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Sanger测序，也被称为双脱氧链终止法，是一种用于确定DNA或RNA序列的技术。
以下是其原理和步骤：
原理：
Sanger测序基于DNA聚合酶的DNA合成过程，通过添加双脱氧核苷三磷酸（ddNTP）来终止DNA链的延伸，从而得到一系列不同长度的DNA片段。
ddNTP与普通dNTP的区别在于其3′端缺少一个羟基，这使得ddNTP在DNA合成过程中不能形成磷酸二酯键，从而导致DNA合成反应中断。
通过在反应中加入四种不同的ddNTP，可以得到包含不同长度的DNA片段，从而揭示出DNA分子中核苷酸的顺序。
步骤：
DNA模板制备：从待测序的DNA样品中提取出目标DNA片段，并进行PCR扩增，得到足够的DNA模板。
DNA合成反应：在PCR扩增反应中，加入四种不同的dNTP和一种ddNTP。
由于ddNTP可以随机地终止DNA链的延伸，因此可以得到一系列不同长度的DNA片段。
电泳分离：将得到的DNA片段进行电泳分离，使不同长度的DNA 片段得以分离。
检测：通过放射自显影等技术对电泳结果进行检测，从而确定DNA 序列。
DNA序列测定技术（Sanger双脱氧链终止法与Maxam－Gilbert DNA 化序列测定的技术和策略Sanger双脱氧链终止法Maxam－Gilbert DNA 化学降解法测序策略目前应用的两种快速序列测定技术是Sanger等（1977）提出的酶法及Maxam和Gilbe rt(1977)提出的化学降解法。
虽然其原理大相径庭，但这两种方法都是同样生成互相独立的若干组带放射性标记的寡核苷酸，每组寡核苷酸都有固定的起点，但却随机终止于特定的一种或者多种残基上。
由于 DNA 上的每一个碱基出现在可变终止端的机会均等，因些上述每一组产物都是一些寡核苷酸混合物，这些寡核苷酸的长度由某一种特定碱基在原DNA 全片段上的位置所决定。
然后在可以区分长度仅差一个核苷酸的不同DNA 分子的条件下，对各组寡核苷酸进行电泳分析，只要把几组寡核苷酸加样于测序凝胶中若干个相邻的泳道这上，即可从凝胶的放射自影片上直接读出DNA 上的核苷酸顺序。
一、Sanger双脱氧链终止法Sanger法DNA 测序的试剂引物模板DNA 聚合酶放射性标记的dNTPdNTP类似物现行的逻终止法人加减法序列测定技术（Sacger和Coulson，1975）发展而来的。
加减法首次引入了使用特异引物在DNA 聚合酶作用下进行延伸反应、碱基特异性的链终止，以及采用聚丙烯酰胺凝胶区分长度差一个核苷酸的单链DAN等3种方法。
尽管有了这些进展，但加减法仍然太不精确，也太不得法，因此难以广为接受。
直至引入双氧核苷三磷酸（ddTBP）作为链终止剂（Sanger等，1977 ），酶法DNA 序列测定技术才得到广泛应用。
2'，3'ddNTP与普通dNTP不同之处在同它们在脱氧核糖的3' 位置缺少一个羟基。
它们可以在DNA 聚合酶作用下通过其5' 三磷酸基团掺入到正在增长的DNA 链中，但由于没有3'羟基，它们不能同后续的dNTP形成磷酸二酯链，因此，正在增长的DNA 链不可能继续延伸。
双脱氧终止法的原理(一)双脱氧终止法1. 介绍•双脱氧终止法是一种常用的DNA测序技术，也被称为Sanger测序法。
它是由弗雷德里克·桑格（Frederick Sanger）在20世纪70年代开发的。
•这种技术基于DNA的合成与复制原理，通过测定DNA链上不同位置的碱基序列，从而揭示DNA分子的结构和功能。
2. 原理该方法主要包括以下步骤：DNA复制•首先，需要复制待测DNA片段。
这一步通过PCR（聚合酶链式反应）来实现，PCR能够使DNA在体外被扩增成大量拷贝。
dNTP与ddNTP的标记•在复制的过程中，需要加入一种更特殊的DNA构建块：ddNTP （2’, 3’- 二脱氧核苷三磷酸），与普通的dNTP（2’, 3’-二脱氧内苷三磷酸）有所不同。
•ddNTP会在DNA链的延伸过程中停止进一步延伸，而dNTP可以持续延伸。
反应体系•反应体系中，含有待测DNA片段的DNA模板、引物（合成DNA的起始点），dNTPs（分子内苷三磷酸）、ddNTPs和DNA聚合酶。
•反应体系中含有4种不同的ddNTP，分别对应A、T、C和G四种碱基。
DNA合成与终止•反应进行时，聚合酶从引物延伸模板，向复制链上加入适当碱基，与模板DNA的互补碱基对应。
•当遇到某个ddNTP时，链的延伸被终止，因为ddNTP没有羟基(OH)可以与下一个碱基连接。
•这样，在反应体系中就会产生一系列碱基长度不同的DNA片段。
碱基定序•终止反应后，产生的DNA片段通过电泳分离。
电泳是一种根据DNA片段大小和电荷质量之比进行分离的技术。
•在电泳过程中，DNA片段会根据其长度从短到长依次分离出来。
•最终，可以以碱基对应的顺序来识别不同长度的DNA片段，从而得出DNA的碱基序列。
3. 结论•双脱氧终止法是一种可靠而有效的DNA测序技术，被广泛应用于生物学、医学等领域。
•通过特殊标记的ddNTP与普通的dNTP的结合，可以在延伸过程中终止链的延伸，从而产生一系列长度不同的DNA片段。
双脱氧终止法测序的原理双脱氧终止法测序，听起来是不是有点复杂？其实它就像一场科学界的精彩戏剧，让我们一起看看这个有趣的过程吧！这种测序方法的名字就有点意思，“双脱氧”听上去像是什么魔法药水，其实它是DNA的基本构件之一。
想象一下，DNA就像一条长长的双螺旋楼梯，而我们要做的，就是找出这条楼梯上每一步的秘密。
说白了，就是要弄清楚DNA里面的“字母”是什么。
好了，首先要准备一些小助手，叫做“脱氧核苷酸”，这些小家伙是DNA的拼图块，它们有四种，分别是腺嘌呤、鸟嘌呤、胞嘧啶和胸腺嘧啶。
这个时候，我们的主角“DNA模板”登场了，科学家们会把要测序的DNA分子放进去，然后加上这些脱氧核苷酸。
听到这，你是不是有点兴奋？就是关键时刻，加入了特殊的“终止剂”，就像在比赛中设立了终点线。
这时候有趣的事情发生了！终止剂会和脱氧核苷酸结合，导致DNA合成在某个特定位置停止。
就像我们在聚会上跳舞，忽然DJ放了一首慢歌，大家都停下来了。
这个停下来的点，正好就是我们需要记录的“字母”。
科学家们用各种方法把这些终止的DNA 片段分开，然后再进行分析，最终把每一个“字母”都一一拼凑起来。
可能有些朋友会问了，这种方法有什么特别之处呢？双脱氧终止法是非常准确的，就像精致的钟表，能精确到每一秒。
这种方法的发明者还因此获得了诺贝尔奖，真是值得点赞！这种测序方式的应用可广泛了，比如在医学上帮助我们了解基因病，或者在考古学上让我们找到古老DNA的秘密。
多么令人兴奋的科学探索啊！这一切的背后，都离不开科学家们的努力。
想象一下，他们在实验室里穿着白大褂，手里拿着各种设备，脸上挂着认真又兴奋的神情。
为了一个个数据，他们可谓是绞尽脑汁，有时候甚至会遇到意想不到的挑战。
比如，可能会出现一些干扰因素，影响测序的准确性，这时候就得重新审视整个过程，确保每一步都走得稳稳当当。
双脱氧终止法测序就像是科学界的一场大冒险，既有挑战又有惊喜。
每一个字母的拼凑，都像是解开了一道道谜题，让我们更加了解生命的奥秘。
核酸的核苷酸序列测定方法一、Sanger双脱氧链终止法1、基本原理：将2'3'-双脱氧核苷酸（ddNTP）掺入到新合成的DNA链中，由于ddNTP缺乏3'-OH，因此不能与下一位核苷酸反应形成磷酸二酯键，DNA合成反应终止。
2、基本步骤：进行四组平行反应，每组反应均使用相同的模板，相同的引物以及四种脱氧核苷酸；并在四组反应中各加入适量的四种之一的双脱氧核苷酸，使其随机地接入DNA链中，使链合成终止，产生相应的四组具有特定长度的、不同长短的DNA链。
这四组DNA链再经过聚丙烯酸胺凝胶电泳按链的长短分离开，经过放射自显影显示区带，就可以直接读出被测DNA 的核苷酸序列。
【例如】：某一个DNA分子, 互补序列是GATCCGAT:①在第一个反应体系中加入dNTP+ddATP, 所以遇到G, T, C三个碱基时没什么问题, 但遇到A时, 掺入的可能是dATP或ddATP, 比如已合成到G, 下一个如果参与反应的是ddATP则终止, 产生一个仅有2个核苷酸的序列: GA, 否则继续延伸, 可以产生序列GATCCG, 又到了下一个A了. 同样有两种情况, 如果是ddATP掺入, 则产生的序列是GATCCGA, 延伸终止, 否则可以继续延伸, 产生GATCCGAT.所以在第一个反应系统中产生的都是以A结尾的片段: GA, GATCCGA,②在第二个反应体系中加入dNTP+ddCTP,产生的都是以C结尾的片段:GATC, GATCC,③在第三个反应体系中加入dNTP+ddGTP,产生的都是以G结尾的片段:G, GATCCG④在第四个反应体系中加入dNTP+ddTTP,产生的都是以T结尾的片段:GAT, GATCCGAT,电泳时按分子量大小排列, ①反应体系中的片段长度为2, 7; ②反应体系中的为4, 5;③反应体系中为1, 6; ④反应体系中的为3, 8, 四个反应体系的产物分别电泳, 结果为：87654321 。
[目的]掌握双脱氧链终止法测定DNA序列的原理与方法[原理]DNA聚合酶催化的DNA链延伸是在3’-OH末端上进行的。
由于2’，3’-双脱氧三磷酸核苷酸(ddNTP)的3’-位脱氧而失去游离-OH，当它参入到DNA链后，3’-OH末端消失，使DNA链的延伸终止。
本实验根据此原理，将待测DNA片段插入单链噬菌体M13载体，并用合成的寡聚核苷酸引物与该载体上插入待测片段的上游顺序退火，随后在T7DNA聚合酶催化下进行延伸反应。
实际操作中同时进行，分别终止于A、G、C和T的4个反应体系。
每个反应体系均含4种脱氧三磷酸核苷酸(dNTP)底物，其中—种dATP为32P标记物，以便能用放射自显影法读序。
但在这4个反应体系中，分别加一种低浓度的ddNTP(ddATP、ddGTP、ddCTP或ddTTP)，这样ddN TP可随机参入正在延伸的DNA链上，使链延伸终止。
例如在“A”管中加ddATP，反应结束时，管内所有新合成的DNA链都是以A结尾的不同长度的片段，而且这些片段都带放射性。
将反应物加在高分辨凝胶上电泳，DNA片段则因其长度不同(分子量大小不同)被分离，短的走在前端，长的泳动在后面。
其他3管则分别为以G，C或T结尾的不同长度DNA片段。
由于：①即使是长短相差一个核苷酸的DNA片段，亦可根据其电泳距离的差异而加以区分；②A、G、C和T4种反应体系的产物在电泳凝胶中相邻排列。
故而在阅读凝胶电泳的放射自显影图像时，由下至上按前后顺序即可将DNA的核苷酸顺序读出。
[操作]1．单链模板与引物退火(1)用无菌蒸馏水按1：5稀释通用引物(约4.44μg/ml)。
(2)取1.5ml微量离心管1只，加入下列试剂：模板DNA(1.5-2ugDNA/10μl)10μl；稀释通用引物2μl；退火缓冲液2μl,总体积14μl。
2．链延伸/终止反应(1)稀释T7DNA聚合酶：取2μl(或4μl)冷的酶稀释缓冲液至1只微量离心管中，加入0.5μl(或lμl)T7DNA聚合酶，用加样器轻轻抽吸和排出而混匀，置冰浴中待用。
(2)另取4只微量离心管，分别用记号笔标明“A”、“G”、“C”和“T”。
依次将A-Mix、G-Mix、C-Mi x和T-Mix液各2.5μl分别加入这4只微量离心管中，置37℃预温1分钟以上(说明：4种mix 液各又分为short和long两种，前者中ddNTP浓度较高，用于<500bp的DNA片段的测序，后者用于50-1000bp片段的测序。
一般应用short即可)。
(3)标记反应：在操作(1)的微量离心管中加入下列试剂：模板/引物14μl(已有)；标记用混合物(1abellingmix)3μ1；已标记混合物(1abelled mix)1μ1，T7DNA聚合酶稀释液2μ1。
总体积2 0μ1。
轻轻混匀，简短离心，置室温5分钟，立即接下步反应。
(4)从“标记反应”混合物中，分别取4.5μl加于4只预温的反应液中(注意：每一次转移均应换用新的吸头)，轻轻混匀。
简短离心，37℃保温5分钟。
(5)向每只离心管中加入5μl反应终止液，混匀，简短离心。
(6)变性反应：在电泳前进行。
在上述链延伸反应终止后，最好即时进行变性反应并电泳，如不能及时电泳，终止反应后样品可储于冰浴或4℃。
另取4只微量离心管，标好“A”、“G”、“C”和“T”。
从上述每一链延长/终止反应的试管中取3μ1，分别加入4只已标号的相应微量离心管中，75-80℃加热2分钟，立即各取1.5-2μ1点样、电泳。
3．制备电泳凝胶及电泳(1)制备胶模：取双块制胶玻板，先用泡沫海绵沾“洗洁净”液仔细擦洗，用水彻底淋洗，干燥后继用酒精清洗，晾干，再用硅烷剂(repel-silane)将玻板的—面擦一遍，蒸馏水淋洗，干燥(注意：清洗时应戴一次性手套操作)。
将其中一块玻板平置台上(硅烷处理过的—面朝上)，两侧各放置一条隔离条(最好选用上方厚为0.2mm，下方厚0.4mm的楔形条)，另取—块玻板(硅烷化处理过的—面朝下)，对准放置在上述玻板上，两侧及—面边缘用胶带封严，并用文具夹夹紧，制成胶模。
(2)配制电泳凝胶：向1只100ml烧杯中加入下列试剂；20%丙烯酰胺溶液20ml；10×TB E缓冲液5ml；46.7%尿素溶液25ml。
总体积50ml(凝胶的丙烯酰胺浓度为8%)。
混匀，过滤除去不溶物，置100ml梨形瓶中连接水泵抽气5分钟，加入250μl 10%过硫酸铵，50μlTEMED 混匀。
(3)注胶：立即将配好的凝胶用50ml注射器小心注入制好的玻板胶模中(胶模宜倾斜45度左右)，注意防止气泡，如有气泡产生，可敲击该部位玻璃，使气泡上升排除。
从上面插入梳齿背，深入胶面约10-12mm。
将胶模水平放置45-60分钟，待凝胶聚合。
(4)电泳：凝胶聚合后，拨掉梳齿，撕去玻板下缘胶带，用蒸馏水淋洗凝胶表面，以除去未聚合物质。
将胶板装置在电泳槽上，上下槽加入缓冲液，注意排除凝胶下缘气泡。
接通电源，4 0W预电泳45-60分钟。
预电泳结束后，断电。
插入样品梳，梳齿向下插入凝胶中3mm左右。
用缓冲液小心冲洗每一加样小槽(齿间空隔)，用记号笔标明A、G、C和T4个小槽，每槽加入变性后的链延伸/终止液1.5-2μl。
接通电源，40W恒压，电泳至示踪染料溴酚蓝至底边时切断电源。
如待测片段较长而需继续点样，则等示踪染料二甲苯腈蓝称至距下缘4-5cm时切断电源，用缓冲液冲洗另一组4个加样小槽(应与前一组相隔1-2个加样小槽)，重复上样操作，然后继续电泳至第2组示踪染料溴酚蓝移至玻板下缘时断电，停止电泳。
4．放射自显影及结果分析将凝胶板自电泳槽取下后水平放置，小心分离两块玻板，让凝胶完好地留在其中一块玻板上。
可将凝胶切下一小角以示方向。
在凝胶上小心地覆盖一张厚的3号新华滤纸，移去玻板，在凝胶另一面覆盖一张保鲜膜，注意排除气泡。
滤纸面朝下置凝胶干燥器中干燥。
于暗室中，将干燥的凝胶的保鲜膜面与一张X光底片的药膜面贴合，夹在增感屏盒中，置70℃或室温曝光4-16小时，然后显影、定影(按所用显影及定影剂说明进行)，水漂洗、干燥。
然后由下而上读序。
[注意事项]1．操作顺序参考表(1)制备电泳凝胶(可在前一天下班前进行)。
(2)检查实验计划及试剂。
(3)预电泳。
(4)预电泳的同时进行引物退火、链延伸及终止反应。
(5)点样并电泳(根据需要可重复1-2次)。
(6)固定、干燥凝胶。
(7)放射自显影。
2．M13重组子的培养(1)挑取单一的大肠杆菌集落加入3ml LB培养基中，37℃振荡培养直至A600光密度达到0.8-1.0为止。
(2)取200μl上述大肠杆菌培养物，加入含有2ml 2×YT培养基的试管中，再将插入待测D NA片段的M13单一白色噬菌斑接种其中，在37℃剧烈振荡培养至少5小时，但不宜超过8小时。
(3)通过两轮离心将细胞除去，第2轮的上清液小心转移至另一清洁试管中。
存放4℃待用。
3．单链模板的分离(1)沉淀M13：在上述M13培养物上清中，加入0.2倍体积的3.5mol/L醋酸铵/20%多聚乙二醇溶液，颠倒混匀数次，置冰浴30分钟。
离心15-30分钟(11000g)可见白色噬菌体沉淀。
小心除去上清液，可将试管倒置并吸去多余液体。
(2)分离纯化模板：向沉淀中加入TE缓冲液100μl，轻轻混匀使沉淀重悬，(以下步骤可在微量离心管中进行)。
再加等体积酚/氯仿试剂，旋转振荡30秒，离心1分钟使分层。
小心将上层液转移至另—干净离心管中。
用酚/氯仿重复抽提一次并转移上层液。
加等体积氯仿，离心，转移上层液至洁净管中，并重复1次。
加1/10体积3mol/L醋酸钠(pH7.5)及两倍体积100%乙醇，混合，置干冰(或-40℃冰箱)中15分钟，离心10分钟，除去上清，加冰冷的70%乙醇lml，离心，除去上清，于真空条件短暂干燥。
加入20μlTris缓冲液溶解DNA沉淀，储于-20℃待用。
用于测序的DNA，其A260/A280光密度比值至少应大于1.7。
[试剂与器材]1．试剂(1)退火缓冲液：1mol/L Tri-HCl(pH7.6)，l00mmol/L MgCl2和160mmol/L DTT。
(2)通用测序引物：5’-d[CGTAAAACGACGGCCAGT]-3’，在水溶液中(5pmol/μl)。
(3)T7DNA聚合酶(8ug/μl)：在加有甘油的缓冲液中,应储于-20℃，用时吸取1份后迅速放回。
稀释液可在4℃保存l周。
(4)酶稀释缓冲液：20mmol/L Tris-HCl(pH7.5)，5mmol/L DTT，100 u g牛血清白蛋白/ m1，5%甘油。
(5)标记用混合物(Labelling Mix)：dCTP，dGTP和dTTP各1.375μm，333.5mmol/L Na Cl。
(6)模板：l0μg单链M13mpl8DNA在50μ1Tris-EDTA缓冲液中。
(7)“A”mixshort：dCTP，dGTP和dTTP各840μmol/L，93.5μmol/L dATP，14μmol/L dd ATP，40mmol/L Tris-HCl(pH7.6)，50mmol/L NaCl(8)“G"mixshort；dATP，dCTP和dTTP各840μmol/L，93.5μmol/LdGTP，14μmol/L dd GTP，40mmol/L Tris-HCl(pH7.6)，50mmol/LNaCl(9)"C"mixshort：dATP，dGTP和dTTP各840μM，93.5μmol/LdCTP，14μmol/L ddCTP，40mmol/L Tris- HCl(pH7.6)，50mmol/LNaCl。
(10)"T/mixshort：dATP，dCTP和dGTP各840μmol/L，93.5μmol/L dTTP，14μmol/L d dTTP，40mmol/L TrisHCl(pH7.6)，50mmol/LNaCl。
(11)终止液：溴酚蓝和二甲苯腈蓝FF各3%，l0mmol/L EDTA(pH7.5)，97.5%去离子甲酰胺。
(12)标记脱氧核苷酸：[α-32P]dATP，10mci/m1，3000ci/mmol。
说明：除试剂12购自Amersham公司外，其余上述试剂均包括在Pharmacia Biotech公司的T7SequencingTMKit试剂盒内。
(13)显影剂(14)定影剂2．器材恒温加热器或恒温水浴槽；涡旋振荡器；台式高速离心机；恒功率电泳仪；测序用电泳槽(附玻板及隔离条)盖革计数器；可调式加样器；微量离心管(Eppendorf管)；胶带；剪刀；手术刀；烧杯(100ml)；梨形瓶(100ml)；水泵；注射器(50ml)；注射器针头(18号)；新华滤纸(3号)或Whatman 滤纸(1号)；保鲜膜；凝胶干燥器材；抽气泵；增感屏；X光胶片；显影及定影用具。
