功构建为下一步用腺病毒包装,并感染荷瘤裸鼠行靶向RNA干扰抗乳腺癌的研究打下基础.
王润秀,WANGRun-xiu(赣南医学院第一附属医院肾内科,*西,赣州,341000)
曹淑萍,CHAOShu-ping(*西省峡*县*医院儿科,*西,峡*,331400) 吴小云,范启兰,WUXiao-yun,FANQi-lan(赣南医学院生物化学与分子生物学教研室,*西,赣州,341000)
梁念慈,LIANGNian-ci(广东医学院生物化学与分子生物学研究所,广东,湛*,524023)。

Survivin基因真核表达载体的构建及鉴定范红杰;于维东;何志义【期刊名称】《中国医科大学学报》【年(卷),期】2012(41)2【摘要】Objective To construct and identify the pcDNA3.1-Survivin gene eukaryotic expression vector. Methods Total RNA extracted from rat liver was used for amplification of Survivin cDNA by RT-PCR and construction of recombinant pcDNA3.1-Survivin plasmid vector by double digestion with restriction enzymes. Results The recombinant eukaryotic expression vector was confirmed by PCR,enzyme digestion and sequencing methods. Conclusion The pcDNA3.1-Sumvin eukaryotic expression vector has been successfully constructed.%目的构建pcDNA3.1-Survivin基因的真核表达载体并鉴定.方法提取大鼠肝细胞总RNA,RT-PCR法扩增SurvivincDNA片段,双酶切构建pcDNA3.1-Survivin,重组载体.结果重组真核表达载体经PCR、酶切鉴定及测序证实正确.结论成功构建了真核表达载体pcDNA3.1-Survivin.【总页数】3页(P128-130)【作者】范红杰;于维东;何志义【作者单位】中国医科大学附属盛京医院神经内科,沈阳110004;中国医科大学附属第一医院干诊科,沈阳110001;中国医科大学附属第一医院神经内科,沈阳110001【正文语种】中文【中图分类】R737.33【相关文献】1.靶向survivin基因的siRNA真核表达载体的构建及鉴定 [J], 李红;李明红;缪书卉;杨桦;镡旭民2.Survivin基因及CDK1基因联合靶向shRNA真核表达载体的构建 [J], 陈淑萍;符生苗;周红桃;蔡俊宏;李成学;王福利;许茂轩3.survivin基因shRNA真核表达载体的构建及其对人胃癌细胞株中survivin表达的影响 [J], 陈敏;刁振宇;张松;邹晓平;徐肇敏;李运红4.人survivin基因反义真核表达载体的构建及初步鉴定 [J], 王志成;郭德玉;李海东5.小鼠survivin基因重组真核表达载体的构建及鉴定 [J], 余昆;苟欣;杨华安;周青松;夏阳因版权原因，仅展示原文概要，查看原文内容请购买。

靶向survivin的siRNA表达载体的构建和表达及对HeLa细胞的影响蒋鸿超;孙强明;赵丹;孙茂盛;吕琳;李鸿钧【期刊名称】《南方医科大学学报》【年(卷),期】2006(26)12【摘要】目的应用RNA干扰技术(RNAi)针对凋亡抑制因子survivin存活素的siRNA抑制Hela细胞株内源survivin基因的表达以及可促进Hela细胞凋亡.方法构建重组质粒pshRNA-survivin-1和pshRNA-survivin-2并分别转染Hela细胞株,通过免疫荧光和半定量RT-PCR检测survivin蛋白表达及mRNA转录水平的变化,并通过流式细胞仪使用PI-AnnexinV双染法检测Hela细胞株的凋亡.结果构建的2种重组质粒pshRNA-survivin-1和pshRNA-survivin-2均能明显抑制survivin基因的表达;应用免疫荧光检测survivin基因的表达,转染重组质粒pshRNA-survivin-1和pshRNA-survivin-2的实验组survivin荧光强度明显低于转染空载体pGE-1和pshRNA阴性非特异对照质粒;通过半定量RT-PCR检测到survivin基因mRNA转录明显减少;通过PI-Annexin V双染法检测Hela细胞的凋亡分别达(36.02±2.12)%(P＜0.01)和(35.29±2.02)%(P＜0.01).结论重组质粒pshRNA-survivin-1和pshRNA-survivin-2均可明显抑制Hela细胞内源survivin的表达和mRNA的转录均可并明显促进Hela细胞的凋亡,为survivin介导的肿瘤基因沉寂疗法提供良好的实验基础.【总页数】6页(P1806-1811)【作者】蒋鸿超;孙强明;赵丹;孙茂盛;吕琳;李鸿钧【作者单位】中国医学科学院/中国协和医科大学医学生物学研究所分子生物室,云南,昆明,650118;昆明医学院研究生部,云南,昆明,650031;中国医学科学院/中国协和医科大学医学生物学研究所分子生物室,云南,昆明,650118;昆明医学院研究生部,云南,昆明,650031;中国医学科学院/中国协和医科大学医学生物学研究所分子生物室,云南,昆明,650118;昆明医学院研究生部,云南,昆明,650031;中国医学科学院/中国协和医科大学医学生物学研究所分子生物室,云南,昆明,650118【正文语种】中文【中图分类】R3【相关文献】1.survivin启动子调控siRNA真核表达载体的构建及对HeLa细胞中stathmin基因的干涉作用 [J], 王燕;吴冰;苏海川;高萍;林芳;刘丽;任继鸿;赵辉;张惠中2.联合靶向Survivin和Livin的双重siRNA表达载体的构建及其活性鉴定 [J], 陈孟璋;郭芬3.survivin-siRNA质粒的构建及其抑制survivin基因在Hela细胞中的表达 [J], 陈丽宏;强辉;张晨;段英梅;贺大林4.miz1基因siRNA表达载体的构建及影响HeLa细胞对阿霉素的敏感性 [J], 刘学武;沈岚;张健;刘新平5.靶向Survivin的shRNA表达载体的构建和对宫颈癌Caski细胞Survivin表达的影响 [J], 倪虹;丁显平;曾索因版权原因，仅展示原文概要，查看原文内容请购买。