基因表达载体的构建3.7

如何构建载体1 启动子的选用和改造外源基因表达量不足往往是得不到理想的转基因植物的重要原因。

由于启动子在决定基因表达方面起关键作用，因此，选择合适的植物启动子和改进其活性是增强外源基因表达首先要考虑的问题。

目前在植物表达载体中广泛应用的启动子是组成型启动子，例如，绝大多数双子叶转基因植物均使用CaMV35S启动子，单子叶转基因植物主要使用来自玉米的Ubiquitin启动子和来自水稻的Actinl启动子。

在这些组成型表达启动子的控制下，外源基因在转基因植物的所有部位和所有的发育阶段都会表达。

然而，外源基因在受体植物内持续、高效的表达不但造成浪费，往往还会引起植物的形态发生改变，影响植物的生长发育。

为了使外源基因在植物体内有效发挥作用，同时又可减少对植物的不利影响，目前人们对特异表达启动子的研究和应用越来越重视。

已发现的特异性启动子主要包括器官特异性启动子和诱导特异性启动子。

例如，种子特异性启动子、果实特异性启动子、叶肉细胞特异性启动子、根特异性启动子、损伤诱导特异性启动子、化学诱导特异性启动子、光诱导特异性启动子、热激诱导特异性启动子等。

这些特异性启动子的克隆和应用为在植物中特异性地表达外源基因奠定了基础。

例如，瑞士CIBA-GEIGY公司使用PR-IA启动子控制转基因烟草中Bt毒蛋白基因的表达，由于该启动子可受水杨酸及其衍生物诱导，通过喷酒廉价、无公害的化学物质，诱导抗虫基因在虫害重发生季节表达，显然是一个十分有效的途径。

在植物转基因研究中，使用天然的启动子往往不能取得令人满意的结果，尤其是在进行特异表达和诱导表达时，表达水平大多不够理想。

对现有启动子进行改造，构建复合式启动子将是十分重要的途径。

例如，Ni等人将章鱼碱合成酶基因启动子的转录激活区与甘露碱合成酶基因启动子构成了复合启动子，GUS表达结果表示：改造后的启动子活性比35S启动子明显提高。

吴瑞等人将操作诱导型的PI-II基因启动子与水稻Actinl基因内含子1进行组合，新型启动子的表达活性提高了近10倍（专利）。

For personal use only in study and research; not for commercial use表达载体的构建方法及步骤一、载体的选择及如何阅读质粒图谱目前，载体主要有病毒和非病毒两大类,其中质粒DNA 是一种新的非病毒转基因载体。

一个合格质粒的组成要素：（1）复制起始位点Ori 即控制复制起始的位点。

原核生物DNA 分子中只有一个复制起始点。

而真核生物DNA 分子有多个复制起始位点。

（2）抗生素抗性基因可以便于加以检测，如Amp+ ,Kan+（3）多克隆位点MCS 克隆携带外源基因片段（4）P/E 启动子/增强子（5）Terms 终止信号（6）加poly（A）信号可以起到稳定mRNA 作用选择载体主要依据构建的目的，同时要考虑载体中应有合适的限制酶切位点。

如果构建的目的是要表达一个特定的基因，则要选择合适的表达载体。

载体选择主要考虑下述3点：【1】构建DNA 重组体的目的，克隆扩增/基因表达，选择合适的克隆载体/表达载体。

【2】.载体的类型：（1）克隆载体的克隆能力－据克隆片段大小（大选大，小选小）。

如<10kb 选质粒。

（2）表达载体据受体细胞类型－原核/真核/穿梭，E.coli/哺乳类细胞表达载体。

（3）对原核表达载体应该注意：选择合适的启动子及相应的受体菌，用于表达真核蛋白质时注意克服4个困难和阅读框错位；表达天然蛋白质或融合蛋白作为相应载体的参考。

【3】载体MCS 中的酶切位点数与组成方向因载体不同而异，适应目的基因与载体易于链接，不能产生阅读框架错位。

综上所述，选用质粒（最常用）做载体的5点要求：（1）选分子量小的质粒，即小载体（1－1.5kb）→不易损坏，在细菌里面拷贝数也多（也有大载体）；（2）一般使用松弛型质粒在细菌里扩增不受约束，一般10个以上的拷贝，而严谨型质粒<10个。

（3）必需具备一个以上的酶切位点，有选择的余地；（4）必需有易检测的标记，多是抗生素的抗性基因，不特指多位Ampr（试一试）。

基因表达载体的构建操作流程一、了解基因表达载体。

基因表达载体就像是一个小货车，它要把我们感兴趣的基因（就好比是货物）运到细胞这个大工厂里，然后让基因在里面表达出我们想要的东西。

这个载体得有一些特定的部件。

比如说启动子，这就像是货车的发动机，启动整个表达过程。

还有终止子呢，就像是刹车，告诉基因什么时候停止表达。

另外，标记基因也很重要，它就像是货车上的独特标志，方便我们在细胞里找到这个载体是不是成功进去工作了。

二、获取目的基因。

那我们怎么得到想要的目的基因呢？这里有好多办法。

有一种是从基因文库里面找，基因文库就像是一个超级大的基因超市，里面各种各样的基因都有。

我们可以像在超市里找东西一样，用一些特殊的方法把我们要的基因挑出来。

还有一种方法是通过反转录法，如果我们知道这个基因表达出来的RNA长啥样，就能通过反转录把它变成DNA，也就是我们要的目的基因啦。

另外，化学合成法也能用，不过这个比较适合那些比较小的基因片段哦。

三、构建基因表达载体。

当我们有了目的基因，就要开始构建载体啦。

这就像是给我们的货物装到货车上的过程。

我们要把目的基因和载体用同一种限制性核酸内切酶来处理，这种酶就像是一把特殊的剪刀，它能在特定的位置把基因和载体都剪开，而且剪出来的口子是可以互相配对的。

然后呢，再用DNA连接酶把目的基因和载体连接起来，这个酶就像是胶水，把它们粘得牢牢的。

这样，我们的基因表达载体就初步构建好啦。

四、导入受体细胞。

构建好的载体得送到受体细胞里去才能发挥作用。

根据受体细胞的不同，导入的方法也不一样呢。

如果是细菌这样的细胞，我们可以用转化的方法，就像是偷偷地把东西送进去一样。

要是植物细胞的话，农杆菌转化法就比较常用啦，农杆菌就像是一个小邮差，把我们的载体送到植物细胞里面。

动物细胞的话，显微注射法是一种选择，就像是用一个超级小的注射器把载体注射到细胞里。

五、检测与鉴定。

载体送进去了，我们得看看它有没有成功呀。

首先就是检测目的基因是不是真的到了受体细胞里面。

一、简述原核生物和真核生物基因表达调控的异同点，并说明基因表达调控与基因工程表达载体构建的关系。

1．原核生物和真核生物基因表达调控的共同点：（1）结构基因均有调控序列；（2）表达过程都具有复杂性，表现为多环节。

2．不同点：原核生物：（1）RNA聚合酶只有一种，其σ因子决定RNA聚合酶识别特异性；（2）操纵子模型的普遍性；（3）阻遏蛋白与阻遏机制的普遍性（负性调节占主导）；（4）转录和翻译偶联进行；（5）转录后修饰、加工过程简单；（6）转录起始是基因表达调控的关键环节。

真核基因表达调控特点：（1）RNA聚合酶有三种，分别负责三种RNA转录，每种RNA聚合酶由约10个亚基组成；（2）活性染色质结构发生变化；（3）正性调节占主导；（4）转录和翻译分隔进行；（5）转录后修饰、加工过程较复杂；（6）转录起始是基因表达调控的关键环节。

3.由于基因的表达调控受到多种因子的影响，而构建基因工程表达载体时多是将真和生物的目的基因转入到原核生物载体上表达，所以应注意以下几点：（1）外源基因插入序列必须保持正确的方向和阅读框架。

其遗传密码不得缺失、遗漏、或错位及错码。

否则会导致编码错误的蛋白质分子，特别是目的基因序列内部应不含两端酶切位点的识别序列。

（2）插入的外源基因必须放在原核的启动子控制之下，也就是使原核的RNA 聚合酶能够识别插入的基因。

（3）外源基因必须能在大肠杆菌中进行有效转录（如无内含子），转录后的mRNA 在菌体必须相当稳定，并且能有效地进行翻译，转译的蛋白分子在菌体内不致于受菌体蛋白酶的降解。

二、目的基因功能和表达分析的意义是什么？目的基因功能与表达分析的主要环节有哪些？各有什么目的？这些环节与基因工程的主要环节有什么异同？1．意义：克隆的目的基因只有通过表达才能探索和研究基因的功能及基因表达调控的机理，明了其利用价值和途径。

2．主要环节：（1）目的基因的获得和加工：将得到的目的基因通过加工以期能连接到表达载体上并稳定表达；（2）载体的选择与加工：根据不同的实验目的和实验条件选择不同的载体，并对载体进行改造加工，使其满足高效连接的需要；（3）载体与目的基因的连接：即通过连接反应，将载体和目的基因连接形成重组DNA；（4）重组子导入受体细胞：通常将重组DNA导入大肠杆菌感受态进行扩增和筛选，以期得到大量的单一重组子，便于利用；（5）阳性克隆的筛选与鉴定：在连接产物中既有载体和目的基因的连接，也有载体自连、目的基因自连以及为发生连接的载体和目的基因，在转化过程中上述各种分子都会进入宿主细胞，所以需通过筛选鉴定出阳性克隆。

1．2基因工程的基本操作程序第1课时目的基因的获取、基因表达载体的构建课堂知能验收对应学生用书P0051．基因工程主要操作步骤的顺序是()①基因表达载体的构建②将目的基因导入受体细胞③目的基因的检测与鉴定④目的基因的获取A．③②④①B．②④①③C．④①②③D．③④①②答案 C解析基因工程的主要操作步骤顺序：目的基因的获取→基因表达载体的构建→将目的基因导入受体细胞→目的基因的检测和鉴定。

2．(2018·黑龙江哈尔滨三中高二验收试题)获取目的基因的方法有多种，下列不属于目的基因获取方法的是()A．从基因组文库中获取B．从cDNA文库中获取C．直接从受体细胞中提取D．利用PCR技术获取答案 C解析获取目的基因的方法有多种，例如可以从基因组文库中获取目的基因，可以从cDNA文库中获取目的基因，也可以利用PCR 技术获取目的基因，故A、B、D不符合题意；受体细胞是接受导入的目的基因的细胞，受体细胞自身不含目的基因，C符合题意。

3．下列关于基因文库的说法，错误的是()A．可分为基因组文库和部分基因文库B．cDNA文库属于部分基因文库C．基因组文库的基因在不同物种之间均可进行基因交流D．同种生物的cDNA文库中基因数量较基因组文库少答案 C解析基因组文库中只有部分基因能够在不同物种之间进行基因交流。

4．下列有关PCR技术的说法，不正确的是()A．PCR是一项在生物体外复制特定的DNA片段的核酸合成技术B．PCR技术的原理是DNA双链复制C．利用PCR技术获取目的基因的前提是要有一段已知目的基因的核苷酸序列D．PCR扩增中需要解旋酶解开双链DNA答案 D解析PCR是一项在生物体外复制特定的DNA片段的核酸合成技术，其原理是DNA双链复制，A、B正确；利用PCR技术获取目的基因的前提是要有一段已知目的基因的核苷酸序列，以便根据这一序列合成引物，C正确；PCR扩增中目的基因受热变性后解链为单链，不需要解旋酶解开双链DNA，D错误。

基因表达载体的构建步骤
基因表达载体的构建步骤：
①目的基因获取首先需从cDNA文库基因组DNA中PCR扩增出所需片段或通过化学合成方法得到纯净的目的基因；
②载体骨架选择根据后续实验需求如原核表达真核细胞表达植物动物体内表达等挑选合适质粒作为载体骨架；
③双酶切处理使用限制性内切酶对载体DNA进行特异性切割产生与目的基因相同的粘性末端或平末端便于连接；
④凝胶电泳检测将酶切产物加入琼脂糖凝胶中通过电泳分离出预期大小片段并用EB染色紫外灯照射观察；
⑤回收纯化利用商业化试剂盒或自制酚氯仿异丙醇沉淀法回收去除杂蛋白小分子RNA等杂质获得高纯度DNA；
⑥DNA连接取等摩尔浓度的目的基因与载体在T4DNA连接酶缓冲液中孵育过夜使两者以磷酸二酯键相连；
⑦大肠杆菌转化将连接产物热击转入感受态细胞中涂布含相应抗生素的选择平板37度培养箱过夜长出克隆；
⑧阳性克隆筛选挑取单菌落PCR鉴定插入片段大小测序比对确认无误后扩大培养提取质粒保存备用；
⑨启动子匹配根据目的基因表达调控需要从启动子文库中选出与宿主细胞相容性好诱导性强的启动子片段；
⑩多顺反子构建有时为了实现联合表达还需将多个基因串联起来形成多顺反子结构其间用IRES元件连接；
⑪终止子添加在多顺反子3'端加上终止子序列帮助RNA聚合酶识别转录终止位点防止下游基因串扰；
⑫安全评估构建好完整表达载体后还需对其遗传稳定性毒性免疫原性进行评估确保对人体环境友好无害。

中山大学硕士学位论文谷氨酸脱羧酶基因的克隆与表达姓名：***申请学位级别：硕士专业：微生物学指导教师：***20070608半醛（ｓｓＡ）和谷氨酸，然后ＳＳ＾在琥珀酸半醛脱氢酶（Ｓｕｃｅｉｎａｔｅｓｅｍｉａｌｄｅｈｙｄｅｄｅｈｙｄｒｏｇｅｎａｓｅ，简称ＳＳＡＤｒＩ）氧化下形成琥珀酸进入三羧酸循环，这些反应和谷氨酸脱羧酶（ｇｌｕｔａｍａｔｅｄｅｃａｒｂｏｘｙｌａｓｅ，ＥＣＡ．１．１．１５）催化的谷氨酸脱羧反应一起，构成了Ｙ一酮戊二酸氧化形成琥珀酸的另一条支路（Ｓｔｒｅｅｔｅｒｅｔａｌ，１９７２），称之为ＧＡＢＡ支路（如图１—１、卜２）。

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研究表明，ＧＡＢＡ可以提高葡萄糖磷酯酶的活性，从而促进动物大脑的能量代谢，活化脑血流，增加氧供给量，最终恢复脑细胞功能，改善神经机能。

（２）改善视觉功能。

据报道，将带有毛细管的电极插入老年猴子的大脑视觉神经皮层中，通过毛细管给神经细胞注入微量的ＧＡＢＡ。

比较给药前后视觉神经细７马倩中山大学硕士学位论文ＧＡＤ６７３４８８ｂｐ图．２．７ＧＡＤ６７的基因结构分析Ｆｉｇ．２·７ＴｈｅｇｅｎｅｓｔｒｕｃｔｕｒｅｏｆＧＡＤ６７马倩中山大学硕士学位论文细菌表达载体ｐＱＥ３０由本室保存。

物理图谱见图３—２。

ｐＱＥ－３０，ｐＱＥ·３Ｔ，ａｎｄｏＱＥ－３２ＶｅｃｔｏｒｇＰｏｓｉｔｉｏｎｓ研’ｅｌｅｍｅｎＩｓｉｎｂａｓｅｓ“ｐＱＥ·３０割０Ｅ－３１ｐＱＥ－３２Ｖ＊ｃｔｏｒ赫｛ｂｐｌ３４６１钍醴＋泓６２跏一ｏｆｎｕｍｂｅｒｉｎｇ耐热ｏｌ（ＣＴＣＧＡＧ）１蠢１－６ｌ毒Ｔ５ｐｒｏｍｏ栅／ｌａｃｏｐ烈司垂ｃ盱ｄｅｍｅｎｔ７－－８７瑚７７迎７ｒＴ５ｔｒｏｒ％ｃｒｉｐｔｉｏｎｓｔａｄ＂６１６１６ｌ６】ｃＨｉｓ－ｔａｇ∞ｄｉｎｇｓｅｑｕｅｍ：枣１２７—１４４他７－１钳１２７－ｔ４４Ｍｕｌ矗ｐｌｅｃ｜ｏｎｉｎｇ钳翻ｅ１４５一１９２１４７－１９４１４｛缸１９３ｈｂ如，Ｂ细ｎ５ｃ打ｐ如ｎｄｔｅｒｍｉｎａｔｉｏｎ理赫２０８－－３０２２１０．－３０４２０９－３０３咖８Ｔ１ｔｍｎｓｃｎ两ｏｎａｌｈ冀啊瞄抟ｃｌ｜；ｏｒｒｆｅ叠ｉｏ“１０６４－１１６２１０６６＿１１６４１０６．孓．１１６署Ｃｏｌ￡１ｏ南ｉｎｏｆｒｅｐｌｉｃａｔｍｎ１６３０１６４０１６３９参｛ｑ馥确瞅ｃｏｄｉｎｇｓｅｑ臼ｅｎｃ邑零２Ｓ垂－２３９６９２５＆－２３９８嚣２５７卫３９７叠竺‰燃盛驺§隔∞啼‘图３－２ｐＱＥ３０载体物理图谱、多克隆位点及测序引物占Ｆｉｇ．３－２Ｐｈｙｓｉｃａｌｍａｐｏｆｐ０Ｅ３０ｖｅｃｔｏｒａｎｄｉｔｓｍｕｌｔｉｐｌｅｃｌｏｎｉｎｇｓｉｔｅａｎｄｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇｐ一ｍｄｌ＇ｓ。

构建基因表达载体的步骤基因表达载体是用来将外源基因转录和翻译为蛋白质的重要工具。

构建一个高效的基因表达载体是基因工程的重要一步。

下面将介绍构建基因表达载体的步骤。

第一步：选择合适的表达载体在构建基因表达载体之前，需要选择适合自己研究对象的表达载体。

一般来说，常用的表达载体有质粒、病毒载体和细胞质表达系统等。

对于不同的表达载体，其表达效率和表达特点也有所不同，需要根据自己的实验需要进行选择。

第二步：选择合适的启动子和信号序列在表达载体中，启动子和信号序列是控制基因表达的关键元素。

启动子是转录起始位点上游的DNA序列，可以控制基因的转录水平；信号序列则可以控制基因的翻译和定位。

因此，在构建基因表达载体之前，需要选择适合自己实验需要的启动子和信号序列。

第三步：克隆外源基因在构建基因表达载体时，需要将外源基因克隆到载体中。

一般来说，可以使用PCR扩增方法或限制性内切酶切割方法将外源基因克隆到载体中。

此外，还需要选择合适的克隆位点，以便快速筛选出正确的克隆子。

第四步：构建表达载体在将外源基因克隆到载体中后，需要构建表达载体。

具体操作包括将启动子和信号序列插入到载体中，以实现对基因表达的控制。

此外，还需要进行质粒线性化和酶切等操作，以实现转染或转化细胞。

第五步：筛选表达载体在构建表达载体后，需要进行筛选，以确定正确的表达载体。

此时可以通过限制性内切酶酶切、PCR扩增和测序等方法进行筛选，以确保表达载体的正确性。

第六步：转染或转化细胞在确定正确的表达载体后，需要将其转染或转化到细胞中。

转染方法包括热激转染、电穿孔转染和基因炮转染等；转化方法则包括化学转化和电转化等。

根据自己的实验需要选择合适的转染或转化方法。

第七步：检测基因表达在转染或转化细胞后，需要检测外源基因的表达情况。

检测方法包括Western blotting、RT-PCR和荧光显微镜等。

根据自己的实验需要选择合适的检测方法。

总结构建基因表达载体是基因工程研究的重要一步。