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第2节基因工程的基本操作程序课标内容要求核心素养对接阐明基因工程的基本操作程序主要包括目的基因的筛选与获取、基因表达载体的构建、将目的基因导入受体细胞和目的基因的检测与鉴定。
1。
科学思维：结合生产实例，举例说出基因工程的基本操作程序。
2．科学探究：针对人类生产和生活的某一需求，尝试提出初步的基因工程构想，完成初步设计。
一、目的基因的筛选与获取1．目的基因(1）概念:用于改变受体细胞性状或获得预期表达产物等的基因。
(2）实例:培养转基因抗虫棉用到的目的基因是Bt抗虫蛋白基因.2．筛选合适的目的基因(1)较为有效的方法：从相关的已知结构和功能清晰的基因中进行筛选。
（2)实例:在培育转基因抗虫棉之前，科学家不仅掌握了Bt基因的序列信息，也对Bt基因的表达产物—-Bt抗虫蛋白有了较为深入的了解。
（3)认识基因结构和功能的技术方法：DNA测序技术、遗传序列数据库、序列比对工具。
3．利用PCR获取和扩增目的基因(1)PCR的含义：PCR是聚合酶链式反应的缩写，它是一项根据DNA半保留复制的原理，在体外提供参与DNA复制的各种组分与反应条件，对目的基因的核苷酸序列进行大量复制的技术.(2）条件：DNA模板、分别与两条模板链结合的2种引物、四种脱氧核苷酸、耐高温的DNA聚合酶。
（3)过程：①变性：温度上升到90 ℃以上，目的基因DNA受热变性后解为单链.②复性：温度下降到50 ℃左右时，两种引物通过碱基互补配对与两条单链DNA结合。
③延伸：温度上升到72 ℃左右时，溶液中四种脱氧核苷酸在耐高温的DNA聚合酶的作用下加到引物的3′端合成子链.④重复循环多次。
（4）结果：每次循环后目的基因的量增加一倍，即成指数形式扩增(约为2n)。
二、基因表达载体的构建1．构建基因表达载体的目的(1）使目的基因在受体细胞中稳定存在，并且可以遗传给下一代。
(2）使目的基因能够表达和发挥作用。
2．基因表达载体的组成[填图］3．基因表达载体的构建首先用一定的限制酶切割载体,使它出现一个切口，然后用同种限制酶或能产生相同末端的限制酶切割目的基因的DNA片段,再利用DNA连接酶将目的基因片段拼接到载体的切口处。
基因治疗中的表达载体构建与优化方法基因治疗是一种新兴的治疗方法，通过将修饰过的基因导入患者体内，以实现对疾病基因的修复或替代。
在基因治疗中，表达载体的构建和优化是关键的一步，它决定了基因在患者体内的表达效率和稳定性。
本文将介绍基因治疗中常用的表达载体构建与优化方法。
表达载体是将目标基因导入细胞内进行表达的工具。
常见的表达载体主要包括质粒和病毒载体。
质粒是一种双链DNA分子，它可以自主复制和表达携带的基因。
病毒载体是一种利用病毒基因表达机制的表达工具，常见的病毒载体有腺病毒、逆转录病毒和腱病毒等。
表达载体的选择应根据具体的治疗目标、基因大小和细胞类型等因素进行考虑。
表达载体的构建是基因治疗中的关键一步。
首先，需要将目标基因克隆到合适的表达载体中。
这可以通过PCR扩增目标基因，然后利用限制性内切酶进行酶切，并将目标基因与表达载体连接。
常用的连接方法有限制性内切酶切和连接、PCR聚合、Ligase连接等。
连接完成后，需要进行质粒或病毒载体的复制，以获得足够多的表达载体。
表达载体的优化是为了提高基因在患者体内的表达效率和稳定性。
优化的方法有很多种，下面将介绍几种常见的方法。
首先，可以通过调整启动子和增强子的选择来提高基因表达效率。
启动子是调控基因转录的序列，它的选择可以影响基因的表达水平。
常用的启动子有CMV启动子、EF1α启动子和PGK启动子等。
增强子可以增加基因的表达水平，常用的增强子有CMV增强子、SV40增强子和EF1α增强子等。
通过合理选择启动子和增强子的组合，可以提高基因在细胞内的表达水平。
其次，可以通过改变表达载体的拓扑结构来提高基因表达效率。
常用的方法有线性化质粒和环形质粒之间的选择。
线性化质粒在导入细胞内后，可更容易与细胞内的转录因子结合，从而促进基因的表达。
环形质粒则具有更好的稳定性，在不进一步构建的情况下，可以长期保持在细胞内。
此外，还可以通过引入信号序列来优化基因的靶向表达。
信号序列是一段具有特定功能的氨基酸序列，能够促使基因产物在细胞中的定位和分泌。
转基因表达指的是将外源基因整合到生物体的基因组中，使该基因在生物体内得以表达的过程。
转基因表达是转基因技术中的重要环节，其目的是使外源基因在受体生物体内表达，产生相应的蛋白质或代谢产物，从而实现定向改良生物性状、生产生物制品或治疗疾病的目的。
转基因表达的基本步骤包括：
1. 目的基因的获取：通过基因克隆技术获取目的基因，即需要表达的基因。
2. 载体的构建：将目的基因插入到载体中，构建成表达载体。
载体是基因的表达的基础，它能够将目的基因带入受体细胞，并在其中表达。
3. 转基因整合：将表达载体导入受体细胞，使目的基因整合到受体细胞的基因组中。
转基因整合是转基因表达的关键步骤，只有目的基因成功整合到受体细胞的基因组中，才能实现基因的表达。
4. 转基因表达的检测与鉴定：通过各种分子生物学和免疫学技术检测目的基因是否成功表达，并对表达产物的性质进行鉴定。
转基因表达的应用非常广泛，包括农业、工业、医药和环
保等领域。
例如，在农业上，将抗虫、抗病、抗旱等优良性状基因转入农作物，培育出高产、优质、抗逆的农作物新品种；在工业上，利用转基因技术生产各种蛋白质、酶和细胞因子等生物制品；在医药上，通过转基因技术治疗遗传性疾病和肿瘤等；在环保上，利用转基因技术降解污染物、修复环境。
总之，转基因表达是生物技术领域中的重要技术之一，它的发展对于推动生命科学研究和解决人类面临的许多问题都具有重要意义。
构建基因表达载体的流程下载温馨提示:该文档是我店铺精心编制而成，希望大家下载以后，能够帮助大家解决实际的问题。
文档下载后可定制随意修改，请根据实际需要进行相应的调整和使用，谢谢!Download Tip: This document has been carefully written by the editor.I hope that after you download, they can help you solve practical problems. After downloading, the document can be customized and modified. Please adjust and use it according to actual needs. Thank you!构建基因表达载体的流程：①目的基因选择与克隆：确定需要表达的基因序列，通过PCR扩增或从基因文库中提取，随后克隆到适合的质粒载体上，如pUC系列质粒，便于后续操作。
②载体选择与准备：根据表达系统（细菌、酵母、哺乳动物细胞等）和目的蛋白特性，选择合适的表达载体，如pET系列（原核）、pYES2（酵母）、pcDNA3.1（哺乳动物）。
载体需预先线性化或具有特定限制酶切位点。
③酶切与连接：使用限制性内切酶对目的基因片段和载体分别进行酶切，以产生相匹配的黏性末端或平末端。
之后，通过T4 DNA连接酶将目的基因片段连接到载体上。
④转化与筛选：将连接产物转入相应的宿主细胞（如大肠杆菌DH5α），通过热激、电击等方法促进细胞吸收DNA。
随后在含有抗生素的选择培养基上培养，筛选出含重组载体的阳性克隆。
⑤验证与测序：挑取阳性克隆，通过PCR、酶切分析或直接测序等方法验证目的基因是否正确插入载体，以及阅读框是否正确。
⑥表达验证：将验证后的重组载体转入最终的表达宿主细胞中，诱导表达目标蛋白，通过SDS-PAGE、Western Blot等方法检测蛋白的表达效率及特性。
基因表达载体的构建方法
基因表达载体是一种用来传递外源基因并在宿主细胞中表达的工具。
构建基因
表达载体是基因工程研究中的重要一环，下面将介绍基因表达载体的构建方法。
首先，选择合适的载体。
常见的基因表达载体包括质粒、病毒等。
在选择载体时，需要考虑载体的大小、稳定性、复制能力、宿主范围等因素，确保选择的载体能够满足所需的表达要求。
其次，准备外源基因。
外源基因可以通过PCR扩增、化学合成等方法获取。
在获取外源基因时，需要考虑基因的大小、序列的一致性、是否含有启动子、终止子等重要元件。
接下来，进行连接。
将外源基因与载体进行连接，通常采用限制性内切酶切割
和连接酶的作用，将外源基因与载体进行粘连连接，形成重组载体。
然后，进行转化。
将构建好的基因表达载体导入宿主细胞中，通常采用化学法、电穿孔法、病毒载体法等方法进行转化，确保外源基因能够成功地表达。
最后，筛选和鉴定。
通过抗生素筛选、酶切鉴定、测序等方法对构建好的基因
表达载体进行筛选和鉴定，确保所构建的基因表达载体能够稳定、高效地表达外源基因。
在构建基因表达载体的过程中，需要注意实验操作的严谨性和规范性，确保实
验结果的准确性和可重复性。
同时，还需要根据具体的研究需求和实验条件，选择合适的构建方法和实验方案，以确保构建的基因表达载体能够满足所需的表达要求。
总的来说，构建基因表达载体是基因工程研究中的重要一环，通过选择合适的
载体、准备外源基因、进行连接、转化、筛选和鉴定等步骤，可以构建出稳定、高效地表达外源基因的基因表达载体，为基因工程研究和应用提供重要的工具和平台。
一、简述原核生物和真核生物基因表达调控的异同点，并说明基因表达调控与基因工程表达载体构建的关系。
1．原核生物和真核生物基因表达调控的共同点：（1）结构基因均有调控序列；（2）表达过程都具有复杂性，表现为多环节。
2．不同点：原核生物：（1）RNA聚合酶只有一种，其σ因子决定RNA聚合酶识别特异性；（2）操纵子模型的普遍性；（3）阻遏蛋白与阻遏机制的普遍性（负性调节占主导）；（4）转录和翻译偶联进行；（5）转录后修饰、加工过程简单；（6）转录起始是基因表达调控的关键环节。
真核基因表达调控特点：（1）RNA聚合酶有三种，分别负责三种RNA转录，每种RNA聚合酶由约10个亚基组成；（2）活性染色质结构发生变化；（3）正性调节占主导；（4）转录和翻译分隔进行；（5）转录后修饰、加工过程较复杂；（6）转录起始是基因表达调控的关键环节。
3.由于基因的表达调控受到多种因子的影响，而构建基因工程表达载体时多是将真和生物的目的基因转入到原核生物载体上表达，所以应注意以下几点：（1）外源基因插入序列必须保持正确的方向和阅读框架。
其遗传密码不得缺失、遗漏、或错位及错码。
否则会导致编码错误的蛋白质分子，特别是目的基因序列内部应不含两端酶切位点的识别序列。
（2）插入的外源基因必须放在原核的启动子控制之下，也就是使原核的RNA 聚合酶能够识别插入的基因。
（3）外源基因必须能在大肠杆菌中进行有效转录（如无内含子），转录后的mRNA 在菌体必须相当稳定，并且能有效地进行翻译，转译的蛋白分子在菌体内不致于受菌体蛋白酶的降解。
二、目的基因功能和表达分析的意义是什么？目的基因功能与表达分析的主要环节有哪些？各有什么目的？这些环节与基因工程的主要环节有什么异同？1．意义：克隆的目的基因只有通过表达才能探索和研究基因的功能及基因表达调控的机理，明了其利用价值和途径。
2．主要环节：（1）目的基因的获得和加工：将得到的目的基因通过加工以期能连接到表达载体上并稳定表达；（2）载体的选择与加工：根据不同的实验目的和实验条件选择不同的载体，并对载体进行改造加工，使其满足高效连接的需要；（3）载体与目的基因的连接：即通过连接反应，将载体和目的基因连接形成重组DNA；（4）重组子导入受体细胞：通常将重组DNA导入大肠杆菌感受态进行扩增和筛选，以期得到大量的单一重组子，便于利用；（5）阳性克隆的筛选与鉴定：在连接产物中既有载体和目的基因的连接，也有载体自连、目的基因自连以及为发生连接的载体和目的基因，在转化过程中上述各种分子都会进入宿主细胞，所以需通过筛选鉴定出阳性克隆。
基因表达载体的构建步骤
基因表达载体的构建步骤：
①目的基因获取首先需从cDNA文库基因组DNA中PCR扩增出所需片段或通过化学合成方法得到纯净的目的基因；
②载体骨架选择根据后续实验需求如原核表达真核细胞表达植物动物体内表达等挑选合适质粒作为载体骨架；
③双酶切处理使用限制性内切酶对载体DNA进行特异性切割产生与目的基因相同的粘性末端或平末端便于连接；
④凝胶电泳检测将酶切产物加入琼脂糖凝胶中通过电泳分离出预期大小片段并用EB染色紫外灯照射观察；
⑤回收纯化利用商业化试剂盒或自制酚氯仿异丙醇沉淀法回收去除杂蛋白小分子RNA等杂质获得高纯度DNA；
⑥DNA连接取等摩尔浓度的目的基因与载体在T4DNA连接酶缓冲液中孵育过夜使两者以磷酸二酯键相连；
⑦大肠杆菌转化将连接产物热击转入感受态细胞中涂布含相应抗生素的选择平板37度培养箱过夜长出克隆；
⑧阳性克隆筛选挑取单菌落PCR鉴定插入片段大小测序比对确认无误后扩大培养提取质粒保存备用；
⑨启动子匹配根据目的基因表达调控需要从启动子文库中选出与宿主细胞相容性好诱导性强的启动子片段；
⑩多顺反子构建有时为了实现联合表达还需将多个基因串联起来形成多顺反子结构其间用IRES元件连接；
⑪终止子添加在多顺反子3'端加上终止子序列帮助RNA聚合酶识别转录终止位点防止下游基因串扰；
⑫安全评估构建好完整表达载体后还需对其遗传稳定性毒性免疫原性进行评估确保对人体环境友好无害。
2022广西南宁高二期末考题目金太阳生物1．下列关于基因表达载体的说法，不正确的是（） [单选题] *A．基因表达载体的构建是基因工程的核心步骤B．基因表达载体包含启动子、目的基因、终止子、标记基因等C．终止子位于目的基因的下游，能够终止翻译过程(正确答案)D．不同的目的基因所需的启动子不一定相同答案解析：【解析】【分析】基因表达载体的构建：（1）目的：使目的基因在受体细胞中稳定存在并且可以遗传给下一代并表达和发挥作用。
（2）基因表达载体的组成：目的基因+启动子+终止子+标记基因。
【详解】A、基因表达载体使目的基因在受体细胞中稳定存在并且可以遗传给下一代并表达和发挥作用，是基因工程的核心步骤，A正确；B、基因表达载体包括启动子、终止子、目的基因、标记基因，其中启动子位于目的基因的首端，终止子位于目的基因的末端，B正确；C、终止子位于目的基因的下游，能够终止转录过程，C错误；D、不同的目的基因具有不同的核苷酸序列，其启动子也不尽相同，D正确。
故选C。
2．下列有关限制酶和DNA连接酶的叙述正确的是（） [单选题] *A．用限制酶酶切获得一个外源基因时得到两个切口，有2个磷酸二酯键被断开B．限制酶识别序列越短，则该序列在DNA中出现的概率就越大(正确答案) C．序列—CATG↓—和—G↓GATCC—被限制酶切出的黏性末端碱基数不同D．T4 DNA连接酶和E.coli DNA连接酶都能催化平末端和黏性末端的连接答案解析：【解析】【分析】1、关于限制酶，考生可以从以下几方面把握：（1）来源：主要从原核生物中分离纯化出来。
（2）特异性：能够识别双链DNA分子的某种特定核苷酸序列，并且使每一条链中特定部位的两个核苷酸之间的磷酸二酯键断裂。
（3）结果：形成黏性末端或平末端。
注意：用限制酶切割DNA时，每切开一个切口需要水解两个磷酸二酯键。
2、DNA连接酶：（1）根据酶的来源不同分为两类：E．coliDNA连接酶、T4DNA连接酶。
构建基因表达载体的步骤基因表达载体是用来将外源基因转录和翻译为蛋白质的重要工具。
构建一个高效的基因表达载体是基因工程的重要一步。
下面将介绍构建基因表达载体的步骤。
第一步：选择合适的表达载体在构建基因表达载体之前，需要选择适合自己研究对象的表达载体。
一般来说，常用的表达载体有质粒、病毒载体和细胞质表达系统等。
对于不同的表达载体，其表达效率和表达特点也有所不同，需要根据自己的实验需要进行选择。
第二步：选择合适的启动子和信号序列在表达载体中，启动子和信号序列是控制基因表达的关键元素。
启动子是转录起始位点上游的DNA序列，可以控制基因的转录水平；信号序列则可以控制基因的翻译和定位。
因此，在构建基因表达载体之前，需要选择适合自己实验需要的启动子和信号序列。
第三步：克隆外源基因在构建基因表达载体时，需要将外源基因克隆到载体中。
一般来说，可以使用PCR扩增方法或限制性内切酶切割方法将外源基因克隆到载体中。
此外，还需要选择合适的克隆位点，以便快速筛选出正确的克隆子。
第四步：构建表达载体在将外源基因克隆到载体中后，需要构建表达载体。
具体操作包括将启动子和信号序列插入到载体中，以实现对基因表达的控制。
此外，还需要进行质粒线性化和酶切等操作，以实现转染或转化细胞。
第五步：筛选表达载体在构建表达载体后，需要进行筛选，以确定正确的表达载体。
此时可以通过限制性内切酶酶切、PCR扩增和测序等方法进行筛选，以确保表达载体的正确性。
第六步：转染或转化细胞在确定正确的表达载体后，需要将其转染或转化到细胞中。
转染方法包括热激转染、电穿孔转染和基因炮转染等；转化方法则包括化学转化和电转化等。
根据自己的实验需要选择合适的转染或转化方法。
第七步：检测基因表达在转染或转化细胞后，需要检测外源基因的表达情况。
检测方法包括Western blotting、RT-PCR和荧光显微镜等。
根据自己的实验需要选择合适的检测方法。
总结构建基因表达载体是基因工程研究的重要一步。
基因表达载体的构建流程基因表达载体的构建呀，那可真是个超有趣的事儿呢。
咱先来说说啥是基因表达载体。
简单来讲呢，它就像是一个小快递车，专门负责把咱们感兴趣的基因运到细胞这个大“城市”里的指定地方，然后让这个基因在那儿发挥作用。
这个小快递车得有一些特殊的构造，这样才能把基因稳稳地送到，还能让基因在目的地好好工作。
那构建这个基因表达载体的流程到底是咋样的呢？一是要有目的基因。
这目的基因就像是快递车上要送的宝贝。
我们得想办法从生物的基因组里把这个我们想要的基因找出来。
这就好比在一个超级大的仓库里找一个特定的小物件，有时候可不容易呢。
可能要用到一些特殊的方法，像从DNA里把这个基因切出来。
这就像用一把超级精准的小剪刀，只把我们要的那部分基因剪下来，可不能剪错了哦。
接着就是选择合适的载体。
载体的种类还不少呢，就像快递车有不同的型号。
有的载体适合在细菌里跑运输，有的呢就适合在植物细胞或者动物细胞里工作。
我们得根据自己的需求，挑选那种和目的基因最配的载体。
这个载体得有一些特殊的地方，比如说有一些特定的位点，就像快递车上有专门放东西的小格子，这样目的基因才能安安稳稳地待在上面。
然后就是把目的基因和载体连接起来。
这就像是把宝贝小心翼翼地放到快递车上的小格子里。
这得用到一些特殊的“胶水”，在基因这个世界里，这些“胶水”就是一些酶啦。
这些酶能够把目的基因和载体紧紧地粘在一起，让它们成为一个整体。
这个过程可不能马虎，如果没粘好，在运输的过程中基因可能就掉出来了，那可就糟糕了。
再之后呢，就是要把这个构建好的基因表达载体导入到细胞里面。
这就像是把装满宝贝的快递车送到目的地城市里。
导入的方法也有很多种，不同的细胞可能适合不同的导入方式。
比如说，对于细菌细胞，可能有一种简单的方法，就像把快递车直接开到城门那里就可以进去了。
但是对于一些比较复杂的细胞，像动物细胞，可能就需要一些更复杂的手段，就像要偷偷地找个小道才能把快递车开进去。
